Kan Gruplarının Saptanması - Kan Merkezleri ve Transfüzyon Derneği

KAN GRUPLARININ
SAPTANMASI
Dr . Güçhan ALANOĞLU
Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi
Hematoloji Bilim Dalı
Kan Bankası
Isparta
YÖNTEMLER
1. HEMAGLÜTİNASYON
a. Lam (Slide) Yöntemi
b. Tüp Yöntemi
c. Jel Santrifügasyon Yöntemi
d. Mikroplak Yöntemi
2. RIA
3. EIA
4. PCR
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
2
Hemaglütinasyon
Elektrolitli ortamda eritrosit yüzeyindeki
antijenlerin ortamda bulunan kendilerine
özgü antikorlarla birleşmeleri sonucunda
eritrositlerin
birbirine
yapışarak
gözle
görülebilecek büyüklükte kümeler oluşturup
çökmesine hemaglütinasyon denir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
3
Hemaglütinasyonun Oluşumu
Antikorların eritrositlere tutunması
Antikorlarla kaplı eritrositlerin birbirine tutunması
Sedimentasyon
(Santrifügasyonla hızlandırılabilir)
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
4
Hemaglütinasyon Sonuçlarına
Etki Eden Faktörler
1.
Fiziksel Koşullar
2.
Eritrositler
3.
4.
Zeta Potansiyel
Serum
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
5
Fiziksel Koşullar
1. İnkübasyon ısısı:
IgM tipi antikorlar.........4-27°C (soğuk)
IgG tipi antikorlar.........30-37°C (sıcak)
2. İnkübasyon süresi
3. Santrifüj
4. Ortam
pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
6
Eritrositler
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Eritrositlerin yüzey antijenlerinin tipi
Antijenin Sayısı
Lokalizasyonu ve immünojenitesi
Homozigot veya Heterozigot olmaları
(Homozigot : EE, cc vs Heterozigot : Ee, Cc
vs.)
Homozigot eritrositlerde antijen bağlanma
bölgeleri daha fazla ve oluşan agglütinasyon
daha kuvvetlidir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
7
Zeta Potansiyel
1.
2.
Serum fizyolojik içerisinde süspansiyon
yapılan eritrositler birbirlerine ortalama 25 nm
uzaklıkta dururlar
Süspansiyon yapıldıklarında katyonlar (+yüklü
sodyum iyonu) eritrosit yüzeyini kaplar. Zeta
potansiyel eritrosit yüzeyindeki negatif yük ile
onu kuşatan katyonların oluşturduğu
potansiyel farkını gösterir
Zeta potansiyelin optimal düzeyi
n
n
IgM için - 22 - 17 mV
IgG için ise - 11 - 4.5 mV
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
8
Kompleman Sistemi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
20’den fazla proteinden oluşur; hümoral
bağışıklık ve iltihabın oluşmasında rol oynar
Bakteri ve Hücre lizisi
Fagositozda görevli (opsonizasyon)
Kemotaktik etki gösterir
İmmün kompleksin kandan temizlenmesine
yardımcı
İki şekilde aktive olur
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
9
Hemaglütinasyonu
Kolaylaştıran Faktörler
Eritrositler arası uzaklığı kısaltma
1.
2.
3.
4.
5.
Proteolitik enzimler (Papain, bromelin, ficin vs)
Albumin
Polikatyonlar (Polybrene, protamine)
LISS (Low Ionic Strength Solution)
Santrifuj
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
10
Hemaglütinasyonu
Kolaylaştıran Faktörler
İki eritrosit arasında
köprü oluşturma
Coombs serumu
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
11
Aglutinasyon yok
Aglutinasyon
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
12
Eritrosit
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
13
DEĞERLENDİRME-I
Aglütinasyon
Değerlendirme
++++
Bir tek aglütinat, serbest hücre yok
+++
Birkaç büyük aglütinat, serbest hücre yok
++
Çok sayıda büyük ve küçük küme, serbest
hücre yok
+
Çok sayıda küçük küme, zeminde serbest
hücre var
Mikroaglütinasyon makroskobik olarak negatif, bazı alanlarda
mikroskobik 6-8 hücreli küme
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
14
DEĞERLENDİRME-II
Aglütinasyon
Değerlendirme
Şüpheli
Makroskobik olarak negatif, çok nadir
mikroskobik 6-8 hücreli küme
Rulo Oluşumu
Mikroskobik olarak kümeler para dizisi şeklinde
Negatif
Makroskobik ve mikroskobik küme yok
Mixed field
Çok sayıda büyük ve küçük küme, zeminde
serbest eritrosit var
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
15
Eritrosit Süspansiyonu Hazırlama:
Yıkama yapılmaması durumunda
1.
Fibrinojen ve serumdaki artık trombin
2.
Rulo formasyonu oluşma olasılığı
3.
Antikomplementer antikoagulanlar
4.
Laktoz, neomisin gibi koruyucu maddeler
5.
6.
ABO, Lewis, Chido/Rodgers, Ii antijenlerinin
plazmada bulunuşu
Plazma, albumin otoaglütininleri içerebilir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
16
Saklama Koşulları ve
Antijenler
1.
M ve P1 antijenleri dışında aktivite kaybı minimaldir
2.
Pıhtılaşmış
olarak
saklanan
kan
örneklerinde
antikoagulanlı kanlara göre antijenik aktivite kaybı
daha hızlıdır
3.
Eritrositler Sitrat Fosfat Gliserol solüsyonunda
–200C’de bir yıl saklanabilir, sadece P1 antijeni
zayıf reaktif bulunur
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
17
Serum veya Plazma Kullanımı
Kan gruplama testlerinde serum tercih edilmelidir
Plazma Kullanmanın Sakıncaları :
* 370C’de inkübe edildiğinde pıhtılaşabilir
* Sitrat ve EDTA gibi antikoagulanlar
kompleman
aktivasyonunu engeller.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
18
Antiserumların Saklanması
•
+40C’de 1-2 yıl, -200C’de yıllarca saklanabilirler
•
Koruyucu olarak sodyum azid, antibiyotikler kullanılabilir
•
Anti-A ve Anti-B’ye genellikle belirleyici olarak boya
eklenir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
19
ABO (ABH) Sistemi
*Transfüzyon ve doku
transplantasyonunun
en önemli antijen sistemidir.
*Reverse gruplamanın yapılabildiği tek
kan grup sistemidir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
20
Eritrosit
hücre tipi
Antikor
Antijen
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
21
Eritrositler
Serum
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
22
Lam Yöntemi
A pos
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
23
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
24
Lam (Slide) Yöntemi-I
ABO Forward Gruplama-I
Temiz ve etiketli (anti-A yazılmış) bir lama bir damla
anti-A damlatılır
İkinci temiz ve etiketli (anti-B yazılmış) bir lama bir
damla anti-B damlatılır
Bu antiserumlara paralel test yapılacaksa üçüncü bir
temiz ve etiketli (anti-A,B yazılmış) bir lama bir damla
anti-A,B damlatılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
25
Lam (Slide) Yöntemi-II
ABO Forward Gruplama-II
Tercihen dördüncü bir temiz ve etiketli (kontrol yazılmış)
lam da ayrıca hazırlanır. Bu lama bir damla hasta
serumu veya plazması damlatılır
Lamlara test edilecek eritrositlerin iyice karıştırılmış birer
damla süspansiyonu damlatılır
Kullanılacak doğru konsantrasyonu belirlemek
için üretici önerilerine bakılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
26
Lam (Slide) Yöntemi-III
ABO Forward Gruplama-III
Antiserum ve eritrositler her bir lam için ayrı, temiz bir
aplikatör çubuk ile karıştırılır ve çubuk atılır
Lamlar sürekli olarak hafifçe öne-arkaya hareketle 2
dakika kadar sallanır
Tüm lamlardaki sonuçlar okunur, yorumlanır ve
kaydedilir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
27
Lam (Slide) Yöntemi-IV
1
2
3
Yorum-I
Herhangi bir ABO gruplama ajanıyla
(antiserumuyla) güçlü eritrosit aglütinasyonu
sonucun pozitif olduğu anlamına gelir
İki dakika sonunda pürüzsüz eritrosit
süspansiyonu negatif sonuçtur
Zayıf ya da şüpheli reaksiyon veren örnekler tüp
testi ile tekrar edilmelidir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
28
Lam (Slide) Yöntemi-V
4
5
Yorum-II
Kontrol lamında aglütinasyon görülmesi nonspesifik bir
aglütinasyon olarak değerlendirilir ve otoantikorların
varlığını gösterir
Değerlendirme tabloya göre yapılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
29
Forward Gruplamada Değerlendirme
Kan Grubu
Anti-A
Anti-B
Anti A,B
A
+
-
+
B
-
+
+
AB
+
+
+
O
-
-
-
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
30
İsim soyad
Çalışan personel
Tarih
Tarih
A pozitif
İmza
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
31
Lam (Slide) Yöntemi-VI
Teknik uyarılar-I
1
2
Bu yöntem, seramik veya porselen fayans
üzerinde asla denenmemelidir
Zayıf veya negatif reaksiyon veren tüm antiserumeritrosit karışımları mikroskobik olarak da kontrol
edilmelidir .
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
32
Lam (Slide) Yöntemi-VII
Teknik uyarılar-II
3
4
5
Negatif sonuçlar tüp testi ya da mümkünse başka bir
yöntemle ( jel santrifügasyon, mikroplak vs )
doğrulanmalıdır
Temiz lamların üzerine önce antiserumlar
damlatılmalıdır
Karıştırıcı çubuklar için cam bagetler tavsiye edilmez
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
33
Lam (Slide) Yöntemi-VIII
Teknik uyarılar-III
6
7
8
Lamların üzerinde oluşabilecek hafif kuruma zayıf
pozitif aglütinasyon olarak değerlendirilmemelidir
Sonuçların değerlendirilmesi ikinci bir laboratuar
uygulayıcısı tarafından da yapılmalıdır
Her şeye rağmen ABO grupları tayininde lam
testleriyle her zaman doğru sonuçlar alınamaz
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
34
Tüp Yöntemi
1 Hasta serumu
2 Tarama RBC
3 Lıss
4 İnkübasyon
5 Santrifüj
6 Yıkama
7 AHG eklenir
8 Santrifüj
9 Coombs kontrol hücresi ekle
10 Santrifüj
11 Değerlendirme
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
35
TÜP YÖNTEMİ-I
ABO FORWARD GRUPLAMA-I
1
Temiz ve etiketli (anti-A yazılmış) bir test tüpüne bir
damla anti-A damlatılır.
2
İkinci bir temiz ve etiketli (anti-B yazılmış) tüpe bir
damla anti-B damlatılır.
3
Bu antiserumlara paralel test yapılacaksa üçüncü
temiz ve etiketli (anti-A,B yazılmış) bir tüpe bir
damla anti-A,B damlatılır.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
36
TÜP YÖNTEMİ-II
ABO FORWARD GRUPLAMA-II
4
Dördüncü temiz ve etiketli (kontrol yazılmış) bir tüpe
bir damla hasta yada donör serumu veya plazması
damlatılır.
5
Her bir tüpe bir damla test edilecek eritrositlerin en
az 3 kez yıkanmış %2-5’lik süspansiyonundan
damlatılır.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
37
TÜP YÖNTEMİ-III
ABO FORWARD GRUPLAMA-III
6
Tüp içerikleri yavaşça karıştırılır ve yaklaşık
900-1000 x g’de 15-30 sn. süreyle santrifüj
edilir. Alternatif olarak tüpler santrifüj
edilmeden 1 saat oda ısısında bırakılır.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
38
TÜP YÖNTEMİ-IV
ABO FORWARD GRUPLAMA-IV
7
Tüplerin dibindeki eritrosit birikintileri tekrar yavaşça
süspanse edilir ve makroskobik olarak aglütinasyon
açısından incelenir.
8
Test sonuçları okunur, yorumlanır ve kaydedilir.
Eritrosit test sonuçları ABO reverse gruplama
prensibi ile karşılaştırarak doğrulanır.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
39
TÜP YÖNTEMİ-V
YORUM-I
1 Test tüplerinin herhangi birindeki aglütinasyon
sonucun pozitif olduğu anlamına gelir.
2
Bir eritrosit birikintisinin yeniden süspanse
edilmesinden sonra süspansiyonun pürüzsüz olması
negatif test sonucudur.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
40
TÜP YÖNTEMİ-VI
YORUM-II
3
Kontrol tüpünde aglütinasyon görülmesi nonspesifik bir aglütinasyon olarak değerlendirilir
ve otoantikorların varlığını gösterir
4
Değerlendirme tabloya göre yapılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
41
TÜP YÖNTEMİ-VII
Teknik Uyarılar-I
1
Zayıf veya negatif reaksiyon veren tüm
antiserum-eritrosit karışımları mikroskobik olarak
kontrol edilmelidir
2
Anti-A ve Anti-AB’de aglütinasyon şiddeti zayıf
(+, ++) ise A subgrupları araştırılmalıdır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
42
TÜP YÖNTEMİ-VIII
Teknik Uyarılar-II
3
4
Temiz tüplerin üzerine ilk önce antiserumlar
damlatılmalıdır.
Sonuçların değerlendirilmesi ikinci bir laboratuar
uygulayıcısı tarafından da yapılmalıdır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
43
TÜP YÖNTEMİ-IX
REVERSE GRUPLAMA-I
1.Test tüplerinin üzerine sırası ile A1 , A2 , B , O
yazılarak etiketlenir.
2.
Her tüpe 2-3 damla hasta serumu damlatılır
3.
A1 etiketli tüpe bir damla A1 eritrosit
süspansiyonu,
A2 etiketli tüpe bir damla A2 eritrosit süspansiyonu,
B etiketli tüpe bir damla B eritrosit süspansiyonu,
O etiketli tüpe bir damla O eritrosit süspansiyonu
damlatılır .
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
44
TÜP YÖNTEMİ-X
REVERSE GRUPLAMA-II
4.
5
Tüp içerikleri yavaşça karıştırılır ve yaklaşık 9001000 x g’de 15-30 sn. süreyle santrifüj edilir.
Tüpler hemoliz bulgusu açısından incelenir.
Eritrosit birikintileri tekrar yavaşça süspanse edilir
ve aglütinasyon açısından incelenir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
45
TÜP YÖNTEMİ-XI
REVERSE GRUPLAMA-III
6. Test sonuçları okunur, yorumlanır ve kaydedilir.
Serum test sonuçları ABO forward gruplama ile
saptananlarla karşılaştırarak doğrulanır
7.
Zayıf serum reaksiyonlarını güçlendirmek için
tüpler 5-15 dk. boyunca oda ısısında inkübe edilir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
46
TÜP YÖNTEMİ-XII
YORUM
1
2
3
4
Aglütinasyon sonucun pozitif olduğu anlamına gelir
Pozitif testlerde beklenen reaksiyonlar +3 ile +4’tür.
Zayıf reaksiyon veren örnekler adsorbsiyon ve
elüsyon ile doğrulanır.
Yeniden süspanse edilen süspansiyonun pürüzsüz
olması negatif test sonucudur.
Değerlendirme tabloya göre yapılır.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
47
Reverse Gruplamada Değerlendirme
Kan Grubu
Serumdaki
Antikorlar
Bilinen Eritrosit Süspansiyonları
A
B
O
A
Anti-B
-
+
-
B
Anti-A
+
-
-
AB
-
-
-
-
O
Anti-A, Anti-B
+
+
-
+
+
+
Oh (Bombay) Anti-A, Anti-B,
Anti-H
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
48
TÜP YÖNTEMİ-XIII
TEKNİK UYARILAR-I
1
2
Santrifüj yapılmadan değerlendirildiğinde zayıf
aglütinasyon oluşur. Bu yüzden reverse gruplama
sadece tüp, jel santrifügasyon, mikroplak
serolojik yöntemleri ile yapılabilir. Lam yöntemi
ile yapılamaz
Zayıf (+, ++) veya negatif reaksiyon veren tüm
tüp karışımları mikroskobik olarak kontrol
edilmelidir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
49
TÜP YÖNTEMİ-XIV
TEKNİK UYARILAR-II
3
Eğer anti-A ve anti-B antikorları serumda çok az
miktarlarda ise reverse gruplama ile ortaya
koymak güç ya da olanaksız olabilir.
4
Hastanın kanında A ve B grup antijenleri dışında
başka antijenlerle reaksiyon veren atipik
antikorlar varsa grup saptanması güçlük
gösterebilir.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
50
Tüp Yöntemi √
1.
2.
3.
4.
5.
Güvenilir bir yöntem
Fiziksel koşullar ve eleman ihtiyacı
Zaman
Enfeksiyon riski
Ucuz
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
GA 2007
51
FENOTİP
A1*
Aınt**
A2***
A3
Am
Ax
Ae1
B
B3
Bm
Bx
AB
A2B+4
O
Oh(Bom.)
FORWARD GRUPLAMA
(ABO/Rh)
Anti-A Anti-B
Anti-AB
+4
+4
+4
+4
+4
+4
+2
+2mf
-/+
-/+
-/+2
+/+2
+4
+4
+2mf
+1mf
-/+
-/+
-/+2
+4
+4
+4
+4
+4
-
Anti-H
-/±
+3/+2
+2
+3
+4
+4
+4
+3
+4
+4
+4
-
Anti-A1 A1
+3
+3/+2
-/+
?
+2
+2
+4
+4
+4
+4
+3
?
+4
+4
REVERSE GRUPLAMA
(cell A1, A2, B, O)
A2
B
O
+4
+4
+4
+4
+4
-/+
+4
+4
+4
+4
+4
+4
+4
+4
+4
+4
+4
*
Anti-A1 pozitifliği daima anti-H pozitifliğinden daha kuvvetlidir.
** Anti-A1 ve anti-H’da reaksiyon şiddeti aynıdır.
*** Anti-H pozitifliği daima anti-A1 pozitifliğinden daha kuvvetlidir.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
52
Jel Yöntemi
1986
Molekül çapına göre tutulma prensibi
1 Uygun kartlara numune eklenir
2 İnkübasyon
3 Santrifüj
4 Değerlendirme
Çift populasyon gösterilebilir
Jel sadece aglütine olmayan eritrositlerin geçişine izin verir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
53
O Pos
A Neg
Ce poz , cE, Kell neg
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
54
Jel Teknolojisinin Avantajları√
§
Laboratuar tekniklerinin standardizasyonu
§
Kolay ve çabuk prosedürler
§
Kolay ve çabuk yorumlama
§
Yıkama işlemine gerek duyulmaması
§
Sonuçların ertesi gün bile kontrol edilebilirliği
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
55
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
56
Mikroplak Yöntemi
1.
2.
3.
Duyarlılığı yüksek
Ekonomik
Büyük kan merkezleri için uygun
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
57
Forward Gruplamada
Uyumsuzluk
1.
2.
Yakın dönemde transfüzyon veya kemik iliği
transplantasyonu yapılanlarda iki farklı
eritrosit popülasyonuna bağlı chimera
Varyant A ve B genleri taşıyan kişilerde zayıf
antijenlerin
varlığı.
Lösemi
gibi
bazı
hastalıklarda eritrosit yüzey antijenlerinde
zayıflama
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
58
Forward Gruplamada
Uyumsuzluk
3. Kalıtsal yada kazanılmış poliaglütinasyonda
membran
bozukluğuna
bağlı
gelişen
modifiye eritrositlerin anti-A, anti-B veya her
ikisi ile birlikte aglütine olması
4. Anormal konsantrasyondaki serum proteinleri
veya makromoleküller nedeni ile oluşan
nonspesifik agregasyonun aglütinasyonu
taklit etmesi
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
59
Forward Gruplamada
Uyumsuzluk
5. Serumlarında yüksek konsantrasyonda A ve B
antijenleri bulunan kişilerde bu antijenlerin
antiserumdaki (reagent) antikorları nötralize
etmesi
6.
Antiserumlardaki boyalara karşı gelişmiş
antikorların neden olduğu hatalı pozitiflikler
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
60
Reverse Gruplamada
Uyumsuzluk
1. Tam pıhtılaşmamış serum veya plazmada
bulunan küçük fibrin parçacıklarının
aglütinasyon sanılması
2. Anormal konsantrasyondaki proteinlerin veya
intravenöz kontrast maddelerin neden olduğu
nonspesifik agregasyon
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
61
Reverse Gruplamada
Uyumsuzluk
3. Diğer eritrosit antijenlerine karşı gelişmiş antikorların
test hücreleri bu antijeni taşıyorsa pozitif sonuç
vermesi
4. Yenidoğan döneminde ilk 4-6 ay, yaşlılar ve immün
sistemi baskılanmış kişilerde düşük immünglobulin
düzeyinin hatalı negatif sonuçlara neden olması
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
62
Rh Antijenleri
Rh Antijenleri
D
C
E
c
e
f (ce)
Ce
Cw
Sıklık (%)
85
70
30
80
97
64
69
2
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
63
D Antijeni
1.
A ve B antijenlerinden sonra en yüksek
antijeniteye sahiptir
2.
En kompleks eritrosit antijenlerindendir
3.
Rh sisteminde en güçlü antijen olduğundan Rh
tiplendirmesinde rutinde sadece anti-D çalışılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
64
Diğer Rh Antijenleri
1.
Bilinmeyen Rh antikorlarının tanımlanması
2.
Rh antikorları taşıdığı bilinen alıcılara transfüzyon yapılması
3.
Babalık tayini ve diğer aile çalışmaları
4.
Çeşitli test panelleri için eritrosit hazırlanması sırasında
kullanılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
65
Anti-D Antiserumları
1.
2.
Yüksek Proteinli Antiserumlar
Düşük Proteinli Antiserumlar
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
66
Yüksek Proteinli
Antiserumlar
1.
2.
3.
4.
5.
Yüksek yoğunlukta protein ve makromolekül
içerirler
Lam, tüp, mikroplak tekniklerinde kullanılırlar
Kontrol reagenti her üretici firma için farklıdır
Eritrosit süspansiyonları SF, serum veya
plazma ile hazırlanabilir
Rutinde en sık kullanılan antiserumlardır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
67
Düşük Proteinli Antiserumlar
Üç farklı türü vardır :
a. Geleneksel SF reaktif tüp testi antiserumu:
IgM
b. Monoklonal IgM antiserumları: IgM ve
poliklonal IgG
c. Kimyasal olarak modifiye edilmiş poliklonal
IgG: Tüm rutin çalışmalarda veya kontrol testi
pozitif örneklerde kullanılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
68
Rh Tayininde Lam
Yöntemi-I
1
2
3
Temiz, işaretlenmiş bir lamın üzerine bir damla
anti-D damlatılır
İkinci bir lama uygun kontrol solüsyonundan bir
damla damlatılır
Her bir lama iyi karıştırılmış %40-50’lik test
edilecek eritrosit süspansiyonundan birer damla
damlatılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
69
Rh Tayininde Lam
Yöntemi-II
4
5
Temiz bir aplikatör çubuk kullanarak iyice
karıştırılır ve reaksiyon karışımı her lamda
yaklaşık 20x40 mm’lik bir alana yayılır
Lamlar görüntü kutusuna konur, yavaşça sallanır
ve aglitünasyon açısından sürekli olarak gözlenir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
70
Rh Tayininde Lam Yöntemi-III
6
7
8
Test 2 dakika içinde okunmalıdır
Eğer Rh görüntüleme kutusu temin edilememiş
ise ısıtılmış (el sırtını yakmayacak ısıya kadar)
lamlar kullanılabilir
Her iki lamdaki reaksiyon sonuçları okunur ve
yorumlanır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
71
Rh Tayininde Lam Yöntemi-IV
Yorum
1. Anti-D ile aglitünasyon ve kontrol lamında
pürüzsüz süspansiyon pozitiftir ve test
edilen eritrositlerin D+ olduğunu gösterir
2.
Anti-D ve Rh kontrolünde aglütinasyon
olmaması eritrositlerin D - olduğunu
düşündürür. Eğer eritrositler lam
testlerinde D– olarak bulunuyor ise
antiglobülin test prosedürüyle zayıf bir D
(Du) antijeni taşıdığı gösterilebilir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
72
Rh Tayininde Tüp Yöntemi-I
1
2
3
Temiz, işaretlenmiş bir test tüpünün içine bir damla
anti-D serumu damlatılır
İşaretlenmiş (kontrol yazılmış) ikinci bir tüpün içine
uygun kontrol ajanından bir damla damlatılır
Her tüpe test edilecek %2-5’lik eritrosit
süspansiyonundan (SF, serum veya plazma içindeki)
birer damla damlatılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
73
Rh Tayininde Tüp Yöntemi-II
4
5
Nazikçe karıştırılır ve üreticinin önerdiği hız ve
zamanda santrifüj edilir
Eritrosit birikintisi nazikçe kaldırılır ve aglütinasyon
açısından kontrol edilir
(Eritrositleri transfer etmek için çubuk kullanılmışsa, eritrosit
birikintisi kaldırılmadan önce her tüpe 1 damla SF ilave etmek,
resüspansiyona yardımcı olacak daha fazla sıvı sağlayacaktır)
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
74
Rh Tayininde Tüp Yöntemi-III
6
Reaksiyonlar derecelendirilir ve test ile kontrol
sonuçları kaydedilir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
75
Rh Tayininde Tüp Yöntemi-IV
YORUM
1
Anti-D tüpündeki aglütinasyon > 2+ ve kontrol tüpü
nonreaktif ise geçerli bir test oluşturur ve test edilen
eritrositlerin D+ olduğunu gösterir
2
Kontrol tüpünde aglütinasyon varsa veya anti-D tüpündeki
aglütinasyon < 2+ ise, daha ileri testler olmaksızın Rh tipi
pozitif olarak değerlendirilmemelidir
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
76
Rh Tayininde Tüp Yöntemi-V
YORUM
Hem anti-D hem de kontrol tüplerindeki düz bir
eritrosit süspansiyonu negatif test sonucudur.
Hastaların grubu D negatif olarak gözükse de,
donör kanı olduğunda mutlaka D antijenin zayıf
formları için zayıf D (Du) testine tabi tutulmalıdır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
77
n
n
n
n
n
n
n
Zayıf D (Du)
Normalden daha az D antijeni mevcuttur
ancak yapısı normaldir.
Antikor geliştirmesi beklenmez
Varyant=Parsiyel D=Kısmi D
Epitoplarda eksiklik mevcuttur.
Protein yapı normal değildir.
Eksik olan epitopa karşı antikor geliştirebilir.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
78
Zayıf D Testi (Du Testi)-I
1. Her Anti-D antiserumu zayıf D testi için uygun değildir
Yüksek proteinli poliklonal antiserumlar
Kimyasal olarak modifiye edilmiş düşük proteinli
poliklonal antiserumlar
Harmanlanmış IgM/IgG monoklonal/poliklonal
düşük proteinli antiserumlar kullanılabilir
2. Du testi mutlaka tüp testi ile çalışılmalıdır. Çünkü lam
yöntemi ile Du testi yapılamaz
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
79
Zayıf D Testi (Du Testi)-II
1
2
3
Temiz, işaretlenmiş bir test tüpüne bir damla anti-D
serumu damlatılır
İşaretlenmiş (kontrol yazılmış) ikinci bir tüpe uygun
kontrol ajanından bir damla damlatılır
Her tüpe test edilecek %2-5’lik eritrosit
süspansiyonundan (SF, serum veya plazma içindeki)
birer damla damlatılır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
80
Zayıf D Testi (Du Testi)-III
4
Tüpler karıştırılır, 37ºC’de 15-30 dk bekletilir.
5
900-1000 x g de, 15-45 saniye santrifüj edilir.
6
Nazikçe çalkalanarak aglütinasyon olup
olmadığına bakılır. Eğer, anti-D ile test
hücrelerinde güçlü bir aglütinasyon varsa ve bu
durum kontrolde yoksa, test örneği D+ olarak
kaydedilir. Testin antiglobulin fazına geçmeye
gerek yoktur.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
81
Zayıf D Testi (Du Testi)-IV
1.
Test edilen eritrositlerde aglütinasyon yok
veya şüpheli bir aglütinasyon varsa
eritrositler çok miktarda SF ile 3-4 kez yıkanır.
2.
Son yıkamadan sonra SF tamamen dökülür
ve tüpün ağız kenarları kurulanır.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
82
Zayıf D Testi (Du Testi)-V
1.
Üreticinin direktifleri doğrultusunda 1-2 damla antiIgG damlatılır.
2.
Nazikçe karıştırılır ve 900-1000 x g de, 15-30 saniye
santrifüj edilir.
3.
Her eritrosit birikintisi nazikçe kaldırılır, aglütinasyon
olup olmadığına bakılır, test sonucu derecelendirilir
ve kaydedilir.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
83
Zayıf D Testi (Du Testi)-VI
YORUM
1
Zayıf D testi prosedürüne mutlaka bir diluent
kontrol testi veya direkt antiglobulin testi eşlik
etmelidir.
2 Anti-D tüpünde aglütinasyon varken kontrol
tüpünde olmaması testin pozitif olduğunu
gösterir. Kan D + olarak sınıflandırılmalıdır. Bu
tür eritrositleri “D -, Du +” olarak rapor etmek
doğru değildir.
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
84
Zayıf D Testi (Du Testi)-VII
3
4
Anti-D testinde aglütinasyon olmamışsa sonuç
negatiftir. Bu, eritrositlerde D aktivitesi yok
demektir ve D (– ) neg olarak sınıflandırılır
Kontrol testi pozitif ise, zayıf D testi için geçerli
bir yorum yapılamaz. Bu durumda, eğer test
edilen eritrositler hastaya ait ise Rh (- )kan
verilmelidir; eğer donöre ait ise eritrositler
transfüzyon için kullanılmamalıdır
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
85
Sorular-I
1- Zayıf veya varyant D antijeni, Rh negatif bir
kişide antikor yanıtı oluşturabilir mi?
2- Zayıf veya varyant D antijeni taşıyan fetus
anneyi immünize edebilir mi?
3- Varyant D antijeni taşıyan bir alıcıya Rh
pozitif kan verilirse antikor yanıtı oluşur mu?
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
86
Sorular-II
4- Varyant D antijeni taşıyan anneyi Rh
pozitif fetus immünize edebilir mi?
5- Zayıf D antijeni taşıyan alıcıya Rh pozitif
kan verilirse antikor yanıtı oluşur mu?
6- Zayıf D antijeni taşıyan anneyi, Rh
pozitif fetus immünize edebilir mi?
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Tıbbı Kursu
87
Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon
Eğirdir
Gölü
Tıbbı
KursuIsparta
88