Oktakalsiyum Fosfat

Brushite (CaHPO4⋅2H2O)-Oktakalsiyum Fosfat
(Ca8(HPO4)2(PO4)4⋅5H2O) Dönüşümünü Sağlayan
Biyomineralizasyon Çözeltilerinin Geliştirilmesi
Development of Biomineralization Solutions to Facilitate the
Transformation of Brushite (CaHPO4⋅2H2O) into Octacalcium
Phosphate (Ca8(HPO4)2(PO4)4⋅5H2O)
Giray Girişken ve A. Cüneyt Taş
Biyomedikal Mühendisliği Bölümü,
Yeditepe Üniversitesi, Istanbul
[email protected]
Özetçe
Brushite (DCPD, CaHPO4⋅2H2O, dikalsiyum fosfat dihidrat)
ve oktakalsiyum fosfat (OCP, Ca8(HPO4)2(PO4)4⋅5H2O) sert
kemik dokularının omurgalı organizmalarda oluşmaya
başladığı ilk anlarda sırasıyla kristalize olan ve sonra kısa bir
süre içinde kemik minerali olarak bilinen kalsiyum-eksikli
hidroksiapatit’e
(KEHA,
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x)
dönüşen iki önemli biyomineralizasyon fazıdır. Kemik defekt
ve boşluklarının cerrahi yöntemlerle tedavisinde bu iki fazdan
yararlanılması ve bunların üretim yöntemlerinin geliştirilmesi
son yıllardaki pek çok araştırmanın konusu olmaya
başlamıştır. DCPD’nin üretimi oldukça kolay ve yinelenebilir
olmasına rağmen, OCP’nin üretimi için aynı şey söylenemez.
Bu çalışmada, DCPD’yi başlangıç malzemesi olarak kullanan
ve bunları OCP’ye ekonomik biçimde dönüştürebilecek
biyomineralizasyon çözeltileri geliştirilmiştir. Burada bu
çözeltilerin hazırlanışı açıklanmakta ve oluşan fazların X-ışını
kırınımı ve infrared spektroskopisi verileri irdelenmektedir.
Abstract
Brushite (DCPD, CaHPO4⋅2H2O, dicalcium phosphate
dihydrate)
and
octacalcium
phosphate
(OCP,
are
two
important
Ca8(HPO4)2(PO4)4⋅5H2O)
biomineralization phases of the musculoskeletal system of
living vertebrates which respectively crystallize in the very
first instants of hard tissue formation accompanied by
calcification, and then transform into the so-called bone
mineral named as calcium-deficient hydroxyapatite (CDHA,
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x). The utilization of these two
phases in the surgical treatment of bone defects and voids has
lately been the focus of interest of a significant number of
research projects. Although the synthesis of DCPD is quite
easy and reproducible, the same cannot be said for that of
OCP. Biomineralization solutions which use DCPD as the
starting material and can allow the economical
transformation of DCPD into OCP have been developed in
this study. This paper explains the preparation conditions of
these solutions and elucidates the X-ray diffraction and
infrared spectroscopy data of the phases formed.
1. Giriş
Bu çalışma, çok kısa bir zaman önce laboratuvarlarımızda
tamamlanmış ve yayınlanmış olan öncül bir çalışmanın
doğrudan devamı niteliğindedir [1]. Önceki çalışmamız,
laboratuvarlarımızda ürettiğimiz DCPD (Brushite, dikalsiyum
fosfat dihidrat, CaHPO4⋅2H2O) tozlarının, in vitro hücre
kültürü çalışmalarının vazgeçilmez çözeltilerinden birisi olan
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) çözeltileri
içinde 24 saat ile bir hafta arası süreler boyunca, insan vücut
sıcaklığı olan 36.5°C’de cam şişeler içinde tutulması ile OCP
fazına (oktakalsiyum fosfat, Ca8(HPO4)2(PO4)4⋅5H2O)
dönüştüklerini, ilk kez olmak üzere, kanıtlamıştı. Önceki
çalışmamızda kullanılan DMEM çözeltileri bunların
dünyadaki en önemli üreticisi olan Invitrogen firmasından
ithal edilmişti. Burada sunulan çalışmamızın başlangıç amacı
ise, ticari DMEM çözeltilerinin bu DCPD-OCP dönüşümü
için mutlaka gerekli olup olmadığı, bunun benzeri ve
kendimizin hazırlayacağı çözeltiler içinde de aynı sonucun
alınıp alınamayacağını sınamaktı. Önceki çalışmamızda
kullandığımız DMEM çözeltilerinin ayrıntılı kompozisyonu
ve bileşenleri daha önce sunulmuştur [1]. Varolan DMEM
çözeltileri amino asitler, çeşitli vitaminler, glukoz, anorganik
tuzlar ve Hepes içermektedir. DMEM çözeltilerinde varolan
anorganik tuzlar ve onların miktarları da insan kan plazmasını
andırmaya yönelik nitelikte olup, çözeltilerin Ca/P molar
oranı 1.99 ve HCO3 derişimleri de 44 mM civarındadır.
Bu çalışmada [2] öncelikle DMEM çözeltileri içindeki amino
asitler, vitaminler ve glukozun varlığının DCPD-OCP
dönüşümü için gerekli olup olmadığı, daha sonra da Hepes’in
ve bazı tuzların bu hidrotermal dönüşüm için gerekip
gerekmediği sorgulanmıştır. DMEM-benzeri çözeltilerin nasıl
bir tepkimeye neden olduğunu anlamamıza yarayacak
deneysel sonuçlar burada elde edilmiş ve DMEM
çözeltilerinden çok çok daha basit çözeltilerin dahi DCPDOCP dönüşümüne aynı koşullar altında izin verdiği,
literatürde ilk kez olmak üzere, gösterilmiştir. Bu kapsamda
geliştirilen yeni biyomineralizasyon çözeltilerinin OCP gibi
önemli bir kalsifikasyon fazının üretimini daha da
kolaylaştıracağı ve OCP’nin üretiminin daha büyük
boyutlarda gerçekleştirilebilmesini olası kılacağı görülmüştür.
2. Deneysel Yöntem
Bu çalışmada aşağıdaki başlangıç kimyasalları kullanılmıştır;
sodyum dihidrojen fosfat dihidrat, NaH2PO4⋅2H2O (>99%,
Katalog No: 1.06342, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya),
kalsiyum klorür dihidrat, CaCl2⋅2H2O (>99%, Katalog No.
1.02382, Merck KGaA), sodyum hidrojen karbonat, NaHCO3
(>99%, Katalog No: 1.06329, Merck KGaA), sodyum klorür,
NaCl (>99%, Katalog No: 1.06404, Merck KGaA), potasyum
klorür, KCl (>99%, Katalog No: 1210517, Labkim, İstanbul),
magnezyum klorür hexahidrat, MgCl2⋅6H2O (>99%, Katalog
No. 459331, Carlo-Erba, İtalya), Hepes, (4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazine ethanesulfonic acid), C8H18N2O4S (>99%,
Katalog No. 1.10110, Merck KGaA) ve jelatin (>99%,
Katalog No. 1.04078, Merck KGaA). Geliştirilen çözeltilerin
hazırlanması için iki kez damıtılmış su kullanılmıştır.
Geliştirilen altı ayrı çözeltinin kompozisyonları aşağıda,
Tablo-1’de sunulmaktadır. Çözeltiler bir litre bazında saf su
ile hazırlanırken yalnızca yukarıda anılan kimyasallar
kullanılmıştır.
Tablo-1: Hazırlanan çözeltilerin kompozisyonları (g / L)
GG-1
GG-2
GG-3
GG-4
GG-5
GG-6
Ca-klorür
0.265
0.265
0.265
0.265
0.265
0.265
Mg-klorü.
0.166
0.166
0.166
--
0.166
--
KCl
0.397
0.397
0.397
0.397
0.397
0.397
NaHCO3
3.700
3.700
3.700
3.700
--
--
NaCl
4.787
4.787
4.787
4.787
4.787
4.787
Na-fosfat
0.141
0.141
0.141
0.141
0.141
0.141
Hepes
5.958
5.958
--
--
--
--
Jelatin
3.000
--
--
--
--
--
Bu tablodan da anlaşılacağı üzere, GG-1 çözeltisinde, DMEM
çözeltileri içindeki amino asitlerin varlığının jelatin ile simüle
edilip edilmeyecekleri denendiği, GG-2 çözeltisinde amino
asitlerin tümden çıkarılmış olduğu, GG-3 çözeltisinde
Hepes’in de çıkarılmış olduğu, GG-4 çözeltisinde yalnızca Mg
iyonlarının çözeltilerden çıkarılmış olduğu, GG-5 çözeltisinde
sadece HCO3 iyonlarının çözeltilerden çıkarıldığı ve son
olarak da GG-6 çözeltisinde Mg ve HCO3 iyonlarının
çözeltilerden çıkarıldığı görülecektir. Tablo-1’deki bütün
çözeltilerin pH değerleri 7.4-7.5 aralığındadır. Tüm
çözeltilerin kesişme noktasında ise, DCPD-OCP dönüşümü
üzerinde, önceki çalışmamızda kullandığımız DMEM
çözeltileri içinde bulunan vitaminlerin ve glukozun herhangi
bir etkisinin olmayacağı varsayımıdır. Bu varsayım ve
hazırlanan çözeltilerin içlerine konulan DCPD tozlarını OCP
fazına dönüştürme yetileri ise aşağıdaki standart biçimde
sınanmıştır.
DCPD-OCP dönüşümü 100 mL kapasiteli Pyrex® medya
şişelerinde (Fisher Scientific, Katalog No. 06-423-3B)
gerçekleştirilmiştir. Her bir şişeye 650 mg DCPD tozu ile
birlikte Tablo-1’deki GG-x çözeltilerinden 100 mL konulmuş,
şişelerin ağzı sıkıca kapatılmış ve bunlar sıcaklığı sürekli
olarak 36.5°C’de sabit tutulan mikroişlemci-kontrollü bir
etüvde (VMR, Dry-Line, Leuven, Belçika) 24, 48, 72 saat ve 6
gün arası değiştirilen süreler boyunca statik olarak
bekletilmişlerdir. Bekletme (hidrotermal tepkime) sürelerinin
sonunda, şişe içindeki maddeler filtre kağıdı ile süzülmüş,
çökelekler 700 mL saf su ile yıkanmış ve sonar aynı etüvde,
36.5°C’de 17-18 saat boyunca kurutulmuşlardır. Üretilen tüm
toz örneklerinin karakterizasyonu için X-ışını kırınımı
(Advance D8, Bruker AXS, Karslruhe, Almanya) ve Fourierdönüşümlü kızılötesi spektroskopi (SpectrumOne, PerkinElmer, USA) kullanılmıştır. X-ışını kırınım analizlerinde,
tozlar once bir agat havanda hafifçe öğütülmüşler, sonra da 40
kV, 40 mA X-ışını jeneratörü işletim koşullarında 0.02° 2θ
adım aralıkları (her adımda 3 saniye beklemeli) ile X-ışını
verisi toplanmıştır. FTIR analizleri yapılırken, 1 mg örnek
tozu ile 300 mg saf KBr tozu bir agat havanda karıştırılmış,
bunu takiben elde edilen tozlara 1 cm iç çapa sahip çelik bir
kalıp içinde 10 ton basınç uygulanarak yaklaşık 1 mm
kalınlığındaki FTIR pastilleri elde edilmiştir. Bu pastiller
FTIR cihazında 128 kez taranarak, 4000 ile 400 cm-1
aralığında veri toplanmıştır.
3. Bulgular ve Tartışma
DCPD’nin oda sıcaklığında ve pH değeri 5.5 olan su-bazlı bir
çözeltideki çözünme hızı 4.26x10-4 mol⋅m-2⋅min-1 iken, aynı
koşullarda insan kemik minerali olan KEHA’in çözünme hızı
ise 1.42x10-6 mol⋅m-2⋅min-1 olarak ölçülmüştür [3]. Bir başka
deyişle, brushite’ın çözünme hızı, anılan koşullarda,
KEHA’inkinden 300 kez fazladır. DCPD’nin bu çalışmadaki
çözeltilerde başlangıç malzemesi olarak kullanılmasının ana
nedeni, onun bu yüksek çözünürlüğüdür. DCPD’nin Ca/P
molar oranı 1.0 olup, çözeltiler içindeki yalnızca Ca/P molar
oranı 1.33 olan OCP’ye dönüşmesi beklenecektir. DMEM ve
burada geliştirdiğimiz DMEM’e benzer ama daha basit
çözeltilerin kendi Ca./P molar oranlarının 1.99 olduğu
gözönüne alındığında, DCPD-OCP dönüşümü için gereken
kalsiyumun çözeltiler tarafından sağlanabileceği açıktır. Bir
başka deyişle, bu çözeltilere KEHA koyup (Ca/P molar oranı
1.50 ile 1.67 arasında), sonra onların OCP’ye dönüşmelerini
beklemek yanlış olurdu.
Şekil-1’den de görüleceği üzere, jelatin ve Hepes içeren
çözeltilerde 72 saat sonunda hala çok önemli miktarda DCPD
kalmıştır. Şekil-2’de verilen GG-2 çözeltilerinde ise jelatin
Şekil-1: GG-1 çözeltilerinin tozlarının X-ışını kırınım verileri
bulunmazken, Hepes vardır. GG-2 çözeltileri yine 72 saat
sonunda saf OCP eldesine izin vermemişlerdir. X-ışını
kırınım verilerinde OCP fazının ana peak’i 4.74°,
DCPD’ninki ise 11.68° 2θ’dadır.
IR spektrumu verilmektedir, bu veri yüksek faz saflığında
OCP’ye işaret etmektedir.
Şekil-2: GG-2 çözeltilerinin tozlarının X-ışını kırınım verileri
Şekil-3’te gösterilen GG-3 çözeltilerinin özelliği ise jelatin ve
Hepes’in her ikisinin birlikte çıkarılmış oluşuydu. İlk kez bu
çözeltide, 72 saat sonunda DCPD tümüyle OCP’ye
Şekil-5: GG-3 çözeltisinde 72 saatte üretilen OCP; IR verisi
Bu çalışma süresince kullanılan başlangıç tozları olan DCPD
ve de çözeltilerde bunların hidrotermal dönüştürülmesi ile elde
edilen OCP’ye ait karakteristik taramalı elektron mikroskobu
fotoğrafları da Şekil-6’da sunulmuştur.
Şekil-3: GG-3 çözeltilerinin tozlarının X-ışını kırınım verileri
dönüşmüştür. Şekil-4’te ise GG-4, GG-5 ve GG-6
çözeltilerinden 72 saat sonra elde edilen tozların X-ışını
kırınım verileri hep birlikte aynı şekil üzerinde gösterilmiştir.
GG-4 çözeltilerinde jelatin ve Hepes’in yanısıra Mg iyonları
da çözeltilerden çıkarılmıştır. GG-4 çözeltisi 72
Şekil-6: (üst) DCPD, (alt) OCP tozlarının SEM fotoğrafları
Şekil-4: GG-4, GG-5, GG-6 çözeltilerine ait X-ışını kırınımı
saat sonucunda DCPD’yi tamamiyla OCP’ye dönüştürebilen
bir çözeltidir. GG-5 ve GG-6 çözeltileri ise şunu göstermiştir;
çözelti hazırlama reçetelerinden, Hepes ile birlikte NaHCO3
çıkarıldığında
DCPD’nin
OCP’ye
dönüşümü
engellenmektedir. GG-5 ve GG-6 durumunda, çözelti pH
değerlerinin 72 saat sonucunda 5 civarına düşmüş olması,
HCO3 iyonlarının pH regülatörü olarak davrandığını
göstermektedir. Şekil-5’de GG-3 çözeltilerinde 72 saat
36.5°C’de bekletilmiş DCPD tozlarından elde edilen OCP’nin
Aynı DCPD tozları, 72 saat boyunca, 36.5°C’de synthetic
body fluid (SBF, insan kan plazmasına çok benzer) çözeltileri
içinde tutulduğunda KEHA fazına dönüşmektedirler [4]. Bu
çalışmada geliştirilen DMEM-benzeri fakat daha basit olan
özellikle GG-3 ve GG-4 çözeltiler ile SBF çözeltileri
arasındaki en önemli farklar şöylece sıralanabilir; (i) SBF
çözeltileri Tris ile buffer edilmişlerdir, (ii) NaHCO3
derişimleri 27 mM’dır ve (iii) SBF çözeltilerinin Ca/P molar
oranları 2.50’dır. SBF çözeltileri pH değerlerini 72 saat
boyunca 7.4’te sabit tutabilmektedirler, fakat burada
geliştirilen çözeltilerin pH değerleri (içlerinde DCPD
barındırdıklarında) 72 saat sonunda 6.6-6.7 civarına
düşmektedir. Bu pH değerinde KEHA’nın kararlı olmadığı, bu
değerde ancak OCP’nin dengedeki faz olacağı bilinmektedir
[5]. SBF çözeltilerinde kullanılan Tris’in ise pH’ı sabit
tutabilme yetisinin Hepes’ten çok daha güçlü olduğu da
bilinmektedir [6].
OCP üretimi konusunda bu çalışmada izlenen özgün
yaklaşıma dek bilinen sentez yöntemleri OCP’nin ancak ve
ancak sıcaklığın 50°-100°C arasında sabitlenmesi halinde elde
edilebileceği gibi yanlış bir izlenim edindiriyordu. Bugüne
dek bilinen OCP sentez yönteminde kalsiyum asetat (veya
kalsiyum nitrat) ile sodyum dihidrojen fosfat içeren iki ayrı
çözelti birbirine yavaşça bu yüksek sıcaklıklarda
karıştırılmakta ve de oluşan çökelekler çözelti içinde uzun
süreler boyunca yine aynı yüksek sıcaklıkta bekletilmekteydi
[7-12]. Doğal olarak da, böyle yüksek sıcaklıklar gerektiren
sentez yöntem ve sentez çözeltileri içine, üretim süreçlerini
biyomimetik yapacak, biyopolimerlerin, çeşitli proteinlerin,
hormon ve büyüme faktörlerinin (bunların yüksek
sıcaklıklarda bozunma riski olacağından ötürü) eklenmesi
olanaksız olacaktır.
Bu çalışmada geliştirilen, özellikle GG-3 ve GG-4 çözeltileri,
DMEM çözeltilerine kıyasla [1], DCPD kristallerinin tümüyle
OCP’ye dönüşümünü bir haftadan, 72 saate kadar
düşürebilmiş çözeltilerdir. Amino asit ve Hepes içeren
çözeltiler (DMEM [1], GG-1 [2] ve GG-2 [2]) DCPD
kristallerini bir haftadan önce OCP’ye dönüştürememişlerdir.
Bu durum, çözelti içinde bulunabilecek amino asitlerin ve
Hepes gibi moleküllerin DCPD kristallerinin yüzeyine
tutundukları ve OCP’ye dönüşümü önemli ölçüde geciktirir
olmaları ile açıklanabilecektir.
4. Sonuçlar
Bu çalışmada, DCPD (brushite) tozlarının DMEM-benzeri,
ama çok daha basit çözeltiler içinde, insan vücut sıcaklığı
olan 36.5C’de insan sert doku mineralini önceleyen
oktakalsiyum fosfat (OCP) fazına sadece 72 saat içinde
dönüştürülebilecekleri, literatürde ilk kez olmak üzere,
deneysel olarak gösterilmiştir. Hepes, amino asitler,
vitaminler, glukoz ve Mg iyonları içermeyen, ama Ca/P molar
oranı 2 civarında olan su-bazlı ve hazırlanışı çok kolay olan
çözeltilerin DCPD-OCP dönüşümü için ideal oldukları
kanıtlanmıştır. Bu çalışmada geliştirilmiş ve açıklanmış olan
çözeltiler, kemik defekt ve boşluklarının cerrahi tedavisinde
kullanılabilecek OCP biyomalzemelerinin ve implant’lerinin
üretiminde kullanılma potansiyeline sahiptir.
5. Kaynakça
[1] S. Mandel and A. C. Taş, “Brushite (CaHPO4⋅2H2O) to
octacalcium
phosphate
(Ca8(HPO4)2(PO4)4⋅5H2O)
transformation in DMEM solutions at 36.5°C,” Mater.
Sci. Eng. C (Mater. Biologic. Appl.), vol. 30, pp. 245254, 2010.
[2]
G.
Girişken,
“Development
of
New
Biomineralization/Calcification Solutions,” BME 492,
Graduation Project Thesis, (Supervisor: A. C. Taş), Dept.
of Biomedical Engineering, Yeditepe University,
İstanbul, 2009.
[3] R. Tang, M. Hass, W. Wu, S. Gulde, and G. H. Nancollas,
“Constant composition dissolution of mixed phases II.
Selective dissolution of calcium phosphates,” J. Colloid
Interface Sci., vol. 260, pp. 379-384, 2003.
[4] A. C. Taş and S. B. Bhaduri, “Chemical processing of
CaHPO4⋅2H2O: Its conversion to hydroxyapatite,” J. Am.
Ceram. Soc., vol. 87, pp. 2195-2200, 2004.
[5] S. V. Dorozhkin, “Calcium orthophosphate cements and
concretes,” Materials, vol. 2, pp. 221-291, 2009.
[6] S. Jalota, S. B. Bhaduri, and A. C. Taş, “Effect of
carbonate content and buffer type on calcium phosphate
formation in SBF solutions,” J. Mater. Sci. Mater. M.,
vol. 17, pp. 697-707, 2006.
[7] R. Z. LeGeros, “Preparation of octacalcium phosphate
(OCP): A direct fast method,” Calcif. Tissue Int., vol. 37,
pp. 194-197, 1985.
[8] R. Z. LeGeros, G. Daculsi, I. Orly, T. Abergas, and W.
Torres,
“Solution-mediated
transformation
of
octacalcium phosphate (OCP) to apatite,” Scanning
Microscopy, vol. 3, pp. 129-138, 1989.
[9] Y. Liu, P. R. Cooper, J. E. Barralet, and R. M. Shelton,
“Influence of calcium phosphate crystal assemblies on
the proliferation and osteogenic gene expression of rat
bone marrow stromal cells,” Biomaterials, vol. 28, pp.
1393-1403, 2007.
[10] O. Suzuki, S. Kamakura, T. Katagiri, M. Nakamura, B.
Zhao, Y. Honda, and R. Kamijo, “Bone formation
enhanced by implanted octacalcium phosphate involving
conversion
into
Ca-deficient
hydroxyapatite,”
Biomaterials, vol. 27, pp. 2671-2681, 2006.
[11] Y. H. Tseng, J. Zhan, K. S. K. Lin, C. Y. Mou, and J. C.
C. Chan, “High resolution 31P NMR study of octacalcium
phosphate,” Sol. State Nucl. Mag. Resonance, vol. 26, pp.
99-104, 2004.
[12] M. Iijima, “Formation of octacalcium phosphate in vitro,”
Monogr. Oral Sci., Basel, Karger, vol. 18, pp. 17-49,
2001.