Sperma Sulandırıcıları ve Spermanın Sulandırılması Spermanın Kısa

Transkript

Sperma Sulandırıcıları ve Spermanın
Sulandırılması Spermanın Kısa ve Uzun
Süreli Saklanması ve Kryobiyoloji
Prof.Dr.Serhat PABUCCUOĞLU
22 Nisan 2013, İSTANBUL, AVCILAR
Sperma Sulandırıcısı Nedir?
Spermanın ihtiyaçlarını karşılayan, dış
etkenlere karşı spermatozoanın
bütünlüğünü ve fertilite yeteneğini
koruyan, dişi genital sistemine zarar
vermeyen, spermanın hacmini istenilen
düzeye çıkarabilen spermatozoa için
geliştirilmiş sıvı besi ortamlarıdır.
22.04.2013
Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul
2
Spermayı hacim olarak artırmak
Spermatozoanın canlılığını daha uzun süre devam ettirebilmek
Spermatozoayı ani ısı değişikliklerinden koruyabilmek
Mikroorganizmaların spermatozoaya zarar vermesini önlemek
SULANDIRICILARIN KULLANIM
AMAÇLARI
22.04.2013
3
Spemanın hacmini artırmak
Bir ejakulasyon sonunda elde edilen, örneğin bir boğa
sperması ortalama 5 mL’dir.
Bu sperma ile sun'i tohumlama yöntemi kullanılarak 100
- 500 adet inek tohumlanabilir.
Ancak 5 mL spermayı hiçbir şey yapmadan 100 - 500 eşit
hacime bölmek mümkün değildir. Bunu bölebilmek için
spermatozoaya zarar vermeden hacmini uygun bir
şekilde artırmak gerekir. Bunun için de «SPERMA
SULANDIRICISI» kullanılır
22.04.2013
4
Spermatozoanın canlılığını daha uzun
süre devam ettirebilmek
Testislerde üretilip ejakulasyon ile dışarıya bırakılan sperma seminal
plazmada bulunan maddeler sayesinde canlılıklarına devam ederler. Ancak
bu stoklar sadece dişi genital kanalın bir kısmındaki yaşama payını
karşılayabilir. Dış ortamda daha uzun süre canlı ve fertil kalabilmeleri için
mutlaka daha fazlasına ihtiyaç vardır.
Sulandırıcılarda bulunan basit şekerler gibi enerji veren maddeler,
spermatozoanın canlılığını sürdürmesinde yardımcı olurlar.
Ayrıca makromoleküler yapıdaki maddeler (özellikle lipoproteinler) membran
bütünlükleri ve oksidadif strese karşı koruyucu etkiye sahiptirler.
Metabolizma artıkları ekarte edilerek oksidatif strese bağlı hem membran
hem de DNA üzerinde şekillenecek önemli bozulmaların önüne geçilir.
Tampon ortamlar sayesinde ortamın pH değişimlerinin önüne geçilir.
22.04.2013
5
Spermatozoayı ani ısı değişikliklerinden
koruyabilmek.
Spermanın daha uzun süre saklanabilmesi için
5oC'a soğutulması veya dondurulması
zorunludur. Böylece sperma çok daha uzun süre
potansiyel fertilitesini koruyabilir.
Spermatozoanın membran yapısı lipoprotein
yapısındadır ve içinde kolesterol molekülleri
bulunur. Kolesterolün temel görevi hücre
membranının düşük ısılardaki dayanıklılığını
artırmaktır. Kolesterol miktarları düştükçe ısı
değişimlerine karşı spermatozoanın
dayanıklılığı da azalır. Sulandırıcıların içinde
bulunan makromoleküller özellikle lipoprotein,
phospholipid, Lesitin, β-Lipovitellin ve
glikoproteinler bu değişimlere karşı
spermatozoayı korurlar.
22.04.2013
6
Mikroorganizmaların spermatozoonlara
zarar vermesini önlemek.
Spermatozoa, herhangi bir hastalık etkeni söz konusu olmadığı sürece üretildiği testis
bölgesinden üretraya gelinceye kadar steril ortamdadır. Ejakülasyon sırasında üretra
içinde saprofit mikroorganizmalarla karşılaşır ve karışır
Dış ortama atıldığında ise çevrede bulunan tüm mikroorganizmalar spermayı
kontamine eder. Bu kontaminasyonun önlenmesi veya mikroorganizmaların etkisiz
hale getirilmesi için gereken önlemler:
– Kullanılan tüm malzemenin temizliğine, asepsisine ve sterilizasyonuna dikkat edilir
– Sulandırıcılar içine mutlaka antibiyotik ilave edilir
•
•
•
•
22.04.2013
streptomycin B sulfat (1000 µg/ mL) + Penicillen G (1000 IU/mL)
Gentamycin (500 µg/mL),
Tylosin (100 µg/mL)
Linco-spectin (300-600 µg/mL)
7
Sulandırıcılarda Aranan Temel
Özellikler
• Ozmotik basıncı seminal plazmanın ozmotik basıncına eşit
olmalı ve bu denge saklama süresince bozulmamalıdır.
• Spermatozoanın metabolizmasında gerekli olan mineral
maddeleri taşımalıdır.
• Spermatozoanın enerji gereksinimini karşılayabilecek
maddeleri içermelidir.
• Isı değişimlerine karşı spermatozoayı koruyan maddeler
bulunmalıdır.
• Spermatozoanın metabolik artıklarını elimine edebilmelidir.
• İçinde patojen mikroorganizma bulunmamalı bakteriyel
kontaminasyonun kontrolü
antibiyotikler
içermelidir.
22.04.2013
Prof. Dr. Serhatiçin
Pabuccuoğlu,
İstanbul
8
Özellikler: OZMOTİK BASINÇ
Seminal plazma ozmotik basıncı 300-340 mOsmol/kg
civarındadır. Sulandırıcı içine koyulacak olan mineral
tuzlar, şekerler, tampon sistemler, yumurta sarısı gibi
maddeler bu basıncın sağlanmasında büyük rol oynar.
Gliserol ozmotik basınç üzerinde en etkin olan maddedir.
O nedenle gliserol katma işleminden sonra sulandırılmış
olan spermanın ozmotik basıncının 1200 mOsmol/kg
üzerine çıkması istenmez.
22.04.2013
9
Özellikler: ENERJİ MADDELERİ
• Eklenti üreme bezleri tarafından yapılan salgı
tarafından oluşturulan seminal plazma farklı
türlerde farklı miktarlarda FRUKTOZ içerir. Bu
basit şeker spermatozoa hareketi için olmazsa
olmaz bir maddedir. Sulandırıcılara bu
maddenin ilave edilmesi şarttır. FRUKTOZ
yerine GLİKOZ da kullanılabilir.
22.04.2013
10
Özellikler: pH TAMPON SİSTEMLERİ
• pH değişimlerine karşı koruyucu tampon sistemlerini
içermelidir(spermanın pH değeri 6,8’dir).
– Na-citrat
– TRIS
Sperma ejakule edilirken eklenti üreme bezlerinden yapılan
salgılar öncelikle üretra ve daha sonra spermanın gideceği dişi
genital kanalı spermatozoa için uygun bir yer haline getiren pH
tampon sistemlerini içerir. Dış ortamda da spermatozoanın
metabolizması sonucunda ortam pH’sı değişeceği için bu
sistemlerin ortamda bulunması gerekir.
22.04.2013
11
Sulandırıcılarda Aranan Temel Özellikler:
MEMBRAN BÜTÜNLÜĞÜ KORUMASI
Bazal çukurluk
Plazma membranı
akrozom
Dış akrozom membranı
Spermanın gerek +5oC'a soğutulması ve burada saklanması
veya daha uzun süre kullanılabilmesi için dondurulması
zorunludur. Bu aşamada hem plazma mebranının hem de
akrozom membranı ve yapısının korunması fertilite için
olmazsa olmazdır.
Spermatozoanın membran yapıları lipoprotein yapısındadır ve
içinde kolesterol molekülleri bulunur. Kolesterolün temel
görevi hücre membranının düşük ısılardaki esnekliğini dolayısı
ile dayanıklılığını artırmaktır.
Kolesterol miktarları düştükçe ısı değişimlerine karşı
spermatozoanın dayanıklılığı da azalır.
Sulandırıcıların içinde bulunan makromoleküller özellikle
lipoprotein, phospholipid, Lesitin, B-Lipovitellin ve
glikoproteinler bu değişimlere karşı spermatozoayı korurlar.
22.04.2013
12
Sperma sulandırmada kullanılan
sulandırıcılar
• Na-sitrat Yumurta Sarısı Sulandırıcısı
• TRIS Bazlı Sulandırıcılar
• Yağsız Süt veya Süt Tozu İle Hazırlanmış
Sulandırıcılar
• Ticari Sulandırıcılar
– BTS (domuz)
– BIOXEL (boğa)
– CANİN-EXT (köpek)
22.04.2013
13
Yumurta Sarısı ve Sulandırıcılardaki Önemi
Yumurta sarısı ticari ürünler dışında hazırlanan tüm
sulandırıcıların içinde %20 oranında mutlaka vardır.
Yumurta sarısı içinde bulunan lipoproteinler ve
diğer glikoproteinler membran koruyucu
özelliklerinin yanı sıra içerdiği antioksidan maddeler
ile oksidatif stresin de önlenmesinde katkı sağlar.
Bu sayede hem membranların hem de DNA’ların
hasarlanmasının önüne geçilmiş olur.
22.04.2013
14
Yağsız Süt veya Süt Tozu
Yağsız süt tozu veya yağı alınmış süt ile hazırlanacak olan
sulandırıcıların mutlaka 92–95oC ısıda 8–10 dakika
ısıtılması gerekir.
Süt proteinleri arasında bulunan «LACTENİN» bu süreçte
inaktive edilmiş olur. Bu proteinin spermatozoa üzerinde
toksik etkisinin olduğu belirlenmiştir.
UHT sütler çok yüksek ısılara maruz bırakıldığı için bu
ısıtma sürecine ihtiyaç yoktur doğrudan kullanılabilir
22.04.2013
15
Anabioz ve kryobiyoloji nedir
• ANABİOZ:
Canlı metabolizmasının 5oC gibi düşük ısılarda yavaşlatılarak
yaşam süresinin ve buna bağlı olarak yaşamsal ve işlevsel
yeteneğinin bozulmadan uzatılmasına anabiose adı verilir.
• KRİYOBİYOLOJİ (DONMA BİLİMİ):
Canlı materyallerinin –196°C gibi çok düşük ısılarda,
canlılıklarını ve fonksiyonel özelliklerini kaybetmeksizin
saklanabilmesi ile ilgilenen bilim dalıdır.
Kriyobiyoloji kavramının içerisinde; sulandırıcılar, sulandırma,
KRYOPROTEKTAN, soğutma, dondurma ve depolama
tekniklerinin yanı sıra eritme teknikleri de yer alır.
22.04.2013
16
Spermanın kısa ve uzun süreli
saklanması
• Spermanın kısa süreli saklanması (ANABİOZ):
Oda ısısında ancak bir kaç saat süre ile fertilizasyon yeteneğini koruyabilen
spermatozoa, sulandırılırsa ve 5oC‘de saklanırsa bu yeteneğini bir kaç gün
sürdürebilir (yaklaşık 72 saat). Spermatozoa metabolizmasının 5oC gibi
düşük ısılarda yavaşlatılarak yaşam süresinin ve buna bağlı olarak
fertilizasyon yeteneğinin uzatılmasında ANABİOSE’dan yararlanılır.
• Spermanın uzun süreli saklanması (DONDURULMASI):
Spermanın dondurularak metabolizmasının durma noktasına
yaklaştırılmasına ve böylece canlılığını yıllarca koruyabilmesine de
anabiose denilebilir.
Spermatozoa, özel olarak hazırlanmış ve KRYOPROTEKTAN içeren
sulandırıcılar içerisinde, bir dizi soğutma aşamalarından sonra
dondurularak –196°C gibi çok düşük ısılarda depolanır.
22.04.2013
17
Biyolojik materyallerin dondurulmasında
koruyucu olarak kullanılan malzemeler:
KRİYOPROTEKTANLAR
Biyolojik materyallerin dondurulmasında donma işleminin oluşturacağı olumsuz
etkilere karşı suyun fizikokimyasal yapısını değiştirerek korumak ve oluşacak hasarı en
aza indirebilmek amacıyla hücrelerin bulunduğu ortama bir takım koruyucu maddeler
ilave edilir. Bu maddelere genel olarak KRİYOPROTEKTAN adı verilir. Sperma, embriyo,
oosit ve vücut hücrelerinin dondurulmasında en yaygın olarak kullanılan kimyasal
kriyoprotektanlar aşağıda sıralanmıştır.
–
–
–
–
Gliserin(gliserol)
DMSO( dimetilsulfoksit)
Etilen glikol
Propilen glikol
Koruyucu özelliğe sahip sukroz, trehaloz gibi polisakkaritler, glikoproteinler,
lipoproteinler ve makromoleküler yapıdaki maddeler, dondurulacak olan biyolojik
materyallerin özellikle membran yapılarının korunmasında yaygın olarak
kullanılmaktadır.
22.04.2013
18
Kryoporotektanların etki mekanizması
• Kimyasal kryoprotektanlar su
moleküllerini kendi yapılarına çekme
özellikleri vardır
• Osmotik basıncı oldukça yükseltirler
• Hücre içinde dehidrasyon oluşumunu
sağlar
• Suyun donma sırasındaki davranışını
bozarak kristal oluşumu bozulur amorf
lameller şeklinde buz oluşumu şekillenir
• Hücre içinde mikro kiristallerin
şekillenmesi sağlanır mekanik DNA
hasarı önlenir
22.04.2013
19
Sperma Sulandırılmasındaki Temel
Kurallar
• Sperma ile temas edecek olan tüm malzeme ve ekipmanın temiz
(kimyasal ve diğer kirleticiler açısından) ve mümkünse steril olması
sağlanmalıdır
• Sulandırıcılar içinde bulunan ve kısa sürede bozulabilen enzim ve
proteinleri içermesi nedeniyle taze olarak hazırlanmalıdır
• Sulandırıcı ve sperma her zaman karıştırılmadan önce aynı ısıya
getirilmelidir
• Her zaman sulandırıcı spermanın üzerine katılmalıdır
• Sulandırıcı sperma üzerine bir seferde değil, kısım kısım ayrılmış
hacimlerde (tercihen sırasıyla katılacak toplam sulandırıcı miktarının
%10, %20, %30, %40’ı veya %20, %30 ve %50’si şeklinde) kademeli
olarak ve 8-10 dakika aralıklarla sperma üzerine eklenmelidir
22.04.2013
20
Spermanın taze kullanım amaçlı
sulandırılması
• Sulandırıcı taze olarak hazırlanır
– Kullanım günü hazırlanan sulandırıcı , içinde 26 - 32oC su bulunan ben-marey
içine alınır
• Suni vajen veya elektroejakülatör ile sperma alınır
– Sperma alındıktan hemen sonra sulandırıcının içinde bulunduğu ben marey
içine yerleştirilir. Buradaki amaç sulandırıcı ve sperma ısılarının bir birine
eşitlenmesidir
•
•
•
•
•
•
Makroskobik ve Mikroskobik Muayeneleri gerçekleştirilir
Sulandırıcı miktarı hesaplanır
Sulandırma işlemi gerçekleştirilir
Sulandırma sonrasında mikroskobik muayeneler tekrarlanır
+4 - +5oC’ye Soğutma işlemi gerçekleştirilir ve soğukta saklanır
Kullanım öncesinde muayeneler tekrarlanır
22.04.2013
21
Sulandırıcı Miktarının Hesaplanması
22.04.2013
22
Sulandırıcı Miktarının Hesaplanması
• Yapılan hesaplamada 100 adet inek tohumlanabileceği belirlenmiştir.
• Tohumlama dozunun hacmi 1 ml olacak ise çıkan bu rakam hacimle
çarpılmalıdır
100 x 1 mL = 100 mL
(Sperma + Sulandırıcı)
Bu hacimden sperma miktarını çıkarttığımızda gerekli olan sulandırıcı miktarını
hesaplamış oluruz
100 – 4 = 96 mL
sulandırıcı hazırlanması ve spermanın üzerine eklenmesi gerekir
22.04.2013
23
Spermanın Soğutulması
Türler bazında farklılıklar göstermekle birlikte in
vitro koşullarda dondurulmaksızın saklanabilmesi
için veya donma öncesinde kryoprotektanların
eklenmesi ve için spermanın 5oC'a soğutulması
gerekmektedir.
Spermatozoon membranlarındaki yapısal özellik
soğutma işlemine karşı hassasiyeti de
beraberinde getirmiştir. Bu nedenle yapısal ve
fonksiyonel bütünlüğün korunabilmesi için
mutlaka soğutma işleminin de hassas ve yavaş bir
şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
Yapılan çalışmalarda ön sulandırılması işlemi
gerçekleştirilmiş olan spermanın dakikada 0,2-0,3
oC/dak hızla soğutulmasının en iyi sonucu verdiği
anlaşılmıştır.
22.04.2013
24
Avantajları:
Spermalar çok uzun yıllar saklanabilir ve kullanılabilir
Çok küçük hacimdeki stoklarda çok yüksek miktarlarda damızlığın sperması saklanabilir
Dondurulan spermalar uzun mesafelerde nakledilir
Boğaların spermaları çok geniş coğrafik alanlarda kullanılabilir
Kıymetli damızlıklardan daha fazla yararlanabilme imkanı sağlanır
SPERMANIN UZUN SÜRELİ
SAKLANMASI İÇİN DONDURULMASI
22.04.2013
25
Dondurularak Depolanmış Spermalar
22.04.2013
26
Suni Tohumlama
sektöründeki
Dondurulmuş
spermanın
yerine bir örnek
22.04.2013
27
Spermanın dondurma amaçlı
sulandırılması
•
•
Sulandırıcı taze olarak hazırlanır
Kullanılacak olan sulandırıcı miktarı ikiye ayrılır A (gliserolsüz sulandırıcı) ve B (gliserollü sulandırıcı) sulandırıcısı
olarak işaretlenir
–
–
•
Suni vajen veya elektroejakülatör ile sperma alınır
–
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Kullanım günü hazırlanan A sulandırıcı, içinde 26 - 32oC su bulunan ben-marey içine alınır
Kullanım günü hazırlanan B sulandırıcısı içine gliserol eklenir, 4oC soğuk vitrin içine alınır
Sperma alındıktan hemen sonra sulandırıcının içinde bulunduğu ben marey içine yerleştirilir. Buradaki amaç sulandırıcı ve sperma
ısılarının bir birine eşitlenmesidir
Makroskobik ve Mikroskobik Muayeneleri gerçekleştirilir
Sulandırıcı miktarı hesaplanır
Sulandırıcı A ile sulandırma işlemi gerçekleştirilir
Sulandırılmış sperma +4oC’a soğutulur
Soğutma sonrası mikroskobik muayeneler tekrarlanır
Soğutma işlemi tamamlandıktan sonra gliserollü sulandırıcı sulandırılmış spermanın üzerine eklenir
«GLİSEROLİZASYON»
Gliserolizasyon işlemi tamamlandıktan sonra spermatozoonların «EKİLİBRASYONU» yapılır
Dondurma yöntemine göre porsiyonlanır
Dondurma işlemi gerçekleştirilir
Dondurulmuş olan spermalar uygun koşullarda saklanır
Donma sonrasında 37oC’daki su banyosunda çözündürülerek mikroskobik muayeneler gerçekleştirilir
Bir hafta sonra yeniden örnek alınıp çözündürülerek mikroskobik muayeneler tekrarlanır ve uygun olan spermalar
kullanılmak üzere depolanır.
22.04.2013
28
Sperma dondurmada kullanılan
kryoprotektanlar,
•
•
•
Süt lipidleri ve proteinleri de kryoprotektan olarak kabul edilirler. Süt proteinlerinin
yanı sıra kazein iyonlarının fiziksel etkiden ziyade kimyasal yolla kryoprotektif
özellik gösterdikleri bilinmektedir.
Yumurta sarısının sitratlı sulandırıcılarda yararlı etkisi 1939 yılında rapor edilmiştir.
Yumurta sarısındaki fosfolipit, Lesitin, B-Lipovitellin, Lipoprotein ve glikoprotein'in
kryoprotektif özellikte olduğu çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir. Süt, yumurta
sarısı gibi maddelerdeki makromoleküllerin varlığı da spermatozoanın yapısal ve
fonksiyonel bütünlüğünün korunması için neredeyse zorunludur.
Spermanın dondurulmasında en yaygın kullanılan kimyasal ajan GLİSEROL dür.
– Gliserol türe bağlı olmakla birlikte genellikle hacmen %3-7 aralığında
sulandırıcılara katılır (boğa sperması için %5-7 en yaygın kullanılan orandır)
22.04.2013
29
Dondurma amaçlı sulandırıcı
hazırlanması
• Alınan sperma muayene edildikten sonra kullanılacak
olan toplam sulandırıcı miktarı hesaplanır
• Hesaplanmış olan sulandırma sonrası ulaşılacak toplam
hacim ikiye bölünür
• Birinci hacim sperma + sulandırıcı A olarak belirlenir
• İkinci hacim ise Sulandırıcı B + total gliserol olarak
belirlenir.
• B sulandırıcısı içine finalde belirlenen gliserol miktarı
eklenir.
22.04.2013
30
Örnek
Sulandırılmış spermanın toplam hacmi 50 mL olacaksa ve bunun
içinde %5 oranında gliserol ilave edilecek ise finalde hacmi
oluşturan unsurlar şu şekilde sıralanabilir
5 mL sperma
2,5 mL gliserol
42,5 mL
sulandırıcı
Ön sulandırma işleminde 5 mL sperma üzerine sulandırıcı A’dan
20 mL kuralına uygun olarak eklenmesi gerekir
5 mL sperma
20 mL sulandırıcı A (2 mL, 4 mL, 6 mL ve 8 mL’lik
porsiyonlar halinde Prof.
10Dr.dakika
ara ile)
22.04.2013
Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul
31
Spermanın Soğutulması
Spermanın gliserolizasyon ve dondurma
işleminden önce +4oC’a soğutulması çok
önemlidir.
Bu aşamada yapılacak olan bir hata
donma sonrası yapısal ve fonksiyonel
bütünlüğün (membran ve akrozom
bütünlüğü, motilite ve fertilite kabiliyeti)
korunmasında da negatif etkileyecektir.
Temel kural burada da aynıdır ve yapılan
çalışmalarda ön sulandırılma işlemi
gerçekleştirilmiş olan spermanın
dakikada 0,2-0,3 oC/dak hızla
soğutulmasının en iyi sonucu verdiği
gösterilmiştir.
22.04.2013
32
Gliserolizasyon
Dondurulacak olan spermaya
gliserolün kademeli ve aralıklı olarak
alıştıra alıştıra katılması olayıdır
22.04.2013
33
Gliserolizasyon
Soğutma işlemi tamamlandıktan sonra Gliserol içeren B sulandırıcısı eklenmesi gerekir.
B Sulandırıcısı toplam hacimde bulunması gereken toplam gliserol miktarını içerir yani:
22,5 mL Sulandırıcı
2,5 mL gliserol eklenir ve iyice karıştırılır
Hazırlanan sulandırıcı B gliserolizasyon işleminde kullanılır
25 mL
25 mL
22.04.2013
Sulandırıcı A ile sulandırılmış sperma
Sulandırıcı B (2 mL, 4 mL, 6 mL ve 8 mL’lik porsiyonlar halinde 10
dakika ara ile)
34
Örnek
22.04.2013
35
Gliserolizasyon
Örnek: 5 ml boğa spermasının(1,25 x 109 spermatozoon/mL %80 motil) %7
gliserollü sulandırıcı ile payet başına 12,5 milyon motil spermatozoon olacak
şekilde dozlandığında 400 doz sperma hesaplanır. Her bir tohumlama dozu
0,25 mL olursa toplamda ulaşılacak olan hacim 100 mL dir. Bu da
95 mL sulandırıcı + 5 mL sperma demektir
Sulandırıcı A ile 26 - 32 oC’lik su banyosunda ön sulandırma
Toplam Hacim 50 mL (Gliserolsüz)
45 mL sulandırıcı + 5 mL sperma = 50 mL
↓ (2 - 4 saat soğutma)
+5oC
22.04.2013
36
Gliserolizasyon
Sulandırıcı B’nin yapısı ve sulandırma işlemi (+ 5oC)
Toplam hacim 50 mL (Gliserollü)
Sulandırıcı 43 mL + Gliserol 7 ml = 50 mL
Sulandırılmış sperma (50 mL) + 10ml Sulandırıcı B
↓ 10 dakika
Sulandırılmış sperma (60 mL) + 15 mL Sulandırıcı B
↓ 10 dakika
Sulandırılmış sperma (75 mL) + 25 mL Sulandırıcı B
Toplam = 100 mL içinde 7 mL gliserol = %7
(10 dakika ara ile gliserollü sulandırıcının önce %20'si sonra %30'u ve %50'sini ilave
etme tekniğini gösteren örnektir.)
22.04.2013
37
Ekillibrasyon
Spermanın gliserollü sulandırıcı ile işlem gördükten sonra
5oC’de geçirmek zorunda olduğu adaptasyon süresidir.
Gliserolizasyon sonrası sperma hücresi ile sulandırıcı
(gliserol) arasındaki madde alış verişinin tamamlanması
ve ortamın dengeye ulaşması için beklenilir.
Ekilibrasyon sonrası sperma donma işlemine hazır hale
gelmiş olur. Bu süre türe ve bireye bağlı olarak yaklaşık 23 saat kadardır.
22.04.2013
38
Ekilibrasyon Aşamasında Gerçekleşen
Olaylar
SU
HİPEROSMOTİK BASINÇLI
ORTAM
22.04.2013
39
Spermanın dondurulmasında
kullanılan yöntemler
• Ampul yöntemi ile spermanın dondurulması
– Kuru buz – Etil Alkol banyosu kullanılarak gerçekleştirilen
yöntemdir. Etil alkol banyosu içine –79oC’deki kuru buz
parçaları atmak suretiyle 2 aşamada gerçekleştirilir.
• Birinci aşamada alkol banyosunun ısısı 5oC’den -20oC'a kadar 1 2oC/dak hızında soğutulur
• İkinci aşamada mümkün olan en yüksek donma hızı sağlanarak ısı 20oC’den -79oC'a soğutulur.
Depolama aynı banyo kabında yapılır. Ancak kuru buz eksildikçe
takviyesinin yapılması ve ortamın -79oC’de tutulması zorunludur.
22.04.2013
40
• Pellet yöntemi ile spermanın dondurulması
– 79oC’deki kuru buz bloklarının üzerinde gerçekleştirilen şok dondurma
yöntemidir.
• Kuru buz (katı CO2) blokları üzerine ufak oyuklar açılır.
• Sonra bu çukurlara 5oC ısıda ekilibrasyonu tamamlanmış 0,1 – 0,2 ml kadar sıvı
sperma damlatılır.
• Birkaç dakika (2 - 3 dakika) içerisinde donan sperma pellet tarzında elde edilir.
• Pelletlerin üzerine önceden hazırlanmış hayvan, laboratuvar adı vb. bilgileri taşıyan
küçük kağıt parçaları yapıştırılır. Bu kağıt parçaları kuru buz üzerine sperma
damlatıldıktan sonra donma öncesi yerleştirilmelidir.
• Pelletler özel yuvaları olan pellet taşıyıcılarına yerleştirildikten sonra, -196oC ısıdaki
sıvı azot içinde depo edilirler.
22.04.2013
41
• Payet yöntemi ile spermanın dondurulması
– Günümüzde kullanılan en yaygın ve en pratik donma
yöntemidir
– Sperma 0,25 ml veya 0,5 ml hacimli payet denilen
plastik çubuklarda dondurulur
– Ülkemiz laboratuvarlarında 0,25 ml payetler
kullanılmaktadır. Payetlerin bir ucu açık, bir ucu
kapalıdır. Otomatik makine veya elle bu payetlerin
içine sulandırılmış sperma doldurulur ve açık ağızları
ısı veya polivinil alkol yardımı ile kapatılır
22.04.2013
42
Payet Doldurma-kapatma Makinası
22.04.2013
43
Spermanın Payet Yöntemi İle
Dondurulması
• Sperma ile dolu payetler yine 5oC'lık ortamda taraklara dizilirler. Buradaki
amaç payetlerin üst üste yığılmasını önlemek ve donma esnasında bütün
payetlerin sıvı azot buharı ile temas etmesini sağlamaktır.
• Taraklara dizilen payetler zaman geçirilmeksizin donma kazanına
aktarılırlar ve özel ızgara bölümüne yerleştirilirler. Dondurma kazanı daha
önceden hazırlanmalıdır. Dondurma kazanı içindeki sıvı azot seviyesi,
ızgaranın bulunduğu yüksekliğe kadar getirilmelidir. Payetler içindeki
sperma sıvı azot seviyesinin yaklaşık 4 cm yukarısında 7 – 10 dakika sürede
dondurulurlar. -110 ile -120 oC arasında sıvı azot buharındaki bu şok
dondurma sırasında azot buharının yoğunlaşması amacıyla dondurma
kazanının üst kısmı kapatılır.
• Donma işlemi tamamlandıktan sonra payetler sıvı azot içine daldırılarak
aynı ortamda plastik gobletlere yerleştirilir ve sıvı azot içinde -196oC’de
depolanırlar.
22.04.2013
44
Sıvı Azot Buharında Payetler Kullanılarak
Spermanın Dondurulması
22.04.2013
45
Payet Yöntemi ile Dondurulmuş ve Depolanmış
Spermalar
22.04.2013
46
Spermanın dondurulması sırasında spermayı
etkileyen çevresel faktörler
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Ani ısı değişimleri
Ani pH değişimleri
Ani ozmotik basınç değişimleri
Güneş ışığının zararlı etkileri
Kimyasal kirlik
Mikrobiyel kirlilik
Taze olmayan biyolojik materyal (yumurta, süt vs.)
Sıvı azot seviyesi ve sıvı azot buharı yoğunluğu
Sıvı azot içine aktarırken yapılan hatalar
Saklama konteynerleri içindeki sıvı azot miktarı
22.04.2013
47

Sperma Sulandırıcıları ve Spermanın Sulandırılması Spermanın Kısa

Transkript

Benzer belgeler

BioPharm Newsletter

türkhaygen-1 projesi in vitro koyun embriyo üretimi kurs kitapçığı

atriyal fibrilasyonda kan sulandırıcı tedavi

18 Aralık 2013 ÇARŞAMBA Resmî Gazete Sayı : 28855

kedilerde reprodüksiyon ve sun`i tohumlama

Sağlık