N-Asetil Sisteinin Olası Koruyucu Rolü

ASETAMİNOFEN İLE UYARILAN KARACİĞER TOKSİSİTESİNİN
İNCELENMESİ: N-ASETİLSİSTEİNİN OLASI KORUYUCU ROLÜ
Efe Kemal Akdoğan, Hande Erdoğan, Erencan Gündoğdu, Gonca Saraç
Danışman: Derya Aldemir
ÖZET
Asetaminofen (APAP) sıklıkla kullanılan bir analjezik/antipiretik ajandır. APAP‟ın aşırı
dozda alınması akut karaciğer yetmezliğine neden olmaktadır. APAP‟ ın sebep olduğu
hepatotoksisitenin gelişiminde reaktif oksijen ve nitrojen türleri önemli bir rol oynamaktadır.
L-Arjinini substrat olarak kullanan NOS ve arjinaz enzimlerinin birçok fizyopatolojik
durumda ters regülasyonları önem taşımaktadır. Bu çalışmada APAP ile uyarılan karaciğer
toksisitesinde oksidatif ve nitrozatif stres ile Arjinaz/NO ilişkisinin irdelenmesi ve koruyucu
olarak N-asetilsistein (NAC) kullanımının etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
25-35 gr ağırlığında, erkek, swiss-albino cinsi 24 adet fare 4 eşit gruba ayrılarak
kullanılmıştır. Kontrol grubuna taze hazırlanan salin, APAP grubuna subletal dozda APAP
uygulaması (550 mg/kg), NAC grubuna 400mg/kg dozda N-asetil sistein uygulaması ve
APAP+NAC grubuna tek doz APAP uygulamasından sonra ikinci saatte tek doz NAC
uygulaması
gerçekleştirilmiştir. Tüm uygulamalar bir gecelik açlık sonrasında,
intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon yolu ile yapılmış ve 24 saat sonra hayvanlar anestezi altında
sakrifiye edilmiştir.
Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, APAP grubunda serum aspartat aminotransferaz (AST)
ve alanin aminotransferaz (ALT) aktiviteleri anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (p<0.01).
APAP uygulaması kontrol grubuna göre karaciğer malondialdehit (MDA) derişimini anlamlı
olarak artırırken, redükte glutatyon (GSH) derişimini, anlamlı olarak azaltmıştır (p<0.05).
NAC uygulaması ise, karaciğer MDA derişiminde azalmaya, GSH derişiminde artmaya
neden olmuştur (p<0.05). Hepatik arjinaz aktivitesinde herhangi bir değişim gözlenmezken,
NOS aktivitesinin göstergesi olarak karaciğer nitrit derişimleri APAP uygulanan grupta tüm
gruplara göre anlamlı yüksek bulunmuştur (p<0.01).
Bulgularımız, bu dozda APAP uygulamasının karaciğer hasarına neden olduğunu, lipit
peroksidasyonunu ve NO oluşumunu artırdığını, N-asetilsisteinin ise oksidatif ve nitrozatif
stres bağlamında koruyucu etki gösterdiğini ortaya koymuştur.
GİRİŞ
Asetaminofen (APAP) sıklıkla kullanılan bir analjezik/antipiretik (ağrı kesici/ateş
düşürücü)‟tir. Terapötik dozlarda kullanıldığında yararlı olan APAP‟ın yüksek dozlarda
kullanıldığında deney hayvanları ve insanlarda hepatik nekroz, böbrek toksisitesi ve ölüme
neden olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. APAP‟ın aşırı dozda alınması Amerika
Birleşik Devletleri, İngiltere ve Avrupa‟da akut karaciğer yetmezliğinin en sık nedeni haline
gelmiştir(1, 12).
APAP (C8H9NO2), katı, kütlesi 151,2 g/mol olan, suda çözünürlüğü az, sentetik bir
moleküldür (Şekil 1). Zayıf bir asit olması nedeniyle fizyolojik pH aralığında aniyonize
formda bulunmaktadır (28).
Şekil 1 Asetaminofen (10)
1
APAP öncelikle karaciğerde glukuronidasyon ve sülfasyon ile metabolize edilir. Terapötik
dozda alınan APAP (< 4g/gün)‟ın % 80-85‟i sülfat-glukronit konjugasyonu ile, % 10-15‟i ise
hepatik CYP450 sistemi (CYP2E1-1A2) ile bir reaktif toksik metabolit olan N-asetil-pbenzokinonimin (NAPQI)‟e dönüştürülerek detoksifiye edilmektedir. Bu toksik metabolit
glutatyon (GSH)‟a bağlanarak detoksifiye edilir (Şekil 2). APAP‟ın aşırı doz alımı, CYP
enzimlerinin indüksiyonu, glutatyonun azalması ve/veya glukuronidasyonun inhibisyonunun
gerçekleştiği durumlarda bu metabolit yeterince detoksifiye edilemez. Yüksek doz APAP
uygulaması sonrası konjugasyon yolu doygunluğa ulaştığı için CYP450 yolu ile metabolize
edilen APAP miktarı artar ve bu durum toksik reaktif metabolit oluşum hızında artışla
sonuçlanır (3,35). Bu artış, hücre içi redükte glutatyonda (GSH) azalma ile sonuçlanır ve
ortamdaki fazla NAPQI hücredeki makromoleküllerle etkileşerek sentrilobüler nekroza neden
olur. Erken dönemde mitokondrial disfonksiyon görülürken bunu mitokondrial kollaps,
onkotik nekroz izler ve sonuçta in vivo hücre ölümü meydana gelir (3,33).
Şekil 2 Karaciğerde Asetaminofen Metabolizması ( 11 )
Oksidatif stres, serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma ve tamir sistemleri arasındaki
dengenin bozulması durumudur. Reaktif oksijen türleri (ROS) hücrede lipit, protein, DNA
gibi makromoleküllerle etkileşime girmektedir. Bu nedenle ROS ve lipit peroksidasyonu
birçok hastalığın patogenezinde önemli rol oynamaktadır. Lipit peroksidasyonu ROS aracılı
hücre hasarının en önemli sonuçlarından biridir. Fizyolojik şartlar altında düşük hızda
gerçekleşen lipit peroksidasyonunun oksidanlar ve oksidatif stres ile oluşum hızı
artabilmektedir. Lipit peroksidasyonunun en önemli hedefi çoklu doymamış yağ asidi (PUFA)
içeriği fazla olan membran fosfolipitleridir. PUFA‟lar ve metabolitleri enerjinin sağlanması,
hücre içi sinyal oluşumu ve gen ekspresyonunun düzenlenmesi gibi önemli fizyolojik rollere
sahiptir. Bu nedenle lipit peroksidasyonu membran lipit tabakasının fizyolojik yapısını
değiştirerek hücresel işlev kaybına neden olabilmektedir.
Oksidatif stres mekanizmasının APAP toksisitesinde önemli rol oynadığı kabul edilmektedir.
∙
APAP‟ın NAPQI‟ya oksidasyonunda artış, O2 - ve hidrojen peroksit (H2O2) oluşumunda
artışla sonuçlanmaktadır. NAPQI‟nın yüksek oksidatif kapasitesi nedeniyle oluşan tiyol
oksidasyonunun karaciğer toksisitesinin ana nedeni olabileceği düşünülmektedir. NAPQI‟nın
GSH‟ı okside etmesi sonucu hücede GSH/GSSG oranı ve ayrıca NADPH/NADP + oranı
azalmaktadır. GSH derişiminde bu azalma, GPx enzim aktivitesinde azalma ve/veya kayıpla
sonuçlanmaktadır (17).
2
APAP‟ ın sebep olduğu hepatotoksisitenin gelişiminde reaktif oksijen ve nitrojen türleri
önemli rol oynamaktadır (15). APAP toksik dozunu izleyen süreçte nekrotik hücrelerdeki
proteinde tirozin nitrasyonu meydana gelmektedir. Tirozin nitrasyonu artan NO ve
süperoksitin reaksiyona girmesi sonucu oluşan peroksinitrit aracılığı ile gerçekleşmektedir.
APAP‟ın toksik dozu NO sentezi ve nitrotirozin-protein eklentilerinin yapımının artışına
öncülük eder (12). Nitrotirozin karaciğerdeki nekrotik sentrilobuler bölgede APAP-protein
eklentileriyle aynı yerleşimlidir. Peroksinitritin GSH/GSH peroksidaz tarafından detoksifiye
edildiği bilinmektedir. Ancak hücre içi GSH‟ın, APAP toksisitesinde önemli ölçüde
azalmaktadır (12, 15). Hepatik GSH biyosentezini arttırmak için mevcut APAP aşırı dozunun
tedavilerinde N-asetilsistein kullanılmaktadır (12).
APAP hepatotoksisitesi iNOS ekspresyonunun artmasıyla ve nitrotrozin-protein eklentilerinin
oluşması ile ilişkilidir. Aminoguanidin ile iNOS‟un inhibe edilmesinin APAP tarafından
oluşturulan karaciğer hasarını önemli ölçüde azalttığı gösterilmiştir. NO hepatik
mikrovaskülasyona yeterli kan rezervinin sağlanmasında kritik bir rol oynar. Bu işlevini
lökosit, platelet ve endotelyal hücrelerinde adezyon moleküllerinin eksprese edilmesini
etkileyerek gerçekleştirmektedir (14).
Hepatik üre döngüsünün bir enzimi olan arjinaz (EC 3.5.3.1), L-arjinini üre ve ornitine
hidroliz eder. Arjinazın, doku dağılımına, subsellüler yerleşimine ve immünolojik
reaktifliğine göre değişiklik gösteren iki ayrı izoenzimi tanımlanmıştır. Arjinaz I, karaciğerde
çok miktarda ifadelenen sitozolik bir enzimdir ve toplam vücut arjinaz akivitesinin çoğunu
oluşturur. Arjinaz II ise geniş doku dağılımına sahip, en çok böbrek ve prostatta, çok az
miktarda ise karaciğerde ifadelenen mitokondrial bir enzimdir.
Nitrik oksit sentaz (EC 1.14.13.39) NADPH ve O2 varlığında arjininin nitrik oksit (NO) ve
sitrüline dönüşümünü katalizleyen bir monooksijenazdır (Şekil 3). Memelilerde üç farklı NOS
ifadelenir: Nöral NOS (nNOS), endotelyal NOS (eNOS) ve indüklenebilir NOS (iNOS).
Bunların hepsi homodimerik, hem içeren flavoproteinlerdir. NOS flavinleri NADPH kaynaklı
elektronları hem‟e transfer ederler. Bu her iki basamakta da hem‟in dioksijene bağlanmasına
ve onu aktive etmesine yol açar. Ayrıca tetrahidrobiopterin kofaktör olarak gereklidir ve
enzime hem‟in yanından sıkıca bağlanmıştır. NOS‟un elektron transfer reaksiyonları kalsiyum
bağlayan ve NOS‟a tersinir biçimde bağlanabilen kalmodulin tarafından düzenlenir (29).
Ancak, ilk olarak makrofajlarda tanımlanan iNOS (tip2) kalsiyum bağımsızdır ve
indüklenebilir (26).
Nitrik oksit (NO) memeli vücudundaki birçok önemli olayda rol oynayan bir sinyal
molekülüdür (29). En önemli özelliği bir serbest radikal olmasıdır. NO‟nun kimyası onun bir
serbest radikal olmasına yoğunlaşmasına rağmen, NO diğer serbest radikaller ile aynı
kimyasal özellikleri göstermez. Örneğin, diğer karbon-, oksijen- ya da nitrojen- merkezli
serbest radikallerin aksine nitrik oksit dimerize olmaya yatkın değildir (8).
NO‟nun biyokimyası onu direk ve indirek olarak iki sınıfa ayırır. Direk etkileri, NO‟yu
biyolojik hedef molekül ile direk tepkimeye sokacak kadar hızlı oluşan kimyasal
tepkimelerdir. Bu durumun tersine; indirek etkileri NO‟nun O2 veya superoksit (O2¯˙) ile
tepkimeye girerek reaktif nitrojen radikalleri/molekülleri (RNS) oluşturması, ardından
RNS‟nin biyolojik hedefle tepkimeye girmesiyle oluşan kimyasal tepkimelerdir. Direk etkiler
genelde düşük derişimlerde oluşurken, indirek etkiler çok daha yüksek derişimlerde gözlenir.
NO‟nun normal fizyolojik süreci düzenleyen damar ve stroma hücrelerindeki gibi düşük
derişimlerinden eNOS ve nNOS sorumludur. Makrofajlar tarafından aktive edilen, sitotoksik
3
fonksiyonlarının olduğu düşünülen yüksek seviyelerinden ise iNOS sorumludur (32). NO,
özgün bölgedeki derişimi, diğer ROS‟ların derişimi ve özellikle hücre redoks durumuna bağlı
olarak antioksidan, düzenleyici veya toksik etki gösterebilmektedir. Nitrasyon, nitrozilasyon
ve oksidasyon dolaylı etkileri arasında yer almaktadır. Genel olarak, düşük derişimlerde
(<1μM) doğrudan, buna karşın yüksek derişimlerde (>1μM) dolaylı etki göstermektedir (34).
Arjinazın hücrelerdeki aktivitesi NO biyosentezini NOS substratı olan L-arjinin için yarışarak
düzenlemektir (6,24,25). Arjinaz I ve Arjinaz II, iNOS tarafından NO yapımının
sınırlandırılmasında eşit etkiye sahiptir. Egzojen L-arjinin alımının olmadığı durumda Arjinaz
I‟in artmış ekspresyonunun nitrit üretimini baskıladığı gösterilmiştir (25). Arjinaz ayrıca,
iNOS proteinin translasyonunu ve kararlılığını baskılamayı, üre yapımıyla ve endojen
inhibitörü olan ADMA ile NOS aktivitesini baskılamayı içeren birtakım potansiyel
mekanizmalar yoluyla NO yapımını inhibe eder. Öte yandan arjinazın artmış sentezinin,
eNOS ile NO sentezini baskıladığı ve hipertansiyon, yaşlanma, iskemi-reperfüzyon ve
diyabetteki endotelyal işlev bozukluğuna yol açtığı gösterilmiştir (24).
Şekil 3 Nitrik Oksit Sentaz Tepkimesi ( 29)
Şekil 4 Arjinin Metabolik Ürünleri (27)
N- asetilsistein (NAC) indirgenmiş glutatyon (GSH)‟un ve L- sistein (L-Cys)‟in asetillenmiş
halidir. Güçlü nükleofilik özelliği nedeni ile serbest radikalleri temizleme yetisine sahiptir.
NAC sülfidril grubu içerdiği için oral alımı sonrasında gastrointestinal sistemden hızlıca
emilir. Barsak ve karaciğerde asetil grubu uzaklaştırılarak metabolize edilir. Oral
kullanımından 1 saat sonra en yüksek plazma değerine ulaşır ve 12 saat sonra plazmada yer
almaz. Sülfidril grubu vericisi olarak GSH sentezini uyarır, zenobiyotik
biyotransformasyonunu baskılayarak, karaciğer toksik hasarında koruyucu işlev gösterir.
NAC; klinikte solunum hastalıkları, APAP ve diğer zehirlenmeler, HIV enfeksiyonları, kanser
ve çeşitli kalp hastalıkları gibi bazı hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Kronik
solunum hastalıklarında mukolitik ajan ve asetaminofen doz aşımına bağlı karaciğer hasarında
GSH ve L-Cys öncüsü olarak kullanılır (12,15,22).
Bu çalışmada APAP‟ın neden olduğu karaciğer toksisitesi üzerinde N-asetilsisteinin koruyucu
etkisinin oksidatif ve nitrozatif stres ile hepatik arjinaz/nitrik oksit sentaz ilişkisi bağlamında
karşılaştırılması amaçlanmaktadır.
GEREÇ VE YÖNTEM
Bu çalışma Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları kullanım kurallarına
uygun
olarak
Tıp
Fakültesi
Deney
Hayvanları
Etik
Kurulu‟nun
2010/sayı:B.30.2.BŞK.0.05.05.01/215 no‟lu kararı ve desteğiyle gerçekleştirildi.
Deney Hayvanları ve Gruplar
Çalışmada, ağırlıkları 30-40 gr arasında değişen 24 adet erkek Swiss Albino fare kullanıldı.
Deney hayvanları 12 saat aydınlık, 12 saat karanlıkta bırakıldı ve beslenmeleri standart
4
diyet ve su (ad libitum) ile sağlandı. APAP LD50 dozu 550 mg/kg ve NAC dozu 400 mg/kg
olarak belirlendi. Uygun dozlar seçildikten sonra deney hayvanları 4 gruba ayrıldı.
Grup 1 (Kontrol grubu): Salin uygulanan grup (KONT) (n=6)
Grup 2: 400 mg/kg NAC (i.p., tek doz) (n=6)
Grup 3: 550 mg /kg APAP (i.p., tek doz ) (n=6)
Grup 4: 550 mg/kg APAP (i.p., tek doz) + 400 mg/ kg NAC (APAP sonrası 2. saat) (i.p., tek
doz) (n=6)
Tüm uygulamalar bir gecelik açlık sonrasında, intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon yolu ile
(8ml/kg) yapıldı ve 24 saat sonra hayvanlar anestezi altında (50 mg/kg ketamin; 7 mg/kg
ksilazin) sakrifiye edildi. Bütün gruplarda intrakardiak kan alımı sonrası karaciğer dokusu
izole edildi.
Serum Biyokimyasal Parametrelerinin Ölçümü
3000g‟de 15 dk santrifügasyon sonrası elde edilen serum örneklerinde aspartat
aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT), laktat dehidrogenaz aktiviteleri uv
yöntem ile Roche diagnostik reaktifleri kullanılarak Roche Hitachi modüler PP sisteminde
(Roche Diagnostik GmbH, Mannheim, Almanya) analiz edildi.
Doku MDA ve GSH Derişiminin Saptanması
Dokular 0,15 M potasyum klorür içinde cam-cam homojenizatör kullanılarak (1/10; w/v)
homojenize edildi.
Doku örneklerinde MDA derişimi Buege ve Aust‟un yöntemi kullanılarak saptandı (4).
Yöntem MDA‟nın tiyobarbitürik asit (TBA) ile yaptığı kompleksin kolorimetrik olarak
ölçümü esasına (Shimadzu-1601) dayanmaktadır (A535). MDA derişimleri molar ekstinksiyon
katsayısı (1,56x105M-1cm-1) kullanılarak hesaplandı ve nmol/g doku olarak ifade edildi.
Doku GSH derişimleri Ellman‟ın doku sülfidril grup analizi yöntemi ile gerçekleştirildi (7).
GSH derişimleri standart eğri kullanılarak hesaplandı ve mol/g doku olarak ifade edildi.
Doku Arjinaz Aktivitelerinin Saptanması
Doku örnekleri %1 Triton X-100, 0.1 M PMSF, 0.2 mM leupeptin içeren 20 mM Tris-HCl pH
7,68 tamponunda cam-cam homojenizatör kullanılarak homojenize edildi (1/10, w/v).
Homojenat örneklerinin 15,000g‟de 10 dk santrfüj işlemi sonrası elde edilen süpernatant
enzim kaynağı olarak kullanıldı.
Enzim aktivite tayini Geyer ve Dabich‟in yöntemine göre gerçekleştirildi (9). Yöntem oluşan
ürenin kolorimetrik olarak ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Renk oluşumu sonrası
absorbanslar 520 nm‟de (Shimadzu-1601) renk körüne karşı ölçüldü. Üre derişimleri standart
eğri kullanılarak belirlendi ve 1 ünite enzim aktivitesi 1 mol üre/dk/g doku olarak (U/g
doku), spesifik aktivite ise U/mg protein olarak ifade edildi.
Doku NOS Aktivitelerinin Saptanması
Doku NOS aktivitelerinin belirlenmesi, dolaylı olarak, NO‟in kararlı son ürünleri olan total
nitrit analizi ile gerçekleştirildi. Doku örnekleri 2 mM EDTA içeren 20 mM pH 7,68 Tris-HCl
tamponunda cam-cam homojenizatör kullanılarak (1/10, w/v) homojenize edildi. Total nitrit
analizleri Nitrik Oksit Kolorimetrik Analiz Kiti (Roche Diagnostik, Mannheim, Almanya)
kullanılarak önerilen protokole göre gerçekleştirildi. Absorbans değerleri 550 nm‟de,
“mikroplate” okuyucu (Bio-Tek, Winooski-USA) kullanılarak köre karşı elde edildi.
5
Derişimler standart eğri kullanılarak hesaplandı ve total NO2¯ derişimleri nmol/g doku olarak
ifade edildi.
Doku Total Protein Analizi
Doku homojenatlarında total protein analizi Bradford yöntemine göre gerçekleştirildi (2).
Protein derişimleri BSA (Bovine serum albumin) standart eğrisi kullanılarak hesaplandı ve
sonuçlar mg/ml olarak ifade edildi.
İstatistiksel Analiz
Değişkenlerin normal dağılıma uyumu Shapiro- Wilk testi ile kontrol edildi. Normal dağılım
göstermeyen ve grup varyansları homojen olmayan değişkenlere ilişkin karşılaştırmalar
Kruskal- Wallis testi ve ardından çoklu karşılaştırma yöntemlerinden Bonferroni- Dunn testi
ile yapıldı. Parametrik testlerin önşartlarını sağlayan değişkenlere ilişkin grup
karşılaştırmalarında Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ve ardından çoklu karılaştırma
yöntemlerinden Tukey testi kullanıldı. Sonuçlar ortalama  standart sapma ve ortanca değer
olarak ifade edildi. p<0,05 düzeyi istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Veri setinin
istatistiksel analizi SPSS 11,5 yazılımı ile gerçekleştirildi.
BULGULAR
APAP ve NAC uygulamalarının serum ALT, AST ve LDH aktiviteleri üzerine etkileri Tablo
1 ve sırasiyle Şekil 5 ve 6‟da verilmiştir. ALT ve AST aktiviteleri APAP uygulanan grupta,
diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulunmuştur (p<0,01 ve p<0,05).
APAP+NAC uygulanan grupta ise kontrol grubuna göre anlamlı bir değişiklik bulunmamıştır.
LDH aktiviteleri gruplar arasında anlamlı değişiklik göstermemiştir.
Tablo 1 Serum Biyokimyasal Parametreleri
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
Grup 1
Kontrol (n=6)
59 ± 22,8
(51)
200 ± 138,6
(174)
Grup 2
NAC (n=5)
108 ± 50,1**
(77)
176 ± 41,7
(148)
LDH
(U/L)
739 ± 321,8
(691)
611 ± 229,2
(470)
Grup 3
APAP (n=5)
1302 ± 2389,2**, #
(144)
1446 ± 2138,2
(395)
2540 ± 3668,4
(894)
Grup 4
NAC+APAP (n=6)
70 ± 31,2
(58)
140 ± 77,2#
(127)
564 ± 128,6
(539)
Veriler ort ± SD ve (ortanca) olarak verilmiştir
#

**
p<0,01 Grup 1 ve 4 ile karşılaştırıldığında; p<0,05 Grup 2 ile karşılaştırıldığında; p<0,01 Grup1, 2 ve 4
ile karşılaştırıldığında
6
6000
5000
5000
4000
4000
AST (U/L)
ALT (U/L)
6000
3000
2000
2000
**, #
1000
6
Kontrol
b
b
b5
NAC
,,
b

1000
**
0
-1000
N=
3000
#
0
-1000
N=
5
6
APAP
APAP+NAC
Şekil 5 Serum ALT aktiviteleri
6
5
5
Kontrol
NAC
APAP
b
b
b6
,
APAP+NAC
,
b
Şekil 6 Serum AST aktiviteleri
Tablo 2 Doku MDA, GSH, total nitrit derişimleri ile arjinaz aktiviteleri
Kontrol
(n=6)
NAC
(n=5)
APAP
(n=6)
NAC+APAP
(n=6)
Arjinaz
(U/g)
680,4 ± 109,80
(661,17)
723,2 ± 69,78
(744,23)
614,1 ± 106,60
(595,75)
721, 37 ± 33,84
(726,77)
Arjinaz
(U/mg prt)
55,7 ± 8,35
(53,04)
51 ± 4,34
(50,29)
51,8 ± 3,77
(51,18)
51 ± 4,48
(50,02)
Total nitrit
(nmol/g)
244,8 ± 68,17
(256,57)
271,18 ± 65,97
(310,24)
405,5 ± 132,35
(369,21)
197,7 ± 89,04##
(199,82)
MDA
(nmol/g)
GSH
(μmol/g)
23,3 ± 4,33
29,4 ± 8,67
38,5 ± 12,12*
23,9 ± 5,61
7,3 ± 0.88
7,0 ± 1,24
4,0 ± 1,49
6,6 ± 1,27
Veriler ort ± SD ve (ortanca) olarak verilmiştir
APAP uygulaması, kontrol ve APAP+NAC gruplarına göre MDA derişimlerini anlamlı
olarak yükseltmiştir (p<0,05). APAP + NAC grubunda ise kontrol grubuna göre anlamlı bir
değişiklik bulunmamıştır (Tablo 2, Şekil 10). GSH derişimleri, APAP uygulanan grupta diğer
tüm gruplara göre anlamlı olarak azalırken (p<0,01), APAP+NAC uygulanan grupta ise
kontrol grubuna göre anlamlı bir değişiklik bulunmamıştır (Tablo 2, Şekil 11).
7
Şekil 7 Karaciğer arjinaz aktiviteleri
Şekil 8 Karaciğer arjinaz spesifik aktiviteleri

##
Şekil 9 Karaciğer total nitrit derişimleri
*

Şekil 10 Karaciğer MDA derişimleri
Şekil 11 Karaciğer GSH derişimleri
##

*
p<0,05 Grup 1 ve 4 ile karşılaştırıldığında;
p<0,01 Grup 2 ile karşılaştırıldığında; p<0,01 Grup1, 2 ve 4
ile karşılaştırıldığında
TARTIŞMA
APAP sıklıkla kullanılan analjezik/antipiretik bir ilaçtır. Terapötik dozlarda kullanıldığında
yararlı olan APAP‟ın aşırı dozda alınması akut karaciğer yetmezliğinin en sık nedeni haline
gelmiştir. Aşırı doz APAP alımında, CYP enzimlerinin indüksiyonu, glutatyonun azalması
8
veya glukuronidasyon inhibisyonu ile yeterince nötralize edilemeyen NAPQI hücredeki
proteinlerin sistein gruplarına kovalan bağlanır ve hepatik sentrilobuler nekroz meydana gelir
(1,12,21).
En çok APAP‟ın toksik etkisine karşı kullanılan N-Aseilsistein (NAC) güvenli ve tolere
edilebilir bir andidottur. APAP toksisitesine karşı NAC‟ın birincil rolü hücre içi GSH‟ı tekrar
sağlamasıdır (21).
Bu çalışmada 550 mg/kg subletal dozda APAP uygulanması ile serum ALT ve AST
aktivitelerinin kontrole göre artışı akut karaciğer hasarını desteklemektedir. Ayrıca APAP
toksisitesinde insanlarda tedavi amaçlı kullanılan NAC uygulaması enzim aktivitelerinin
kontrol düzeylerine inmesini sağlayarak koruyucu etki göstermiştir.
L- arjinin‟in poliaminlere, nitrik oksit (NO)‟e ve üre sentezine giden metabolik yolları
arasındaki ilişki toksisite dahil birçok durumda etkilenebilir. Arjinin, hem arjinaz hem de
NOS için ortak bir substrattır. Arjinaz ve NOS aktivitelerinin kontrolü söz konusu enzimlerin
fizyolojik ve klinik işlevleri nedeni ile büyük önem taşımaktadır. Aynı substratı, ilgileri farklı
olmak üzere kullanmaları, sentezlerinin indüksiyonu ve aktivitelerinin düzenlenmesindeki
olası ters işlevleri nedeni ile çeşitli araştırmalarda ekspresyonları/aktiviteleri incelenmiştir
(16).
Tiyoasetamid ile uyarılmış akut karaciğer hasarının arjinaz aktivitesinde düşüşe yol açarken
total hepatik NO2¯ derişimini arttırdığı gösterilmiştir. Karaciğer doku arjinaz aktivitesindeki
azalmanın enzimin karaciğerden salınmasını ve/veya hasara bağlı olarak sağlam hepatosit
sayısının azalmasını yansıtabileceği bildirilmiştir. (18). Karbon tetraklorür ile uyarılmış bir
karaciğer hasarı modelinde ise bazı üre döngüsü enzimlerinin karaciğer hücreleri zarar
gördüğü zaman hepatositlerden hızlı bir şekilde sızdığı ve serum tip I arjinaz‟ının önemli
ölçüde arttığı gösterilmiştir.Araştırmalar, karaciğer arjinazının birden fazla formunun
olduğunu; ancak çeşitli patofizyolojik durumlarda Tip I arjinazın indüklenmediğini
göstermektedir. Buna karşın karaciğer hasarlarında Tip II arjinaz ekspresyonunun ve
aktivitesinin arttığı gösterilmiştir (13).
Çalışmamızda karaciğer dokusu total nitrit derşiminde APAP uygulanan gruplarda anlamlı
artış gözlenirken, hepatik arjinaz aktivitesi ve/veya spesifik aktivitesi gruplar arasında anlamlı
bir değişim göstermemiştir. Bu sonucun; olasılıkla nitrozatif ve oksidatif strese ikincil olarak,
tip I hepatik arjinazın “turnover” hızının değişmesine veya tip II arjinaz sentezinde olası
uyarılmaya bağlı olabileceği düşünülmektedir.
Benzer biçimde Chrzanowska ve ark. (5) yaptıkları çalışmada; siroz tanısı almış karaciğerde
görülen bozulmuş amonyak inaktivasyonu ve artmış kollajen biyosentezinin hepatik arjinaz I
ve II düzeylerindeki değişiklikle ilgili olabileceği düşünülmüştür. Normal karaciğer ile
karşılaştırıldığında arjinaz I aktivitesi ve mRNA derişiminde önemli ölçüde azalma, arjinaz II
ekspresyonunda ise olasılıkla ornitin ve poliamin biyosentezindeki işlevi nedeni ile yükselme
görülmüştür.
Serbest radikal olan NO hem sitotoksik hem de hücre koruyucu özellikleri olan bir reaktif
moleküldür. Bazı araştırmalar endojen NO‟nun toksik olduğunu açıkça belirtirken, diğerleri
ise koruyucu olduğunu göstermiştir. Koruyucu etkileri antioksidan mekanizmalar üzerinden
sunulurken, NO aracılı toksisite hücre ölümüne yol açan reaktif nitrojen türlerinin oluşumuna
dayandırılır. NO‟nun yarılanma ömrü yani biyolojik aktivitesi superoksit gibi oksijen
9
kaynaklı serbest radikaller tarafından belirlenir. Superoksit hızla NO ile tepkimeye girerek
yüksek reaktif bir ara ürün olan peroksinitriti oluşturur. Bu tepkime superoksit
dismutasyonundan 3-4 kat daha hızlıdır. Peroksinitrit yüksek derişimlerde sitotoksiktir;
proteinlerde, yağlarda, ve DNA‟da oksidatif hasar meydana getirebilir (30).
APAP metabolizmasının ve kovalan bağlanmanın hepatotoksisite gelişiminde önemli
basamaklar oldukları bilinmektedir. Fakat reaktif nitrojen ve oksijen türlerinin mekanizma
açısından önemli olabilecekleri de ileri sürülmüştür. APAP ile muamele edilmiş sentrilobuler
hücrelerde nitrotirozin ve APAP eklentilerinin biriktiği gösterilmiştir. APAP‟ın proteinlere
bağlanması toksisitenin en iyi belirteci olduğu için tirozin kalıntılarının nitrasyonu da toksisite
ile bağlantılı olabilir. APAP kalıntıları NAPQI metabolitinin sistein ile reaksiyonu sonucu
oluşurken nitrotirozin kalıntıları tirozin ile NO ve süperoksitten yapılan peroksinitritin
reaksiyonu sonucu yapılır. iNOS “knockout” ve “wildtype” farelerde APAP hepatotoksisitesi
araştırılmış, APAP‟ın iNOS “knockout” farelerde yaklaşık %50 oranında daha az toksik
olduğu gösterilmiştir (21). APAP‟ın toksik dozlarının hepatositlerde iNOS‟un uyarılmasına
yol açtığı bilinmektedir. Bu yüzden “wild-type” farelerde APAP, NO sentezinin üç kat
artmasına ve hepatik proteinlerin nitrasyonunda yükselişe neden olmuştur.
Bu çalışmada APAP uygulaması karaciğer dokusunda MDA düzeyinde kontrol grubuna göre
anlamlı artışa neden olmuştur. Yapılan çalışmalarda toksik doz APAP uygulaması sonucu
MDA değerlerinde kontrole göre % 40-120 kat artış olabileceği gösterilmiştir (19).
Mladenoviç ve ark. APAP uygulamasından (300 mg/kg) 6 saat sonra farelerin doku ve serum
MDA derişimlerinde anlamlı bir artış olduğunu göstermişlerdir. APAP toksisite düzeylerinin
deney hayvanı cins ve türüne göre değişebildiğini destekleyen yayınlar mevcuttur (20).
GSH, ROS ve elektrofilik ksenobiyotiklere karşı hücre içi savunmasının ana kaynağını
oluşturmaktadır. Ksenobiyotiklere yüksek derecede maruziyet hepatik GSH derişimini
azaltmaktadır. Ksenobiyotikler ve metabolitlerinin GSH ile konjugasyonunu GSH-Stransferaz (GST) enzimi katalizlemekte olup, karaciğerin GST bakımından zengin olduğu
bilinmektedir. Oluşan toksik olmayan konjugatlar safrayla atılmakta ve parçalanıp NAC
konjugatı şeklinde asetillenerek idrar yolu ile uzaklaştırılmaktadır (6). GSH, proteinlerin
yapısındaki tiyol ve diğer nükleofilik grupların APAP‟ın toksik metabolitinden korunmasında
esansiyeldir. Bu nedenle APAP kaynaklı karaciğer hasarının anahtar belirleyicisi hücre içi
GSH düzeyidir (31).
Bu çalışmada; APAP uygulaması, karaciğer GSH derişimini tüm gruplara göre anlamlı olarak
azaltmıştır. Farklı doz ve sürelerle APAP uygulaması yapılan iki çalışmada da, benzer şekilde
GSH derişiminde anlamlı bir azalma olduğu gösterilmiştir (1, 35). Meotti ve ark. APAP
uygulamasından 4 saat sonra total hepatik GSH derişiminde anlamlı bir azalma
gözlemlenirken, 24 saat sonunda ise anlamlı bir değişim olmadığını bildirmişlerdir. Başka bir
çalışmanın sonucunda ise, APAP ‟ın hepatik GSH‟ı anlamlı olarak azalttığı, buna karşın 8
saat sonrasında GSH‟ın normal düzeylere geri döndüğü bildirilmiştir (20). Farelere 300 mg/kg
APAP uygulanan bir çalışmada 6, 24 ve 48 saat sonunda sülfidril grup derişimine bakılmıştır.
Uygulama sonrası sülfidril gruplarında gözlenen azalmanın 6 saat sonra artmaya başlayarak
24 saat sonunda pik yaptığı ve 48 saatin sonunda yeniden düşüşe geçtiği gösterilmiştir.
GSH‟nun hepatositteki sülfidril gruplarının ana kaynağı olup, gözlenen artışın hepatositin
adaptif yanıtı ile ilişkili olabileceği ve sonraki dönemdeki düşüşün ise ROS
detoksifikasyonundan kaynaklanabileceği bildirilmiştir.
10
Çalışmamızda uygulanan APAP dozu bu çalışmalara göre daha yüksek olup, 24 saat sonunda
GSH derişiminin kontrol değerlerine göre anlamlı düşük olması da bu bulguları
desteklemektedir. Ayrıca çalışmamızda 24 saatin sonunda artan lipit peroksidasyonu ve total
nitrit derişimi ile birlikte GSH‟ın önemli ölçüde azalması; olasılıkla APAP ile uyarılan iNOS
aktivitesi artışı sonucunda gelişen nitrozatif stresin de oksidatif stres mekanizmasına eşlik
ettiğini düşündürmektedir. Artan NO derişimi göz önüne alındığında, GSH‟daki tükenmenin
olasılıkla peroksinitrit aracılı hasara ve/veya S-nitrozilasyona bağlı olabileceği
düşünülmektedir.
NAC‟ın APAP‟ın toksik etkisine karşı antidot olarak kullanım nedeni APAP ile uyarılan
hepatotoksisitedeki Cys/GSH eksikliğidir. NAC proteinlerdeki disülfit bağlarını indirger,
serbest radikalleri baskılar ve serbest metal bağlayıcı özellik gösterir. NAC uygulaması
hepatik GSH‟in de novo sentezi için gerekli olan Cys‟i sağlar. Bu özelliklerinden dolayı
farmakolojik olarak temel kullanım yeri APAP toksisitesidir (2,3,4). NAC sisteine göre daha
az toksik olduğu ve suda daha fazla çözündüğü için, NAC kullanımı parenteral Cys
kullanımına göre daha yaygın olarak tercih edilir. „in vitro’ çalışmalarda NAC‟ın oksidatif
strese bağlı hücre hasarını ve apoptozise bağlı hücre ölümlerini azalttığı gösterilmiştir (22).
Bu çalışmada da APAP uygulamasından 2 saat sonra gerçekleştirilen parenteral NAC
kullanımının lipit peroksidasyonunu azalttığı, GSH derişimini kontrol değerlerine yükselttiği
ve nitrit derişimini de azalttığı gösterilmiştir.
SONUÇ
Deneysel modelimizde asetaminofen;
1. Akut karaciğer hasarına neden olmuştur. Bu durum serum transaminaz düzeylerinin artışı
ile desteklenmektedir.
2. Karaciğerde artmış lipit peroksidasyonu, azalmış GSH düzeyleri APAP ile uyarılan
hepatotoksisitenin oksidatif stres aracılı geliştiğini göstermektedir.
3. Karaciğerde total nitrit artışının gözlenmesi APAP ve/veya türevlerinin
NOS
indüksiyonuna yol açtığını düşündürmektedir. Karaciğerde yüksek subletal APAP
uygulamasına yanıt olarak artan NOS aktivitesi, nitrozatif stresin modelimizde gelişen
hepatotoksisitede rol oynadığını düşündürmektedir.
4. Uygulamanın hepatik arjinaz aktivite ve/veya spesifik aktivitesinde değişikliğe yol
açmaması bu modelde arjinaz ve NOS aktivitelerinin ters düzenlenmesinin söz konusu
olmadığını göstermektedir.
5. N-asetisistein uygulaması karaciğerde GSH düzeylerinin yeniden sağlanması, lipit
peroksidasyonunun ve nitrozatif stresin baskılanması yolu ile uygulanan dozda koruyucu
işlev göstermiştir.
6. APAP aracılı hepatotoksisitede; arjinaz/NO ilişkisine açıklık getirilmesi amacı ile
karaciğer arjinaz izozimlerinin ve arjinin metabolitlerinin analiz edileceği ileriye dönük
çalışmalara gereksinim bulunmaktadır.
KAYNAKLAR
1. Ajith TA, Hema U, Aswathy MS. Zingiber officinale Roscoe prevents acetaminopheninduced acute hepatotoxicity by enhancing hepatic antioxidant status. Food and Chemical
Toxicology: 45 (11): 2267 - 2272, 2007.
2. Bradford MM. QA rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principal of protein-dye binding. Analytical Chemistry:
72 (1-2), 248-254, 1976.
11
3. Bromer MQ, Black M. Acetaminophen hepatotoxicity. Clinics in Liver Disease: 7,
351-367, 2003.
4. Buege, J.A. ve Aust, A.D. (1978). Microsomal lipid peroxidation. Methods in
Enzymology, 302-310.
5. Chrzanowska A, Gajewska B, Barańczyk- Kuźma A. Arginase isoenzymes in human
cirrhotic liver. Acta Biochimica Polonica; 2009; Vol:56 No:3, 465-469
6. Durante W, Johnson FK, Johnson RA. Arginase: A Critical Regulator of Nitric Oxide
Synthesis and Vascular Function. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2007; 34(9):906-911
7. Ellmann, G.L. (1959). Tissue sulphydryl groups. Archieves of biochemistry and
biophysics, 82, 70-77.
8. Fukuto JM. Nitric oxide: biochemistry, molecular biology, and therapeutic implications.
First ed. San Diego: Academic Pres, Inc; 1995. p 2-7.
9. Geyer, J.W. ve Dabich, D. (1971). Rapid method for determination of arginase activity in
tissue homogenates. Analytical Biochemistry, 39, 412-417.
10. http://www.chem.purdue.edu/gchelp/116exams/e1f003.gif ; 23 Mayıs 2010; 16:33
11. http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/02/briefing/Image1415.gif ; 23 Mayıs 2010; 16:34
12. Hinson JA, Bucci TJ, Irwin LK, et al. Effect of inhibitors of nitric oxide synthase on
acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. Biology and Chemistry 2002; 6: 160–167
13. Ikemoto, M., Tsunekawa, S., Toda, Y., Totani, M. (2001). Liver type arginase is a highly
sensitive marker for hepatocellular damage in rats. Clinical Chemistry, 47 (5), 946-948.
14. Ito Y, Abril ER, Bethea NW et al. Role of nitric oxide in hepatic microvascular injury
elicited by acetaminophen in mice 2004; 286, 60-67
15. James LP, McCullough SS, Lamps LW et al. Effect of N-acetylcysteine on
acetaminophen toxicity in mice: relationship to reactive nitrogen and cytokine formation;
2003; 75, 458-467
16. Jenkinson, C.P., Grody, W.W., Cederbaum, S.D. (1996). Comparative properties of
arginases. Comparative Biochemistry and Physiology. 114 (1), 107-132.
17. Jos GM, Bessems and Nico PE, Vermeulen. Paracetamol (Acetaminophen)-induced
toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches.
Critical Reviews in Toxicology: 31 (1), 55-138, 2001.
18. Karabay G, Aldemir D, Türkoğlu S, et al. The effect of melatonin treatment on oxidative
and nitrosative stress in rats with thioacetamide-induced hepatic damage. Hepatology
Research; 2005; 31, 160-167
19. Lai JT, Fang HL, Hsieh WT, Cun W. Protective effects of a fermented substance from
saccharomyces cerevisice on liver injury in mice caused by acetaminophen. Bioxci.
Biotechniol Biochem.: 72 (10), 2514-2520, 2008.
20. Meotti FC, Rosa JM, Bracardo PS, Balz D, Waltrick AP, Bagio A, Golulart EC, Dafre
AL, Rodrigues AL, Santos RS. Protective effect of crude extract from wedelia paludosa
on the hepatotoxicity induced by paracetamol in mice. J.of Pharmacy and Pharmacology:
58, 137-142, 2006.
21. Michael S.L., Mayeux P.R., Bucci T.J., et al. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in
Mice Lacking Inducible Nitric Oxide Synthase Activity. NITRIC OXIDE: Biology and
Chemistry; 2001; Vol:5 No:5, pp. 432-441
22. Moling O, Cairon E, Rimenti G, et al. Severe hepatotoxicity after therapeutic doses of
acetaminophen. Clinical Therapeutics 2006; 28, 755-760
23. Mori M. Regulation of Nitric Oxide Synthesis and Apoptosis by Arginase and Arginine
Recycling. The Journal Of Nutrition 2007; 137: 1616S–1620S
24. Nikolic J, Stojanovic I, Pavlovic R, et al. The role of L-Arginine in toxic liver failure:
interrelation of arginase, polyamine catabolic enzymes and nitric oxide synthase. Amino
Acids 2007;32, 127-131
12
25. Que LG, George SE, Gotoh T et al. Effects of Arginase Isoforms on NO Production by
nNOS. Nitric Oxide 2002; 6, 1-8
26. Sehapibal PK, Lander HM. Stress response: methods and protocols. First ed. New Jersey:
Humana Press Inc; 2000. p 3-8.
27. Sidney M, Morris Jr. Arginine: beyond protein1-4. Am J Clin Nutr; 2006; 83(suppl): 508S12S.
28. Slattery J.T, Levy G. Acetaminophen kinetics in acutely poisoned patients. Clin. Pharmac.
Therap. ; 25: 184-195, 1979.
29. Stuehr DJ. Enzymes of the L-Arginine to Nitric Oxide Pathway. The Journal Of Nutrition
2004; 134:2748S–2751S
30. Sydow K, Münzel T. ADMA and oxidative stres. Atherosclerosis Supplements 2003; 4:
41-51.
31. Şener G, Omurtag G, Sehirli Ö, Tozan A, Yüksel M, Ercan F, Gedik N. Protective effects
of ginkgo biloba against acetaminophen induced toxicity in mice. Molecular and Cellular
Biochemistry: 283, 39-45, 2006.
32. Thomas DD, Ridnour LA, Jeffrey SI et al. The Chemical Biology of Nitric Oxide.
Implications in Cellular Signaling. Free Radic Biol Med. 2008; 45(1): 18–31.
33. Vaquero J, Belanger M, James L, Herrero R, Desjardins P, Cote J, Blei A, Butterworth R.
Mild hypothermia attenuates liver injury and improves survival in mice with
acetaminophen toxicity. Gastroenterology: 132, 372-383, 2007.
34. Wink, D.A ve Mitchell, J.B. (1998). Chemical biology of nitric oxide: insights into
regulatory, cytotoxic and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Radica Biology
and Medicine, 25 (4/5), 434-456.
35. Yapar K, Kart A, Karapehlivan M, Atakişi O, Tunca R, Erginsoy S, Citil M.
Hepatoprotective effect of l-carnitine against acute acetaminophen toxicity in mice.
Experimental and Toxicologic Pathology : 59 (2): 121 – 128 , 2007.
13