Kurs Elkitabi FULL - EU-RL GMFF

Transkript

EĞİTİM KURSU
GIDA ÖRNEKLERİNDE
GENETİĞİ DEĞİŞTİRİLMİŞ ORGANİZMA
ANALİZLERİ
KURS ELKİTABI
Editörler: Maddalena Querci, Marco Jermini ve Guy Van den Eede
Bu yayına elektronik ortamda ulaşmak için:
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm
ISBN 978-92-79-13574-3
Katalog No. LB-X1-06-051-TR-C
Asli Basım 2006
Çeviri 2010
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
EĞİTİM KURSU
GIDA ÖRNEKLERİNDE
GENETİĞİ DEĞİŞTİRİLMİŞ ORGANİZMA
ANALİZLERİ
KURS ELKİTABI
Editörler: Maddalena Querci, Marco Jermini ve Guy Van den Eede
Bu yayına elektronik ortamda ulaşmak için:
ISBN 978-92-79-13574-3
Katalog No. LB-X1-06-051-TR-C
Asli Basım 2006
Çeviri 2010
II
YASAL UYARI
Avrupa Komisyonu, yahut Komisyon adına faaliyet gösteren hiç bir şahıs, bu yayından yararlanılması
ve kullanılma biçimi ile ilgili herhangi bir sorumluluk taşımaz.
Avrupa birliği ile ilgili daha ayrıntılı bilgi Internet’de mevcuttur.Europa sunucusu üzerinde aşağıdaki
adresten temin edilinebilir
http://www.europa.eu
Luksemburg: Avrupa Birliği Resmi Yayınlar Dairesi
ISBN-978-92-79-13574-3
Avrupa Birliği, 2010
Kaynak göstererek çoğaltılabilir
Italya’da basılmıştır
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
III
EDİTÖRLER
Maddalena QUERCI
European Commission
Joint Research Centre
Institute for Health and Consumer Protection
Molecular Biology and Genomics Unit
Molecular Biology Scientific Area Coordinator
E-mail: [email protected]
Marco JERMINI
Repubblica e Cantone Ticino http://www.ti.ch
Dipartimento della sanità e della socialità
Divisione della salute pubblica
Laboratorio Cantonale - Bellinzona
Guy VAN DEN EEDE
European Commission
Head of Unit
Türkçe editör
Sadiye Birep AYGÜN
European Commission
Applied Molecular Biology Competence Group
IV
ÇEVİRENLER
Remziye YILMAZ, Dr.
Orta Doğu Teknik Üniversitesi
Merkezi Laboratuvar
Moleküler Biyoloji ve Biyoteknolji Ar-Ge Merkezi
E-posta: [email protected]
Füsun EYİDOĞAN, Dr.
Başkent Üniversitesi
Eğitim Bilimleri Fakültesi
M. Tufan ÖZ
Biyolojik Bilimler Bölümü
Meral YÜCEL, Dr.
Merkezi Laboratuvar
Moleküler Biyoloji ve Biyoteknolji Ar-Ge Merkezi
Hüseyin Avni ÖKTEM, Dr.
V
Önsöz
Avrupa Komisyonu Ortak Araştırma Merkezi (JRC) Sağlık ve Tüketiciyi Koruma
Enstitüsü (IHCP), Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Çevre ve Sağlık Avrupa Merkezi Roma Birimi’nin (ECR) Gıda Güvenliği Programı ile birlikte “Gıda Örneklerinde
Genetiği
Değiştirilmiş
Organizma
Analizleri”
üzerine
bir
dizi
eğitim
kursu
düzenlemiştir.
Ortak Araştırma Merkezi, üye ülke laboratuvarları ve Avrupa enstitü, organizasyon
ve işletmeleri ile iletişim ve AB Genel Yönetim Kurulu (EU Directorates General) ile
işbirliği içinde AB politikalarına bilimsel ve teknik destek vermektedir. WHO –
ECR’nin görevi çevre ve sağlık alanlarında hem karar verici mercilere, hem de
Avrupa vatandaşlarına tam ve düzenli bir şekilde destek vermektir. Bahsi geçen
eğitim kursları, AB sınırları içinde ve ötesinde, AB 'ne girmeye aday ülkeleri ve geçiş
ekonomisine sahip diğer ülkeleri de göz önünde tutarak, WHO Avrupa Bölgesi’nde
gıda güvenliği ile ilişkili konuların teşvik ve desteklenmesi için iki enstitü arasındaki
işbirliğinin bir parçasıdır.
Bu kurslar kapsamında , kontrol laboratuvarları personeline moleküler tanı
tekniklerine aşinalık kazandırmak, laboratuar tesislerinin ve çalışma programlarının
biyoteknoloji alanında dünya çapındaki düzenleyici yasalara uygun analizleri
içerecek şekilde düzenlenmesi ve uyarlamalar yapılmasına yardımcı olmak
hedeflenmektedir. Kurslar iyi bir analitik bilgi seviyesine sahip fakat bahsi geçen özel
alanda hiç ya da çok az bilgili laboratuvar personeline moleküler tanı tekniklerini
öğretmeye yönelik olarak tasarlanmıştır.
Ortak Araştırma Merkezi, GDO tanımlama ve miktar tayininde eğitim sağlama
konusunda kararlı bir irade ile sağladığı genel eğitim kurslarının yanı sıra geçmişte
olduğu gibi bugun de çeşitli ihtiyaçlar için özel eğitimler de sunmaktadır. Mevcut ve
gelişmekte olan AB yasama sistemine uygunluğa duyulan ihtiyaç ve bunun önemi
nedeniyle GDO tanımlama ve miktar tayini uzerine
edilmektedir.
eğitimler sıklıkla talep
VI
Biyoteknoloji ve GDO Birimi ( yenı adı ile Moleküler Biyoloji ve Genomik Birimi), yıllar
boyunca GDO tanımlama, miktar tayini ve ilgili alanlarda derin bir bilgi birikimi
geliştirmiş; tanımlama ve ölçüm için yöntemler geliştirmiş, uyarlamış , geçerliliklerini
onaylamış ve doğrulamıştır.
Bu tekniklere ait bilgi, yayınlar, ortak projeler, özel eğitimler ya da kurslar ile işbirliği
içinde bulunulan laboratuvarlara aktarılmıştır. Teknik detaylar kursiyerlere sözlü
sunumlar ya da kısa yazılı özetler olarak da sağlanmıştır. Kalıcı bilgi kaynağına
duyulan ihtiyacın farkındalığı ile
Molekuler Biyoloji ve Genomik birimi çalışanları
laboratuvarlarımızda kullanılan bazı teknikleri içeren bu el kitabını hazırlamışlardır.
Kurslar sırasında ele alınan alanlar şu şekildedir;
-
Ham ve işlenmiş materyallerden DNA izolasyonu
-
GDO varlığını tespit için gıdaların Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase
Chain Reaction, PCR) ve nested PCR ile taranması
-
Eş zamanlı (real-time) PCR ile GDO miktar tayini
-
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ile GDO miktar tayini
Bu el kitabı Ortak Araştırma Merkezi (JRC) Sağlık ve Tüketiciyi Koruma Enstitüsü
(IHCP) tarafindan kurs katılımcıları için temel bilgi kaynağı olarak hazırlanmıştır.
Günümüzde kullanılan metot ve yöntemlerle ilgili teorik ve deneysel bilgiyi sağlaması
amaçlanmıştır. Kitabın içeriği GDO tesbit, tanımlama, nitelendirme ve miktar tayini
için kullanılan bir çok tekniği kapsamakta ve GDO belirleme alanında çalışmayı
isteyen herhangi bir kişi için önemli temel bilgi olduğu düşünülen teorik bilgiyi
barındırmaktadır.
Umuyoruz ki bu kitabın yapı ve içeriği, kurs katılımcılarının (ve diğer tüm okur ve
kullanıcıların) kazandıkları becerileri ve edindikleri bilgileri, farklı çalışma ortamları ve
ihtiyaçlar doğrultusunda yayma ve dağıtmalarında yardımcı olacaktır.
Diğer kitap ve bilimsel dergilerde bulunan bilgiler ile herhangi bir biçimde rekabete
girmek hiç bir şekilde niyetimiz değildir. Bu el kitabı alanın uzman eserlerinde varolan
bilgiyi tamamlamayı amaçlamaktadır.
VII
Bilgiyi yayma ve danışmayı hızlandırmak ve kolaylaştırmak için bu yayın
adresinde
mevcuttur.
Bu el kitabının hazırlanmasına katılmış olan Ortak Araştırma Merkezi (JRC)
çalışanları Maddalena Querci tarafından gözetilerek denetlenmiş ve her biri
İçindekiler bölümünde katkıları doğrultusunda anılmıştır.
Bireysel olarak anılmış olmasalar da, bu el kitabının başarı ile hazırlanmasına
katkıda bulunmuş olan tüm Molekuler Biyoloji ve Genomik Birimi çalışanlarına da
burada özel takdir ve teşekkürler sunulmaktadır.
Ayrıca bu el kitabının düzeltme ve yenilenmesinde destek ve işbirlikleri için Sabrina
Miglierina, Elisabeth Dilger, Manuela Zingales, Stephen Langrell ve Steven Price’a
teşekkürler sunulmaktadır.
Maddalena Querci, Dr.
Kurs koordinatörü
Haziran 2004
VIII
Dünya Sağlık Örgütü’nden Giriş Niteliğindeki Görüş ve Açıklamalar
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) gıda üretimi ve işlenmesinde modern biyoteknolojinin
güvenli kullanımı ve uygulanmasına büyük öncelik vermektedir. Bu nedenle WHO
90’ların başından beri biyoteknolojik yöntemlerle elde edilen gıdaların güvenliği
konusunda uzman danışmanlığının organizasyonu alanında son derece etkin
olmuştur. Mayıs 2000’de, 53. Dünya Sağlık Toplantısı (53rd World Health Assembly)
WHO’nun, genetiği değiştirilmiş gıdalar ile ilgili sağlık konulu kararlarda, üye ülkelere
bilimsel temeller sağlama biçiminde destek olmasına karar vermiştir. Buna ek olarak
WHO Yönetim Kurulu ilgili konuların diğer kuruluşlarla işbirliği içinde araştırılması ve
çözümlenmesini öngörmüştür.
Codex Gıda Heyeti (Codex Alimentarius Commission, CAC) gıdalar konusunda
uluslararası
standartların
oluşturulması
için
kurulmuş
devletlerarası
bir
organizasyondur. Heyetin temel amacı tüketici sağlığını korumak ve gıda ticaretinde
doğru ve adil uygulamaları garanti etmektir. WHO, 1963’te kuruluşundan itibaren
Codex Heyetinin üst kuruluşlarından birisi olmuştur. WHO ve kardeş organizasyonu
BM (Birleşmiş Milletler, UN) Gıda ve Tarım Örgütü (FAO), Codex sistemi içerisinde
yer alan Codex Biyoteknoloji ile Üretilen Gıdalar Çalışma Kolu (Ad Hoc
Intergovernmental Codex Task Force on Foods Derived from Biotechnology), Codex
Gıda Etiketleme Komisyonu (Codex Committee on Food Labeling) ve Codex Analiz
Metotları ve Örneklendirme Komisyonu (Codex Committee for Methods of Analysis
and Sampling) ile çalışmaktadır.
Avrupa’daki WHO Gıda Güvenliği Programı, 2000 yılından itibaren gıdalarda
Genetiği Değiştirilmiş Organizma (GDO) saptama teknikleri üzerine eğitim kursları
düzenlenmesinde Avrupa Komisyonu Ortak Araştırma Merkezi (JRC) ile işbirliği
içinde olmuştur. Bu kursların amacı gıda kontrol laboratuvarı çalışanları için analitik
biyoteknoloji yöntem ve becerileri sağlamak ve Avrupa ve dünyada GDO saptama
için doğrulanmış ve onaylanmış yöntemlerin kullanılmasını teşvik etmek olmuştur.
Analiz ve örneklendirme için uygun metodlar, gıdaların doğru etiketlendirilmesi yolu
ile üretim süreçlerinde şeffaflığın arttırılması ve izlenebilirliğin hızlandırılması ve
IX
boylelikle
gıda güvenliği sistemlerinin kuvvetlendirilmesine katkıda bulunması
açısından esas ve temeldir. Bahsi geçen yöntemlere geniş çaplı erişim imkanı
vermek için JRC/WHO ortak eğitim kurslarında kullanılan eğitsel el kitabının sanal
ortamda (internet ortamında) yayınlanmasına karar verilmiştir. Bu kitapta sunulan
yöntemler Codex Analiz Metodları ve Örneklendirme Komisyonu tarafından dikkate
alınan yöntemler ile uyum içindedir.
Avrupa WHO Gıda Güvenliği Programı, GDO’lar konusunda dünya çapında tanınmış
bilimsel bir enstitü olan Avrupa Komisyonu Ortak Araştırma Merkezi (JRC) ile
işbirliğinin öneminin farkındadır ve gıdalarda GDO saptama yöntemleri alanında
kapasite arttırmaya yönelik etkinlikleri Avrupa ve diğer bölgelerde desteklemeye
devam edecektir.
Cristina Tirado, V.Dr., Dr.
Avrupa WHO Besin Güvenliği Programı Bölgesel Danışmanı
X
ÇEVİREN ÖNSÖZÜ
Günümüzde Genetiği Değiştirilmiş Organizma (GDO) kavramı bilim insanlarının yanı
sıra toplumun da sıklıkla kullandığı ve sorguladığı bir kavram olmuştur. Bu nedenle
GDO’ların belirlenmesi ve bu amaçla kullanılan analiz yöntemleri giderek artan bir
önem taşımaktadır. Türkiye’nin bu konudaki resmi politikası olası beklenmeyen
etkilere karşı biyolojik çeşitlilik, insan ve hayvan sağlığının korunmasının temel ilke
olmasını benimsemekle birlikte ulusal gereksinimler doğrultusunda şimdi ve gelecek
için modern biyoteknoloji ve elde edilen ürünlerden yararlanılması olarak resmi
otoriteler tarafından açıklanmıştır(?). Bu nedenle, ülkemizde bu konu ile ilgili yasal
düzenlemelerin oluşturulması ve yayımlanması süreci devam etmekle beraber,
analiz yöntemleri konusunda doğru ve anlaşılır bilgiye ulaşılması büyük önem
taşımaktadır. GDO’ların belirlenmesi konusunda altyapı imkanlarının iyileştirilmesi ve
Türkçe kaynak ihtiyacının giderilmesi öncelikle ele alınması gereken hususların
başında gelmektedir. Konuya olan ilgiyi arttırabilme ve ülkemizde GDO tayini
yapacak araştırmacılara ve resmi laboratuvarlara referans oluşturabilmek için bu
kaynağın Türkçe’ye çevrilmesinin faydalı olacağı düşünülmüştür.
Bu kitap, Avrupa Komisyonu Ortak Araştırma Merkezi (JRC) Sağlık ve Tüketiciyi
Koruma Enstitüsü (IHCP) ile Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Çevre ve Sağlık Avrupa
Merkezi Roma Birimi’nin (ECR) Gıda güvenliği Programı tarafından birlikte
düzenlenen “Gıda örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri” konulu
Çalıştay’da yapılan çalışmaları içermektedir. El kitabının içeriğinde, Genetiği
Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları Hakkında Genel Bilgi, DNA Ekstraksiyonu
ve Saflaştırılması, Agaroz Jel Elektroforezi, PCR ve ELISA teknikleri, GDO’ların nitel
ve nicel belirlenmesi ile ilgili bilgilerin yanısıra MON810 mısır, Bt-176 mısır ve
Roundup Ready Soya gibi transgenik hatlar ile ilgili örnek çalışmalar ve AB’de kabul
görmüş ve uygulanmakta olan standart protokoller bulunmaktadır.
Kitabın çevirisi sırasında hataları önlemek için gerekli özeni fazlası ile göstermiş
olmamıza
rağmen
çeviri
çalışmalarının
zorluğundan
kaynaklanan
çeşitli
hatalarımızın olabileceğini biliyoruz. Siz değerli kullanıcıların sözkonusu hataları fark
ettikçe tarafımıza bildirmeleri bu Türkçe kaynağın güncelleştirilmesi çalışmalarında
bizlere destak sağlayacaktır.
XI
Kitabın Türkçe olarak çevrilmesine gönüllü olduğumuzu bildirdikten sonra her
aşamada bizi manevi olarak destekleyen ve yayınlanmasını sağlayan Sayın
Maddalena Querci ve Sayın Guy Van den Eede ve onların nezdinde JRC IHCP
Moleküler Biyoloji ve Genombilim Ünitesi’ne teşekkür ederiz.
Kitabın ülkemizde bitki biyoteknolojisinin gelişmesine ve GDO’ların bilimsel bir
platformda değerlendirilmesine katkı sağlaması dileklerimizle.
XII
Eğitim Kursu
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma
Analizleri
KURS ELKİTABI
İÇİNDEKİLER
Bölüm
Başlık
Yazarlar
1
Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları
Hakkında Genel Bilgi
M. Querci, G. Van den Eede, M.
Jermini
2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs
Bilgileri
M. Querci
3
Kurs Sırasında Kullanılan Örnekler
M. Querci, N. Foti
4
DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması
M. Somma
5
Agaroz Jel Elektroforezi
M. Somma, M. Querci
6
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
M. Somma, M. Querci
7
MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready®
Soyanın Özellikleri
M. Querci, M. Mazzara
8
El kitabında tanımlanan Nitel PCR sistemlerinin
Özellikleri
9
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready
Soya’nın PCR ile Nitel Saptanması
M. Querci, M. Maretti,
M. Mazzara
10
GDO’ların Saptanması için Nicel PCR
F. Weighardt
11
Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real-Time)
PCR ile Nicel Saptanması
N. Foti
12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanması
F. Eyquem
Ek
Çalışma Programı Örneği
M. Querci
Gıda Örneklerinde
Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 1
Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları
Hakkında Genel Bilgi
M. Querci, G. Van den Eede, M. Jermini
Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları Hakkında Genel Bilgi
2
İçindekiler
Bölüm 1
Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları Hakkında Genel
Bilgi
Giriş
3 Bitkilerde genetik mühendisliği
4 AB Kanunları
5 Modern biyoteknoloji yaklaşımı ile üretilen gıdaların güvenlik ve etiketlendirilmesi - WHO
yaklaşımı
13 EK-1. GDO’ların pazarda yer alması ile ilgili belli kontrol programları ve ilgili etiketlendirmeyi
de içeren AB mevzuatı
17 Bölüm 1
3
Giriş
Dünyada belli bolgelerde yetistirilen genetiği değiştirilmiş tahıl hatları dışında, günümüzde
ekilmekte olan bütün tahıl ürünleri, zararlı hayvanlara direnç sağlamak veya daha önceki
yabani hallerinden daha kaliteli ya da farklı ürün üretebilmek için yoğun biçimde ıslah
edilerek geliştirilmistir. İnsanların kullanımı için bitkilerin ilk ıslahından beri süregelen bu tip
değişiklikler,ayni
türün uzun süreler boyunca iç çaprazlanmasi yahut aralarında üreme
bariyeri bulunmayan yakın türler arasi istenen özelliklerin (genlerin) aktarımını veya değiş
tokusunu içerir. Son yıllarda, sadece doğal olarak gen çaprazlaması mümkün olan yakın
türlerde değil doğada çaprazlanmaya karşı steril olan türlerde de gen değişimi yapmak
mümkün olmuştur. Bu amaçla kullanılan tekniklerden bazıları embriyo-kurtarma metodları, in
vitro – in vivo embryo kültürü, yumurta ve yumurtalık kültürleri, in vitro tozlaşma ve in vitro
fertilizasyondur. Buna ek olarak, mutasyonel değişiklikler, örneğin tohumların radyasyona
maruz bırakılması gibi yollarla da elde edilebilir.
Geleneksel hibridizasyon ve seçme prosedürlerinin bir takım zorlukları mevcuttur. Bunların
başında, ıslahçıların bütün bir genomu transfer ederek çaprazlamak yerine seçilmiş tek
özelliği transfer etmek istemesi gelmektedir. Ayrıca genetik olarak sabit çeşitlerin seçilimi ve
ayrımı çok yavaş bir işlemdir.
Bu tarz engellerin rekombinant DNA ve transformasyon teknolojileri kullanılarak aşılabileceği
görülmektedir. Genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) terimi, genetik materyali doğada
çaprazlama veya doğal rekombinasyon yolları dışında değişikliğe uğramış organizmaları
tanımlamak için kullanılmaktadır. GDO, kendi başına çoğalıp genetik materyalini transfer
edebilen biyolojik bir sistem olmalıdır.
Tahıllara uygulandığında bu terim, farklı türlerden gen ya da genlerin genetik mühendisliği
yöntemleri ile alıcı genomuna kalıcı olarak aktarıldığı ve birçok durumda aktarılan genlerin
protein sentezlediği bitkileri ifade eder. Birbiri ile ilişiksiz türler arasında gen aktarımı ve
onlardan fonksiyon elde etme işlemi genetik transformasyon olarak tanımlanır.
Avrupada deneysel amacli salınım bildirimleri incelendiginde en sık test edilen özelliklerin
herbisit toleransı, erkek sterilite/fertilite yenilemesi, Bt-kaynaklı böcek direnci, virüs direnci,
mantar direnci, ve nişasta biyosentezinin değişikliği olduğu görülmektedir (daha detaylı bilgi
için http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/).
Bölüm 1
4
Bitkilerde genetik mühendisliği
Bitki transformasyonu konusunda pek çok farklı yaklaşım olmakla birlikte, bitkilerde genetik
modifikasyon sağlamak için kullanılan için bir kac temel yöntem vardır. Bu teknolojilerden en
eskisi, 1980’lerde geliştirilmiş olup ilgilenilen genin alıcı bitkiye aktarılmasında bir bakteri
türünü (Agrobacterium tumefaciens) kullanmaktadır.
Agrobakter, 20. yüzyıl başlarından beri bilinen ve bitkilerde crown gall hastalığına sebep olan
bir mikro organizmadır. Doğada Agrobacterium tumefaciens, tümör oluşumuna sebep olan
(Ti) plazmidinden belirli bir DNA parçasını (T-DNA) enfekte olan hücrenin çekirdeğine
aktararak
alıcı genomuna kalıcı olarak entegre olup eşlenmesi ile tümör oluşturma
yeteneğine sahiptir. Aktarılan bu T-DNA parçasının her iki yanında transfer için cis element
sinyali olarak görev yapan 25 baz dizilik (bp) tekrarlar yer alır.
Bilim adamları, T-DNA sınırları arasına yerleştirilmiş herhangi bir yabancı DNA’nın bitki
hücrelerine transfer edilebilmesi avantajını kullanarak, normalde yer alan hastalığa sebep
olan genleri, aktarımı istenen özel DNA dizisi ile değiştirerek modifiye Agrobakter suşları
geliştirmislerdir.
Bitki biliminin gelişimiyle birlikte, Agrobakter yoluyla bitki hücrelerine gen transferinin
anlaşılması hakkında önemli gelişmeler kaydedilmiştir. Ancak doğada Agrobakter yalnızca
çift çenekli bitkileri enfekte etmektedir. Bu nedenle tahılları (tek çenekli) da içine alan
ekonomik önemi olan bitki uzun süre genetik manipulasyona ile erişilmez olarak kalmıştır.
Bunun için, polietilen glikol-yoluyla transfer, mikroenjeksiyon, protoplast ve sağlam hücre
elektroporasyonu ve gen silahı (gen bombardımanı) teknolojisi gibi alternatif direkt transfer
metodları geliştirilmiştir.
Ancak Agrobakter yoluyla gen transferinin direk gen transferi yöntemlerine göre önemli
avantajları vardır. Transgenin kopya sayısını azaltarak transgenin ko-supresyonu ve sabit
(kalıcı) olmaması ile ilgili problemleri azaltır. Her iki durumda da, hücreler (Agrobakterle
enfekte olanlar veya biolistik uygulananlar) yeni geni veya genleri taşıyan bitkilere rejenere
olurlar. Bu bitkiler test edilir, yogun bicimde cogaltilir ve nihayetinde , yeni nesil genetiği
değiştirilmiş bitki hatlarinin eldesi için tohum sağlar.
Bölüm 1
AB Kanunları
5
1,2
Genetik olarak değiştirilmiş organizmaların kullanımı – çevreye salınımı, ekimi, ithalatı ve
özellikle gıda ve gıda katkısı olarak kullanımı – Avrupa Birliği icinde titizlikle uygulanan bir
dizi işlemle düzenlenmiştir.
İlk hukuksal birlik dayanağı (Konsey Direktifi 90/220/EEC ve Konsey Direktifi 90/219/EEC)
1990’da insan ve hayvan sağlığını ve çevreyi korumak özel amacı ile oluşturulmuştur.
Günümüzde temel hukuksal birlik dayanağı, Avrupa Birliği içinde biyoteknoloji ile ilgili yatay
kanuni çerçeve olarak kabul gören ve GDO’ların onceden tasarlanmış olarak çevreye
salınımını da içeren
Avrupa parlementosunun ve Konseyinin 12 Mart 2001 tarihli
2001/18/EC Direktifidir.
Konsey Direktifi 2001/18/EC, Konsey Direktifi 90/220/EEC’yi
fesh ederek
GDO’ların
çevreye salınımı ile ilgili daha önceki kuralları kuvvetlendirmekte ve bu kapsamda çevresel
risk değerlendirme prensipleri, pazara salınımından sonraki zorunlu (cevresel) gözlemleme,
halkın bilgilendirilmesi zorunlulugu, pazara salınım için
bütün safhaların etiketleme ve
izlenebilirliği zorunlulugu ve moleküler kayıt envanterlerinin oluşturulması konularında yeni
prensipler getirmektedir.
Direktif 2001/18/EC , Konsey Direktifi 90/220/EEC altında varolan muvafakatnamelerin
uygunsuzluklardan kaçınmak için 2001/18/EC Direktifinin koşulları göz önünde tutularak
yenilenmesini gerektirmektedir.Muvafakat yayınlandığı günden itibaren 10 yıl süre için
geçerlidir. GDO yahut GDO içeren bir ürünün pazarda yer almasının ardından, muvafakat
basvurusunu yapmis olan taraf ( bildiren) muvafakat koşulları çerçevesinde pazara salınım
sonrası izleme ve raporlama ile mükelleftir.
Ulusal kanunlar kapsamında her üye ülkede uygulanan Direktif 2001/18/EC, hem küçük
ölçekli tarla denemeleri (deneysel amaçlar için gönüllü salınımlar, direktiftin B bölümü) hem
de GDO’ların pazarlama koşulları (direktifin C bölümü) ile ilgilidir. Tablo 1’de gösterildiği gibi
daha önceki 90/220/EEC prosedürü kapsaminda onay almış18 GDO bulunmaktadır(15’i bitki
kökenli, 3 tanesi icin üye ülkeler muvafakatı). Bu güne dek Direktif 2001/18/EC kapsamında
GDO’ların pazarda yer alması ile ilgili 25’den fazla muvafakiyet başvurusu yapılmıştır
(Dosyaların son durumu için http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/).
1
2
EK-1’de GDO’lar ile ilgili AB düzenlemelerinin detaylı olmayan tam listesine bakınız.
09.06.2004 statüsü
Bölüm 1
6
Tablo 1. 90/220/EEC Direktifi altında AB’de pazarlanması onaylanan genetik olarak
değiştirilmiş organizmalar
Ürün
Tebliğ
eden
Bildirilen ana özellik
Komisyon kararı
Sayı / Tarih
Karanfil
Florigene
Karanfil
Florigene
Karanfil
Florigene
Değiştirilmiş çiçek
rengi
ömrü
rengi
BtcryIA(b) geninin
ifadesi
Glufosinat amonyuma
tolerans ve BtcryIA(b)
geninin ifadesi
Glufosinat amonyuma
tolerans
Glufosinat amonyuma
tolerans
20.10.98 MS
muvafakat
20.10.98 MS
muvafakat
01/12.97 MS
muvafakat
98/294/EC 22
Nisan 1998
98/292/EC 22
Nisan 1998
Mısır
Mısır*
Mısır
İlkbahar
Swede
Kolza
Swede
Kolza
Swede
Kolza
Mısır
Steril erkek
hindiba**
Soya
Fasülyesi*
Swede
Kolza
Tütün
Hat
Zea mays L.
MON810
Zea mays L.
Monsanto
Zea mays L.
Hat T25
Brassica napus
L. ssp oleifera
AgrEvo
Brassica napus
L. oliefera
metzg, MS1,
RF1
Brassica napus
L. oliefera
metzg, MS1,
RF2
Zea mays L.
Hat Bt176
Cicharium
intybus L.
Glycine Max L.
Plant
Genetic
Systems
Glufosinat amonyuma
tolerans
97/393/EC
6,6,1997
Plant
Genetic
Systems
Glufosinat amonyuma
tolerans
97/392/EC
6.6.1997
CibaGeigy
Glufosinat amonyuma
tolerans
Glufosinat amonyuma
tolerans
Glifosinata tolerans
97/98/EC
23.1.1997
96/424/EC
20.5.1996
96/281/EC 3
Nisan 1996
96/158/EC 6.2.96
Brassica
napus. L.
oliefera Metzg.
MS1BnxRF1Bn
TB100x çeşit
Novartis
AgrEvo
Bejo-Zaden
BV
Monsanto
Plant
genetic
Systems
Glufosinat amonyuma
tolerans
SETTA
Bromoxynil toleransı
98/293/EC 22
Nisan 1998
98/291/EC 22
Nisan 1998
94/385/EC 8.6.94
*Avrupa Birliğinde ekimi onaylanmamıştır.
**Yanlızca tohum üretimi içindir.
Bölüm 1
7
‘Kardeş’ bir direktif genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların kapalı kullanımını kontrol eder
(26 Kasım 1998 tarihli 98/81/EC Konsey Direktifi, daha önce Konsey Direktifi 90/219/EEC ile
düzenlenen genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların kapalı kullanımına tashih).
Yukarıda bahsedilen direktiflere ek olarak, insan tüketimi için hedeflenen GDO’ların güvenli
kullanımı ve onayı ile ilgilenen bir dizi yatay hukuki dayanak yıllar boyunca uygulanmış ve
detaylandırılmıştır. Yakin bir zamana dek birlik içinde pazara yeni gıda ve yeni gıda
içeriklerinin sunulmasi, dikey kanuni çerçeve ile düzenlenmiştir. 258/97 nolu kanun (AB)
özellikle aşağıdaki durumlarda uygulanır:
-90/220/EEC Direktifi içinde GDO içeren yahut GDO olan gıda ve gıda içerikleri
-GDO’lardan üretilen fakat GDO içermeyen gıda ve gıda içerikleri
-Yeni ve-veya primer molekül yapısı ozellikle değiştirilmiş gıda ve gıda içerikleri
-Bakteri, mantar veya alg’den izole edilmiş ya da bunları içeren gıda ve gıda içerikleri
-Güvenilir gıda kullanımına sahip ve geleneksel ıslah veya üretim yöntemleri ile elde edilmiş
gıda ve gıda içerikleri dışında, hayvanlardan izole edilen gıda içerikleri ve bitkilerden izole
edilen gıda ve gıda içerikleri
-Gıdanın besin değeri, metabolizması veya istenmeyen maddelerin seviyesini etkileyebilecek
şekilde gıda ve gıda içeriklerinin yapısında önemli değişiklikler yaratabilecek bicimde, yaygın
olarak kullanılamayan yahut yeni üretim işlemleri uygulanmış gıda ve gıda içerikleri
Genetiği değiştirilmiş gıdaların etiketlenmesindeki özel konular birden fazla yasal dayanak ile
ele alınmıştır. Etiketleme ihtiyaçlarına ilk olarak 258/97(EC) kanununda (Orijinal Gıda
Kanunu) değinilmiştir. Fakat bazi GM mısır ve soya hatları ozel olarak Konsey Direktifi
1139/98(EC) ile etiketlendirilmişlerdir.
Esasında
bu
düzenlemesinden
iki GDO (Roundup Ready® soya ve Maximizer Mısır), 258/97(EC)
önce pazarda yer almış olup, bu GDO’lar için özel etiketleme
düzenlemesi sonradan 1139/98 Konsey Direktifi ile yapılmıştır.
258/97 Direktifi, gıda içeriği veya varolan gıdanın eşdeğeri olmayan gıda içeriği ya da yeni
gıda haline gelen besinlerin yaygın kullanımı veya besin değeri ya da içeriğinde değişiklik
yapılan gıdalardaki herhangi bir farklılığın son kullanıcı tarafından bilinmesini sağlamak
amacı ile geliştirişmiştir. Günümüzde, genetiği değiştirilmiş vakalardan üretilen 17 gıda ürünü
onaylanmış ve Avrupa Birliğinde resmi olarak satışa sunulabilmektedir (Tablo 2). Bunlardan
bir GD Soya ve bir GD Mısır, Orijinal Gıda Yasası zorunlu olmadan önce 90/220/EC direktifi
çerçevesinde onay almıştır. Diğerleri (7 GD Kolza ve 5 GD Mısır’dan türetilen işlenmiş gida
Bölüm 1
8
ve 2 GD Pamuk tohumundan üretilen yağ) Orijinal Gıda Direktifine uygun olarak tebliğ
edilmiş ve sadelestirilmiş prosedür ile onaylanmıstir.
1139/98 Konsey Direktifi, herhangi bir genetiği değiştirilmiş gıda veya gıda içeriğinde
genetik modifikasyon sonucu ortaya çıkan DNA veya protein belirlenebilir ise, bu ürünün
GDO olmayan eşdeğeri ile eşit kabul edilmediği prensibine dayanır. Katkı maddeleri,
Komisyon
Direktifi
50/2000
devreye
girene
dek
etiketleme
düzenlemesi
dışında
değerlendirilmiştir.
1139/98 Direktifi,
10 Ocak 2000 tarihli Komisyon düzenlemesi (EC) 49/2000 ile tashih
edilerek eşik kavramı tanımı getirilmiştir. Kasıtsız kontaminasyon probleminin üstesinden
gelmek icin konulan “eşik düzenlemesi” ile kanun iyileştirilmiştir. Bu yasa, gıda içeriğinde
GDO’dan elde edilen materyaller bulunan gıda ürünlerinde, her bir ayrı materyal için
%1’den fazla olmayacak oranda GDO taşıyan gıdalar için ek etiketleme zorunluluğu
olmadığını taahhüt eder.
Buna ek olarak, bu materyalin varlığının tesadüfi olduğunun ispatı için operatörler, GDO
kullanımından kaçınmak için gerekli tedbirlerin uygulandığının kanıtını sağlamak zorundadır.
GDO’lar ile ilgili çeşitli kullanıcı birliklerinin farklı ve çakışan görüşlere sahip olmasi, süreç
boyunca yayınlanan yasal dayanakların yorumlanması ve uygulanmasındakı
sıkıntılar,
diğerlerinin yanında genetiği değiştirilmiş yemler icin özel bir AB düzenlemesinin olmaması
gibi sebepler bu konuda birleştirilmis, güncellenmiş ve bütünsel yasal dayanaklara olan
ihtiyaca dikkat çekmiştir.
Sonuç olarak Ekim 2003’de daha önceki yasal dokümanları iptal edip iyileştiren ve daha açık
bilgi veren iki yeni düzenleme yayımlanmıştır.
Bölüm 1
9
Tablo 2. Avrupa Birliğinde onaylanan genetiği değiştirilmiş (GD) gıdalar 3
Vaka
Tahıl
Başvuran
Özellik
Potansiyel gıda
kullanımı
Tarih
Kanuni dayanak
1
GTS40/3/2
Soya
Monsanto
Böcek
koruma ve
herbisit
dayanıklılığı
Soya gıdaları, soya
içecekleri, tofu, soya
yağı, soya unu,
lesitin
03.04.1996
Dir. 90/220/EEC
Madde 13
2
Bt 176
Mısır
Ciba-Geigy
Böcek
koruma ve
herbisit
dayanıklılığı
Mısır gıdaları, tane
içeren mısır
gıdaları,mısır unu,
şeker, şurup
23.01.1997
Dir. 90/220/EEC
Madde 13
3
TOPAS 19/2
Kolza
AgrEvo
Herbisit
toleransı
24.06.1997
Reg(EC) 258/97
madde 5
4
MS/1/RF2
Kolza
Plant Genetic
Systems
Herbisit
toleransı
Kolza tohumu yağı,
kolza yağında
yapılan kızartmalar,
aperatifler
24.06.1997
Reg(EC) 258/97
madde 5
5
MS1/RF1
Kolza
Plant Genetic
Systems
Herbisit
toleransı
24.06.1997
Reg(EC) 258/97
madde 5
6
GT73
Kolza
Monsanto
Herbisit
toleransı
21.11.1997
Reg(EC) 258/97
madde 5
7
MON810
Mısır
Monsanto
Böcek direnci
06.02.1998
Reg(EC) 258/97
madde 5
8
T25
Mısır
Agr/Evo
Herbisit
toleransı
06.02.1998
Reg(EC) 258/97
madde 5
9
Bt11
Mısır
Novartis
Böcek direnci
06.02.1998
Reg(EC) 258/97
madde 5
10
MON809
Mısır
Pioneer
Böcek direnci
23.10.1998
Reg(EC) 258/97
madde 5
11
Falcon GS
40/90
Kolza
Hoechst /
AgrEvo
Herbisit
toleransı
08.11.1999
Reg(EC) 258/97
madde 5
12
Liberator L62
Kolza
Hoechst /
AgrEvo
Herbisit
toleransı
08.11.1999
Reg(EC) 258/97
madde 5
13
MS8/RF3
Kolza
Plant Genetic
Systems
Herbisit
toleransı
26.04.2000
Reg(EC) 258/97
madde 5
14
1445
Pamuk
Monsanto
Herbisit
toleransı
19.12.2002
Reg(EC) 258/97
madde 5
15
531
Pamuk
Monsanto
Böcek direnci
Pamuk yağı, pamuk
yağından yapılan
kızartmalar,
aperatifler
19.12.2002
Reg(EC) 258/97
madde 5
16
pRF69/pRF93
Bacillus
subtilis
F.Hoffmann La Roche
Riboflavin
Vitamin B2
23.03.2000
Reg(EC) 258/97
madde 5
17
Bt11
Mısır
Syngenta
Böcek direnci
Tatlı mısır
19.05.2004
Reg(EC) 258/97
madde 5
Mısır türevleri, mısır
yağı, mısır unu,
şeker ve şurup,
mısırdan yapılan
aperatifler,
fırınlanmış ya da
kızartılmış gıdalar,
şekerlemeler.
Kolza tohumu yağı,
kolza yağında
yapılan kızartmalar,
aperatifler
Kaynak Avrupa Komisyonu (http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm.- accessed
January 2010) Haziran 2004
3
Bölüm 1
10
Bu iki yeni düzenleme; genetiği değiştirilmiş gıda ve yem hakkında 22 Eylül 2003 tarihli
Konsey Avrupa Birliği Direktif (EC) 1829/2003 ve izlenebilirlik ve etiketleme ve GDO’lardan
üretilen gıda ve yem ürünlerinin izlenebilirliği ve iyileştirilen Direktif 2001/18/EC ile ilgili 22
Eylül 2003 tarihli Konsey Avrupa Birliği Direktifi 1830/2003’ tür.
1829/2003 (EC) Kanunda, güvenlik değerlendirmesi ile ilgili kurallar kuvvetlendirilmiş ve
genişletilmistir. Bu kanun, ilk defa GD yem ile ilgili özel kuralları belirler ve bugüne kadar
1139/98 ve 49/2000 (EC) komisyon düzenlemesinin içinde kapsanan GD gıda ve GD yem
için etiketleme ihtiyaçlarını kapsar.
Temel özellik olarak bu kanun “bir anahtar – bir kapı” yaklaşımını taşır. Tek bir yetki, hem
gıda hem de yem kullanımını kapsar. Böylece yem ürünlerinin “eşdeğerlik” kavramına dayalı
basitleştirilmiş prosedürü terk edilirken, yem ürünlerinin onayı durumunda ortaya çıkan yasal
boşluğu doldurur.
1829/2003 EC Kanunu altında (18 Nisan 2004’den itibaren zorunlu) onay için başvuran kişikurum, sorgulama altındaki vaka için bir tayin metodunu da içeren tam bir dosya sunmalıdır.
Dosya ve özellikle çevre ve gıda güvenliği risk değerlendirme bölümleri Avrupa Gıda
Güvenlik otoritesi tarafından değerlendirilir (28 Ocak 2002 tarihli Konsey ve Avrupa
parlamentosu 178/2002 Kanunu). Aday tarafından sunulan tayin yöntemleri AB Referans
Laboratuarları (1829/2003 Kanunu ile kurulan) tarafından değerlendirilir ve onaylanır.
Kanunda etiketlendirme için minimal seviye belirlenmiştir. 49/2000 Komisyon Düzenlemesi
kapsamında , resmi onayı bulunan bir GDO’nun tesadüfi varliği için belirlenen %1 sınır
seviyesi %0,9’a düşürülmüştür. Buna ek olarak, onaylanmamış GDO’ların tesadüfi
varlığında, ilgili bilimsel kurul(lar)ın olumlu görüş belirtmesi durumunda %0,5 sınır seviyesi,
geçici kural olarak belirlenmiştir.
AB, bilgilendirme ve etiketlemeyi, tüketicilerin bilgili tercih yapması için bir araç olarak
tanımlar. 1997’den itibaren bir ürünün GDO olduğu
veya ürün içinde GDO varlığının
etiketlendirilme ile belirtilmesi zorunludur.
1830/2003 (EC) Kanunu GDO gıdaların şu anki etiketlendirme kurallarını sağlamlaştırır.
Zorunlu etiketlendirme bütün gıda ve yemlerde, tayin edilebilirliğe bakılmaksızın genişletilmiş
ve izlenebilirlik tanımı, pazarda yer alan GDO, GDO’dan türetilen ve/veya GDO içeren tüm
ürünlerin üretim ve dağıtım zincirleri boyunca her aşamada izlenebilirliği olarak yeniden
düzenlenmiştir.
Bölüm 1
11
Dolayısıyla artık gıdalardaki GDO varlığını tayin eden yöntemlerin yanı sıra,her bir ozel GDO
vakasını tespit edebilen ve değişik gıda ve yem içeriklerindeki GDO miktarını belirleyen
yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır.
Gıda ürünlerinde nitel analiz, herhangi bir ürünün yahut içeriğinin GDO olup olmadığını tespit
için tarama amaçlı olarak uygulanabilir. Bu testler ile ürün muhteviyatında GDO’ya ait (DNA
ve/veya protein) varlığı tayin edilir. Bu analizler süpermarket raflarındaki ürünler, tedarikçi
stokları yahut satış zinciri boyunca herhangi bir noktada gerçekleştirilebilir.
Eğer nitel analiz GDO varlığını işaret ediyorsa, etiketleme zorunluluğu kapsamında karar
verilebilmesi için nicel testler yapılır.
Daha önce bahsedildiği gibi yasama işleminin yeni iç elemanı: Birlik Referans Laboratuarı
(European Union Reference Laboratory, EURL) resmi olarak sisteme girer. 1829/2003 (EC)
Kanun şartlarında Avrupa GDO laboratuarı ağı tarafından desteklenen Ortak Araştırma
Merkezi JRC (Joint Research Center) Gıda ve Yem’de Birlik Referans Laboratuarı (EURL)
olarak tayin edilmiştir (http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/). Bu laboratuarlar ihtilaf durumunda
teknik ve bilimsel yardım sağlamak ve mevzuat muvafakatı amacını sağlayacak analitik
yöntemleri değerlendirme ve onaylama vekaletine sahiptir.
Yasanın temel içeriği, hassas ve sağlıklı analiz yöntemleri bulunmasını gerektirmektedir. Bu
durum, AB’deki bütün GDO yürürlülük ve kontrol laboratuarlarında, analitik prosedür ve
performansları harmonize eden ve standart yaklaşımı garanti altına alan bilimsel araştırma
aktivitelerini gerektirir.
AB kontrol laboratuar prosedür ve performanslarının standartizasyonu ve harmonizasyonu,
JRC tarafindan bundan bir kaç sene önce kontrol mevzuatının herhangi bir aşamasının
başarısı için olmazsa olmaz olarak işaret edilmiştir.
JRC Sağlık ve Tüketici Koruma Enstitüsünün Molekuler Biyoloji ve Genomik Birimi, 1999’dan
beri GDO’lar ile ilgili konularda çalışan yetkili kontrol laboratuarlari arasinda zorunlu bir ağ
oluşturulmasını önermiş ve halihazırda da desteklemektedir.
Aralık 2002’den beri Avrupa Birliğinde resmi olarak GDO laboratuarları için zorunlu bir ağ
bulunmaktadır.
Bu
ağ
ENGL
(European
Network
of
GMO
Laboratories
http://engl.jrc.ec.europa.eu/) olarak adlandırılmıştır ve Avrupa Komisyonu (DG Joint
Bölüm 1
12
Research centre – JRC) tarafından koordine edilmekte ve AB uyesi tum ulkelerin yani sira
Isvicre ve Norvec de dahil olmak uzere kontrol laboratuarlarını temsil eden yaklaşık 100
laboratuarı içine almaktadır. Bu ağ için başkanlık ve genel sekreterlik görevleri JRC Sağlık
ve Tüketici Koruma Enstitüsünün bir birimi olan “Molekuler Biyoloji ve Genomik Birimi”nin
sorumluluğu altındadır. Amaç, GDO’ların – çevre örnekleri, gıda, yem ve tohumda –
örnekleme, tanı, belirleme ve ölçümü konularında
uzmanlaşmış birimler için ortak bir
platform yaratmak ve böylelikle

Nitel ve nicel analizler için yöntem geliştirilmesi

Moleküler biyoloji teknoloji transferi ve kapasite geliştirimi

Var olan GDO miktarlarının tespiti
veya çeşitli ortamlarda GDO taraması ve
varlığının tayini için uygun yöntemlerin yeterlilik ve geçerliliğinin sağlanması

Referans materyaller (Bu çalışma paketi için sorumluluk JRC Referans materyaller
ve Ölçümler Enstitüsünde bulunmaktadır.)

Farklı GDO hammaddeleri için örnekleme stratejileri ve prosedürleri (tohumlar,
tahıllar, ham materyal, son tüketici ürünleri, vb.)

Moleküler
verileri
içeren
veritabanlarının
kurulması
ve
GDO'ların
birim
tanımlaması için ihtiyaçlar ve veritabanı ve biyoinformatik yaklaşımları
gibi alanlarda ihtiyaçların belirlenmesi ve gderilmesi adına ortak bir tanım ve
tartışma zemini oluşturmaktır.
.
Network (ağ) aktiviteleri çerçevesinde
yukarıdaki hedeflere ulaşabilmek için en önemli
araçlardan biri de eğitim kurslarıdır.
Bölüm 1
13
Modern biyoteknoloji yaklaşımı ile üretilen gıdaların güvenlik ve
etiketlendirilmesi - WHO yaklaşımı 4
GDO’ların çevreye salınımı ve GDO iceren gıda ürünlerinin pazarda yer alması dünyanın bir
çok yerinde toplum tarafından tartışma konusudur. Biyoteknolojinin diğer yaygın kullanım
alanları
(örneğin
beşeri
ilaçlar)
ve
bunların
toplum
üzerinde
yarattığı
sonuçlar
düşünüldüğünde bu tartışmaların daha da kapsamlı olarak devam etmesi hayli muhtemeldir.
Tartışma altındaki konuların (maliyet ve yararlar, güvenlik konuları) oldukça benzer olmasına
rağmen, tartışmaların sonuçları ülkeden ülkeye değişmektedir. Günümüzde halen tüketici
kaygılarının giderilmesinin bir yolu olarak GDO gıdalarının etiketlendirilmesi ve izlenmesi
uzerine genelgeçer ortak bir karar yoktur. Bu durum son bir kaç yılda Codex Alimentarious
komisyonundaki tartışmalarla açığa çıkmıştır. Codex Alimentarius komisyonu (Codex;
http://www.codexalimentarius.net/web/index_en.jsp) FAO/WHO ortak
yapılanması olarak
(Codex Alimentrius’u oluşturan uluslararası gıda kodu) standartların derlenmesinden, pratik
kodlardan, rehberlerden ve tavsiyelerden sorumludur. Bu başlıklarda ortak görüş eksikliğine
rağmen, risk değerlendirmesi ile ilgili görüşlerin harmonizasyonu üzerinde önemli gelişmeler
sağlanmıştır. Codex uluslararası düzeyde daha kapsamlı bir anlayışla
pazara salınım
öncesi risk değerlendirmesi uzerine bir dizi prensibi benimsemek üzeredir. (Bakınız: Modern
biyoteknolojiden ile elde edilen gıdaların risk analizi prensipleri "Principles for the risk
analysis
of
foods
derived
from
modern
biotechnology"
CAC/GL
44-2003
ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_en.pdf).
Farklı GDO’lar, belli bir organizmaya farklı organizmalardan, değişik yollarla eklenen farklı
genleri içerir. Bu GD gıdaların ve güvenliğinin her vakada ayrı değerlendirilmesi gerekliliği ve
bütün GD gıdaların güvenliği hakkında genel değerlendirme yapmanın mümkün olmadığı
anlamına gelir. Dünya sağlık örgütüne göre şu anda uluslararası pazarda yer alan GD
gıdalar risk değerlendirmesinden geçmiştir ve insan sağlığı için bir risk taşıma ihtimalleri
muhtemelen yoktur. Buna ek olarak, GDO tüketimini onaylanan ülkelerde, geniş kitleler
tarafından bu tip gıdaların tüketilmesi sonucunda insan sağlığına herhangi bir olumsuz etkisi
gösterilmemiştir. Codex prensiplerine göre risk değerlendirmelerinin, (uygun olduğunda)
pazara salınım sonrası izlemeyi de içerecek biçimde daimi kullanımı, GD gıdaların
güvenliğinin değerlendirilmesinde temel oluşturmalıdır.
4
For exhaustive information on the activity of WHO and other UN agencies on Foods derived from
Modern Biotechnologies see http://www.who.int/foodsafety/en/
Bölüm 1
14
Biyoteknoloji yoluyla elde edilen gıdaların etiketlenmesi bizzat gıda güvenliği ile ilgili olabilir
veya olmayabilir. Her halükarda bu yaklaşım WHO tarafından gıda üretim işlemlerinin
şeffaflığının arttırılması için bir araç olarak görülmektedir. Etiketlendirme uygulamaları ulusal
gıda güvenlik programlarının geliştirilmesine katkıda bulunacak izlenebilirlik stratejilerinin
geliştirilmesini destekler ve böylece
dolaylı yoldan gıda güvenliğine olumlu katkı yapar.
Analiz ve örnekleme için uygun yöntemlerin olmasının önemi açıktır.
WHO biyoteknoloji yoluyla elde edilen gıdaların risk değerlendirme ve güvenliği için tavsiye
ve prensiplerin geliştirilmesinde aktif olarak yer alir. Çeşitli uzman konsultasyonları
sonucunda
geliştirilen
sonuçlar,
ulusal
seviyede
temel
rehberleri
oluşturmaktadır.
Günümüzde bu rehberler, uluslararası tanımlanan rehberlerle birleştirilmektedir. “Eş
değerlik” prensibine dayalı olan yaklaşım ilk nesil GDO’ların güvenlik değerlendirilmesi için
geliştirilmiş ve birçokları tarafından yeterli bir yaklaşım olarak bulunmuştur. Bununla beraber,
bu yaklaşım devam eden eleştirilerin konusudur. Güncel yaklaşım bu tartışmaları dikkate
almalı ve bilime dayalı düzenlemelerin ve ilerlemelerin geliştirilmesine katkıda bulunmalıdır.
FAO/WHO Genetiği değiştirilmiş gıda ve bitki güvenlik komisyonu uzmanları, 2000 yılındaki
kararlarında eş değerlik prensibinin, bir GDO ile doğal halinin benzerlik ve farklılıklarını
karşılaştırmak için kullanılabileceğini ifade etmiştir. Ayrıca eş değerlik prensibi kavramının,
başlı başına bir gıda güvenliği aşamasi yahut güvenlik değerlendirmesinin son basamağı
değil, kapsamlı sürecin ilk basamağı olarak görülmesi gerektigi görüşü ifade edilmistir.
(http://www.fao.org/ag/agn/food/risk_biotech_aspects_en.stm).
Yeni nesil GD gıdalar,hayli muhtemeldir ki geliştirilmiş besin değerine sahip olan tahıllar
olacaktır. Dolayısıyla doğal gıdalar ile fonksiyonel gıdalar yahut sağlık katkılı arasındaki fark
açılacaktır. Gelecekte gıda güvenliği değerlendirme stratejileri, yapilan genetik modifikasyon
sonucunda orataya cikacak daha karmaşık metabolik değişiklikleri göz önünde bulundurmak
zorunda
kalacaktır. Değerlendirmeler giderek artan biçimde, bir GDOlu gıda ürününün
gelişen ve gelişmekte olan ülkelerin farklı beslenme ihtiyaçları üzerindeki etkisini de dikkate
almayı gerektirecektir.
Halihazırda uygulamada olan hiç bir özel uluslararası düzenleme sistemi bulunmamaktadır.
Ancak, bir takım uluslararası organizasyonlar, GDO’lar için protokol geliştirilmesinde yer
almaktadır. Yukarıda bahsedildiği gibi Codex, GD gıdaların insan sağlığı açısından risk
analizleri için kullanılacak prensipleri geliştirmektedir. Bu prensiplerin öncülleri her bir vaka
icin ayri olarak yapılan pazara sunulum öncesi değerlendirmenin, aktarılan genin direkt
etkilerinin
yanısıra,
(yeni
beklenmeyen/öngörülmeyen
genin
etkilerin
de
aktarılması
icerilmesini
sonucu
gerektirir.
ortaya
Tam
çıkan)
olarak
Bölüm 1
15
benimsenmemekle beraber, geliştirilen pernsipler
ileri seviyededir. (Bakınız : Modern
biyoteknoloji ile elde edilen gıdaların risk analizi prensipleri (Principles for the risk analysis of
foods
derived
from
modern
biotechnology
CAC/GL
44-2003
ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_en.pdf).
Bunlar ve geliştirilmekte olan diğer Codex prensiplerinin (analiz ve örnekleme yöntemlerinin
prensipleri dahil olmak üzere) ulusal kanunlarla bağlayıcılığı yoktur. Fakat özel olarak Dunya
Ticaret Orgutu WTO (World Trade Organization)’nun sağlık ve bitki sağlığı anlaşması
içeriğinde yer almaktadır ve ticaret anlaşmazlıklarında referans olarak kullanılabilir.
Biyoteknolojik olarak üretilen gıdalar içinde 1999-2003 yılları arasında AdHoc hükümetler
arası Codex görev gücü (http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_codex_en.asp),
gıda etiketlenmesinde Codex komitesi ve analiz ve numunelendirme yöntemleri için Codex
komitesinde yapılan çalışmalar göz önüne alınarak, biyoteknolojik olarak elde edilen
gıdaların güvenlik değerlendirmesi için genel olarak kabul edilen rehberlerin geliştirilmesi,
risk iletişim konuları (etiketlendirme gibi) ve böylece uygun analiz yöntemlerinin geliştirilmesi,
WHO aktivitelerinin odağı olarak devam edecektir.
WHO bu nedenle biyoteknoloji yoluyla elde edilen gıdaların risk iletişim, risk yönetimi, ve risk
değerlendirmesi için prensip ve yöntem geliştirmek üzere uzman konsultasyonu belirlemeye
devam etmektedir (http://www.who.int/foodsafety/biotech/consult/en/). WHO, tanı yöntemleri
alanında, gelişmiş ve gelişmekte olan ülkeler arasında işbirliğini de koordine eder.
WHO içindeki Gıda Güvenlik Birimi, modern gıda biyoteknolojisinin insan sağlık ve gelişimi
üzerindeki etkisi hakkında kanıta dayalı bir çalışmayı sonuçlandırmak üzeredir. Bu calışma
kararı,
2000 yılı Mayıs ayında 53. Dünya Sağlık Kongresinde,
WHO’ya üye ülkelerin
modern gıda biyoteknolojisi hakkında kararlar için bilimsel temeller oluşturulmasını
desteklemek ve ortaya çıkan düşüncelerin şeffaf, doğru ve bağımsız olduğundan emin olmak
için kapasite arttırımı konularında WHO’nun daha etkin olması yolundaki ifadeler üzerine
alınmıştır.
Çalışma (http://www.who.int/foodsafety/biotech/who_study/en/index.html) WHO vekaletinde
varolan bilgiyi karşılaştırarak uygun bir biçimde analiz etmeyi ve
diğer uluslar arası
ajansların çabalarını tamamlamayı hedeflemektedir. İşlemdeki şeffaflığı arttırmak için WHO,
FAO ile işbirliği yapar ve diger paydaşları ve ilgili grupları süreçlere dahil eder.
Temel amaç üye ülkeler, uluslararası standardizasyon kurumları ve diğer paydaşlar için,
biyoteknoloji uygulama ve değerlendirmesi konularında kapsamlı görüş birliği ve şeffaflık
sağlamak üzere erişilebilir bir bilgi dayanağı oluşturmaktır. Sonuç olarak, WHO gelecekte
biyoteknolojinin bütünsel değerlendirmesi için kanıta dayalı alt yapı oluşturmayı istemektedir.
Bölüm 1
16
Bu çalışma modern gıda biyoteknolojisinin insan sağlığı ve gelişimine ne tür katkılar
sağlayabileceğini
belirlemeyi
amaçlamaktadır.
Modern
gıda
biyoteknolojisinin
mikroorganizma, bitki ve hayvanlarda uygulanmasını içermektedir. İnsan sağlığı ve gelişimi
için direkt ya da dolaylı olarak etkili anahtar konularını belirlemek ve mevcut bilgi ile geçerli
kanıt oluşturabilmek için bütünleştirilmiş yaklaşım benimsenmiştir.Kanıtlanmış bilgi istenen
ana konular:

Araştırma ve geliştirme

İnsan sağlığı üzerine etkiler (gıda güvenliği ve çevresel etkiler)

Gıda güvenliği,maliyet, teknolojiye erişim

Etik, yasal ve sosyal konular

Kapasite arttırma girişimleri
Veriler, Mayıs 2002’de yaygın literatür, internet ve paydaş ve uzmanları içerecek biçimde
derlenmiş kaynaklardan, 120 soruluk sorgulamaya dayalı araştırma yolu ile toplanmıştır.
Haziran ve Nisan 2003 tarihleri arasında elektronik paydaş tartışmasından alınan yorumlara,
5-6 Haziran Cenevre’de paydaş toplantısına katılan gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerin
hükümet temsilcileri, tüketici, endüstri, araştırmacı, ve sivil toplum örgütlerini de kapsayan
katılımcıların fikirleri de dahil edilmiştir.
Bu müzakere işleminden elde edilen rapor WHO tarafından modern biyoteknolojinin insan
sağlığı ve gelişiminde kullanımı ve uygulanması hususunda gelecekteki faaliyetleri
planlamak icin kullanılacaktır.
Bölüm 1
17
EK-1. GDO’ların pazarda yer alması ile ilgili kontrol programları ve
ilgili etiketlendirmeyi de içeren AB mevzuatı
GDO’ların çevreye kasıtlı salınımı ile ilgili Konsey Direktifi 90/220/EEC
(OJ L 117, 8.5.1990, p. 15)
Yürürlükten kaldırma:
Avrupa Parlamentosu ve 12 Mart 2001 tarihli GDO’ların çevreye salınımı ile ilgili
2001/18/EEC Direktifi, 90/220/EEC Konsey Direktifini yürürlükten kaldırmıştır
(OJ L. 106, 17.4.2001, p.1)
Genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların kullanımı hakkında 90/219/EEC 23 Nisan 1990
tarihli Konsey Direktifi
(OJ L 117, 8.5.1990, p.1)
Tashih:
26 Ekim 1998 tarihli Konsey Direktifi 98/81/EC, 90/219/EEC Direktifini iyileştirmiştir
(OJ L 330, 5.12.1998, p.13)
Avrupa Parlementosunun 258/97(EC) düzenlemesi ve orijinal gıda ve gıda içerikleri
hakkında 27 Ocak 1997 tarihli Konsey kararı
(OJ L 43, 14.2.1997, p.1)
Gıda güvenliği ile ilgili prosedürleri şart koşan ve Avrupa Gıda Güvenlik Otoritesini kuran,
gıda yasalarının ihtiyaç ve prensiplerini şart koşan 28 Ocak 2002 tarihli Konsey ve Avrupa
Parlementosunun 178/2002 (EC) Düzenlemesi
(OJ L 31, 1.2.2002, p. 1)
Direktif 79/112/EEC de sağlananlar dışında kalanlara, hususi genetiği değiştirilmiş
organizmalardan
elde edilen yiyecek maddelerinin etiketlenmesi zorunluluğu ile ilgili 26
Mayıs 1998 1139/98 Konsey Düzenlenmesi (EC)
(OJ L 159, 3.6.1998,p.4)
Yiyecek maddelerinin reklamı, tanıtımı ve etiketlenmesi ile ilgili üye ülkelerin kanunlarının
yaklaşımı hakkında 79/112/EEC Direktifi iyileştiren 27 Ocak 1997 tarihli Konsey ve Avrupa
Parlamentosunun 97/4/EC Direktifi
(OJ L 43, 14.2.1997, p.21)
Bölüm 1
18
Direktif 79/112/EEC ile ilgili olanlar dışında bazı gıda maddelerinin etiketlenmesi zorunluluğu
ile ilgili olan 94/54/EC Komisyon direktifini iyileştiren 29 Mart 1996 tarihli 96/21/EC komisyon
direktifi
(OJ L. 88,5.4.1996, p.5)
Direktif 79/112/EEC ile ilgili olanlar dışında bazı gıda maddelerinin etiketlenmesi zorunluluğu
ile ilgili olan 94/54/EC Komisyon Direktifi
(OJ L 300, 23.11.1994, p.14)
Direktif 79/112/EEC ile ilgili olanlar dışında GDO’lardan üretilen bazı yiyecek maddelerinin
etiketlenme zorunluluğu ile ilgili (EC) No 1139/98 nolu Konsey düzenlemesini iyileştiren 10
Ocak 2000 tarihli 49/2000 Komisyon Düzenlemesi (EC)
(OJ L. 006, 11.1.2000, p.13)
Genetiği değiştirilmiş veya genetiği değiştirilmiş organizmalardan üretilmiş tatlandırıcı veya
katkı maddelerini içeren gıda maddeleri ve içeriklerinin etiketlendirilmesi ile ilgili 10 Ocak
2000 tarihli 50/2000 Komisyon Düzenlemesi (EC)
(OJ L 006, 11.1.2000, p.15)
Gıda maddelerinin resmi kontrolü ile ilgili 14 Haziran 1989 tarihli 89/397/EEC Konsey
Direktifi
(OJ L 186,30,06,1989, p.23)
Gıda maddelerinin resmi kontrolü ile ilgili ek ölçümleri içeren 19 Ekim 1993 tarihli 93/99/EEC
Konsey Direktifi
(OJ L 290,24.11.1993, p. 14)
2002 için gıda içeriklerinin resmi kontrolü hakkında eşgüdümlü programı ile ilgili 25 Ocak
2002 tarihli Komisyon Tavsiyesi (2002/66/EC)
(OJ L 26,30.1.2002, p.8)
Genetiği değiştirilmiş gıda ve yem hakkında 22 Eylül 2003
tarihli konsey ve Avrupa
Parlamentosunun 1829/2003 (EC) Düzenlemesi
(OJ L 268, 18.10.2003, p.1)
Bölüm 1
19
Direktif 2001/18/EC iyileştiren ve genetiği değiştirilmiş organizmalardan üretilen gıda ve yem
ürünlerinin izlenebilirliği ve genetiği değiştirilmiş organizmaların etiketlemesi ve izlenebilirliği
ile ilgili 22 Eylül 2003 tarihli konsey ve Avrupa Parlamentosunun 1830/2003 (EC)
Düzenlemesi
( OJ L 268, 18.10.2003, p.24)
Olumlu risk değerlendirmesinden yararlanan genetiği değiştirilmiş materyalin teknik olarak
beklenmedik ya da zorunlu varlığı ve var olan ürünlerin bildirilmesi, genetiği değiştirilmiş yeni
gıda ve yem yetkisi için uygulama hakkında Konseyin ve Avrupa Parlamentosunun
1829/2003 No’lu Düzenlemesinin yerine getirilmesi için detaylı kuralların 6 Nisan 2004
641/2004 (EC) Komisyon Düzenlemesi
(OJ L 102,7.4.2004, p.14)
Yiyecek maddelerinin reklamı, tanıtımı ve etiketlenmesi ile ilgili üye ülkelerin kanunlarının
yaklaşımı hakkında 18 Ocak 1978 tarihli 79/112/EEC Direktifi
(OJ L 33,8.2.1979, p.1)
Genetiği değiştirilmiş organizmaların özgün belirleyicilerinin atanması ve geliştirilmesi için
sistem kurulması hakkında 14 Ocak 2004 tarihli 65/2004(EC) Komisyon Düzenlemesi
(OJ L 10, 16.1.2004, p.6)
Gıda ve Yem Yasası, Hayvan Sağlığı ve Hayvanlara iyi muamele kurallarına uygunluğu
denetlemek için yapılan yasal kontrollere ilişkin Avrupa parlamentosu ve Konseyinin 29
Nisan 2004 tarihli No.882/2004 Düzenlemesı (EC)
(OJ L 165, 30.4.2004, p.141)
Bölüm 1
Gıda Örneklerinde
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs
Bilgileri
M.Querci
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
2
İçindekiler
Bölüm 2
GDO’lar nasıl belirlenir?
3 DNA ve proteine dayalı yaklaşımların sınırları ve avantajları
4 El kitabının genel sunumu ve dikkat edilecek noktalar
7 Kaynaklar
11 Bölüm 2
3
GDO’lar nasıl belirlenir?
Daha önce de belirtildiği gibi transgenik bitkiler genomlarına yeni gen veya genlerin
eklenmesi ile karakterize edilirler. Aktarılan bu yeni gen ile yeni bir protein ifade edilir.
Bu da bitkiye bazı böceklere ve/veya yabancı otlara direnç gibi yeni bir özellık
kazandırı. GDO tanı teknolojisinin temelini değiştirilmemiş çeşit ile transgenik bitki
arasındaki bu farkın kullanılması oluşturur. Bu işlem aktarılan yeni DNA’nın veya
ifade edilen yeni proteinin belirlenmesi, yahut (eğer enzim ise) enzimatik
reaksiyonların ürününü tespit etmek için kimyasal analiz yöntemleri kullanılması yolu
ile olur.
Günümüzde mısır, soya, pamuk gibi tarla bitkilerinde genetik modifikasyonların
belirlenmesi için iki bilimsel yaklaşım kullanılmaktadır. Birincisi, ELISA (Enzyme
linked immuno sorbent assay) antijen ve antikor
arasındaki bağlanma özelliğini
kullanarak özel proteinlerin varlığını test eder, diğeri PCR (Polymerase Chain
Reaction), tahıla aktarılmış olan DNA sekanslarının belirlenmesine dayanır. Bu
yöntemler örnekteki miktar (yüzde) hakkında bilgi verebilir. AB’de geçerliliği
onaylanan ilk yöntem, pazara sunum için onaylanan birçok GDO’nun tespit
edilebildiğii PCR’a dayalı tayin yöntemidir (Lipp ve ark. 1999).
Pietsch ve ark. (1997) tarafından geliştirilen bu metot, aktarılan genin konakçı
organizmada işlevselliği için gerekli olan 35S promotor ve nos terminatör kontrol
tayinine dayanır. Yöntem geçerliliği IHCP (JRC)’nin Gıda Üretimi ve Tüketici Malları
Birimi (Food Products and Consumer Goods Unit) tarafından uygun sertifikalı
referans materyallerinin üretiminden sorumlu olan JRC, IRMM (Referans Materyaller
ve Ölçümler Enstitüsü) ile işbirliği ile koordine edilmiştir.
Yukarıda
bahsedildiği
gibi
araştırmalar
ayrıca
proteine
dayalı
yöntemlerin
geliştirilmesine de yönelmiştir. Roundup Ready® soyanın tayininde hassasiyeti
yüksek, ELISA tabanlı bir yöntem kullanılması geçerlilik onayı almış olup (Lipp ve
ark.
2000)
diğer
yöntemler
de
geliştirilmiştir
(http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm).
Bölüm 2
4
DNA ve proteine dayalı yaklaşımların sınırları ve avantajları
DNA’ya dayalı yaklaşım
PCR teknolojisine dayalı analitik yöntemler GDO’larda bulunan DNA sekanslarının
tayininde artarak kullanılmaktadır.
PCR, diğer DNA sekansları ile karışık olan ve düşük miktarlarda bulunan özel DNA
parçalarının seçici olarak çoğaltılmasına izin verir. PCR reaksiyonun başlangıcı için
gerekli olan küçük tamamlayıcı DNA parçaları primer olarak adlandırılır ve çift olarak
kullanılır. Bu primerler ilgilenilen genin zıt dizilerine bağlanmak üzere düzenlenirler (5’
ve 3’). Böylece birçok döngü boyunca primerler arasındaki sekans özel bir DNA
polimeraz tarafından kopyalanarak çoğaltır. Bu çoğaltılan parçalar elektroforeze tabi
tutulur, böylece varlıkları ve boyutları belirlenebilir.
Tarımsal gıda ve yemlik tahıllarda da GDO’nun belirlenmesi ve ölçülmesini sağlayan
bir çok PCR’a dayalı yöntem geliştirilmiştir. Buna ek olarak, genetik kimliğin
tanımlanması, GDO tahılların destek zinciri (üreticiden tüketiciye) boyunca
ayrılabilmesine ve izlenebilirliğine olanak sağlar.
GDO tayini için önşart, gerçekleştirilmiş olan genetik modifikasyon(lar)un türü
hakkında, kullanılan promotör ve terminatörü de içine alacak biçimde aktarılan genin
moleküler oluşumu üzerine sahip olunan bilgidir. Analiz, hedef geni de kapsayan
bütün DNA’yı içeren minimum miktarda örnek materyal ile yapılır.
PCR, eğitimli eleman ve özel ekipman gerektiren laboratuvara dayalı hassas bir
tekniktir.
PCR’a dayalı tanının bazı ana özellikleri aşağıdaki gibidir:

Bir organizmanın tüm genetik materyali ya da genomunda, araştırılan genin
bir ya da birkaç kopyasını tespit edebilecek kadar hassas olabilir.

Bu yüksek hassasiyetin sonucu olarak, dikkatsizlik sonucu meydana gelen
çok düşük seviyelerdeki kontaminasyon dahi yanlış pozitif sonuç verebilir. Bu
nedenle çapraz kontaminasyonu önlemek için çok dikkat edilmelidir.

İmmunolojik
analizlerle
kıyasla
(primer
sentezi
ile
antikor
üretimi
karşılaştırıldığında) çok daha kısa bir kimyasal hazırlık süresi gerektirir.
Bölüm 2

5
Analiz için gerekli olan kimyasalların hemen hepsi ticari olarak mevcut olup,
bir çok kaynaktan kolayca temin edilebilmektedir. Ancak bunların bazıları,
tanısal kullanım için lisans gerektirmektedir.

Numune analizi yaklaşık bir gün sürmektedir.

Uygun şekilde geliştirilirse PCR, farklı genetik modifikasyon tipleri (transgenik
hat olarak da tanımlanır) arasında ayrım yapabilme özelliğine sahiptir. Özel
transgenik hatların tanımlanması için var olan tanı yöntemleri ekstra bir
geliştirme süreci ve geçerlilik çabasını gerektirir.
Proteine dayalı yaklaşım
Proteine dayalı yaklaşım, ilgi duyulan proteine karşı geliştirilmiş özel antikorlar
kullanır. ELISA özel olarak, yahut diğer benzer olmayan proteinlerin de bulunduğu
örnekte, ilgi duyulan proteini belirler veya ölçer. ELISA yöntemi özel bir proteine
bağlanması için bir antikor, tespiti çoğaltabilmek için ikinci bir antikor (tercihe bağlı)
ve ilgilenilen protein standardı ile karşılaştırılarak, reaksiyonun sonucunu bir renk
ürünü olarak ölçebileceğimiz, antikora bağlı bir enzim kullanır.
Testin doğru biçimde yapılabilmesi için eğitilmiş personel ve özel ekipman
gerekmektedir.
ELISA analizinin anahtar özellikleri;

PCR’dan daha az hassastır, bu nedenle, düşük seviyelerdeki kontaminasyon
sonucu oluşan “yanlış pozitif” sonuçlarla PCR’a nazaran daha nadiren
karşılaşılır.

Analiz geliştirilmesi ve antikor ve protein standartları oluşturmanın yüksek ön
maliyeti vardır.

Kimyasallar geliştirildikten sonra örnek başına maliyeti düşüktür.

Aynı protein özelliğini gösteren farklı transgenik vakalar arasında farkı ayırt
edemeyebilir.

Proteine dayalı yöntemler kimyasallar ve yöntem gelişimi için önemli bir ön
hazırlık zamanı gerektirir.

Proteine dayalı testler, ölçülebilir bir protein üretildiğinde pratik ve etkili bir
analiz yöntemidir. Ancak genetik olarak değiştirilmiş ürünler yalnızca bazı
gelişim safhalarında veya belli bitki bölümlerinde üretilirler ve bunları ELISA
ile kolayca ölçmek mümkün olmayabilir.
Bölüm 2

6
Buna ek olarak, özellikle endüstriyel işlemler proteinlerin kolayca bozulmasına
sebep olabilir ve bu nedenle işlenmiş gıdalarda ELISA yöntemini kullanmak
problemli olabilir.
Bu noktalar düşünüldüğünde ELISA ve PCR
ayrı ve biri diğerinin yerine geçer
yaklaşımlar olarak değil, birbirini tamamlayıcı yöntemler olarak dikkate alınmalıdır.
Tablo 1. ELISA ve PCR yöntemlerinin karşılaştırılması
Yöntem
Test
yapılan
molekül
Süre
Kullanım kolaylığı
Sonuçlar
ELISA
Protein
2-8
saat
Orta; laboratuar bilgisi
gerektirir; testler
tahıla ve çeşide
özeldir
Özel genetik modifikasyonu
tespit edebilir, test numunesinde
GDO için nicel tayin yapmak
mümkündür
PCR
DNA
1-3
gün
Zor; özelleşmiş alet
ve eğitim gerektirir
Çok hassas, yanlış pozitiflere
maruz kalabilir; GDO DNA’nın
varlığını tespit eder, test
numunesinde GDO için nicel
tayin yapmak mümkündür
Bölüm 2
7
El kitabının genel sunumu ve dikkat edilecek noktalar
Yöntem geçerliliği hem laboratuvar hem de kontrol otoriteleri açısından kritiktir.
İdealinde, performans doğrulama amaçlı olarak, her yöntem hassas, tekrarlanabilir
ve hedefe özel sonuçlar sağlamak açısından, sınırlı sayıda deneyimli laboratuarlarca
onaylanmalıdır. AB’nin JRC birimi ilk olarak
Roundup Ready® soya içeren
işlenmemiş materyal için ELISA ve PCR yöntemlerine, Maximizer mısır (Bt-176) için
PCR yöntemine ve işlenmiş gıdada Bt-176 ve Roundup Ready® için PCR yöntemine
geçerlilik onayı vermiştir (Lipp ve ark. 1999, 2000, 2001). O zamandan beri, hem nitel
hem de nicel analizler geliştirilmiş ve onaylanmıştır (GDO tayini ve ölçümü için
onaylanmış
yöntemler
hakkında
son
bilgi
için
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm). Gerek DNA’ya, gerekse
de proteine dayalı yöntemlerde GDO belirleme ve miktar ölçme işlemleri için örnek
hazırlama aşaması kritiktir. İlgilenilen soruna bağlı olarak (örn. nitel veya nicel) her
prosedürün sınırlarını bilmek önemlidir. Hem örnek boyutu, hem de örnekleme
işlemleri herhangi bir test yönteminden elde edilecek sonuçlar üzerinde büyük etkiye
sahiptir.
Uygun sertifikalı referans materyallerinin (RM) bulunabilirliği her tayin yöntemi için
temel gerekliliktir. Bu kursta kullanılan referans materyaller JRC IRMM’de üretilmiştir
(Trapmann ve ark. 2002 ve 2001). RM özellikleri ve sertifikaları Bölüm 3’de
verilmiştir. Örnek homojenizasyonu kurs kapsamında yer almamakla beraber önemli
bir işlemdir.
Şekil 1. Kurs sürecinde gerçekleştirilen farklı analiz basamaklarını özetlemektedir.
DNA izolasyonunun optimize edilmesi, PCR ile çoğaltılmaya uygun DNA’nın kalitesi
ve varlığı için temel işlemdir. Bu konu, özellikle marketteki bir çok gıda ürünü,
endüstriuel olarak işlenmiş soya ve mısırdan türetildiği için çok önemlidir. DNA
gıdanın işlenmesi esnasında, özellikle suyun varlığındaki ısıl işlemler sebebi ile
parçalanabilir. Böylece gıdadaki GDO’ ların varlığının belirlenmesine izin verecek
kadar uzun olan DNA parçalarının miktarı( araştırmaya konu olan yeni gen diziliminin
tamamını içerene), gıda işlendikçe azalabilir. Ek olarak, uygun DNA izolasyonu,
örnekte bulunan önleyici maddelerin ortamdan ayrıştırılmasına olanak vermelidir. Bu
konudan
Bölüm
4’de
bahsedilecektir.
DNA
izolasyonu
için
farklı
metotlar
geliştirilmiştir. Bir çok ticari şirket tarafından özel kullanıma hazır kitler de piyasa da
mevcuttur. Farklı uygun protokollerin performans ve geçerliliği kurs esnasında
Bölüm 2
8
tartışılacaktır. Ancak ticari şirketler ile ilişiklendirilmemek için,farklı örneklerde
uygunluğu gösterilmiş, geçerli ve çok yönlü ir protokol olan CTAB metodu DNA
izolasyonu için kullanılmıştır.
DNA izolasyonundan sonra örnekler (ve PCR ürünleri) agaroz jel elektroforezi ile
analiz edilir (Bölüm 5). PCR yönteminin prensipleri , avantajları ve zorluklarından
Bölüm 6’da bahsedilmiştir.
Yukarıda belirtildiği gibi, GDO tayini için modern tekniklerin etkili kullanımı, yeterli
bilginin varlığına bağlıdır. GDO tayini, genetik modifikasyonun tipi ve hedef gen
sekansı hakkında en azından kısmi bilgi de gerektirir. Transgenik hatlar MON810
mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready® soyanın özellikleri Bölüm 7’de verilmiştir.
Onaylanmış GDO’ların tayininde farklı PCR yaklaşımları geliştirilmiştir. PCR
hassasiyeti doğru primerlerin seçilmesine dayanır. PCR primerleri, transformasyon
işleminde kullanılan farklı genetik elementlere yönlendirilebilir. “Genel kapsamlı” PCR
tayin
sistemleri
–
genellikle
“tarama
yöntemleri”
olarak
adlandırılır
–
transformasyonda en sıklıkla kullanılan ortak sekanslara özel primerlerin dizaynı ile
elde edilebilir. Bunlar genellikle promotör ve terminatör gibi düzenleyici sekanslardır.
Genetik olarak değiştirilmiş bitkiler, aktarılan yapısal gene göre kategorize edilebilir.
Reaksiyon hassasiyetini yönlendirmenin diğer bir yolu, değişik genetik elementlerdeki
yerleşmiş DNA sekanslarına özel (promotor-yapısal gen, yapısal gen-terminatör)
primerler seçmektir. Özel ve tam sekans bilgisi varlığında ise, genetik olarak
değiştirilmiş bitki için gerçekten özel analiz metotları geliştirmek mümkün olur.
Yalnızca bu özel hatta bulunan “özgün” bir sekans kombinasyonu seçme yolu ile bu
hatta özel analiz yöntemleri geliştirilebilir. Bu genellikle entegre edilen yabancı DNA
ile konak DNA arasındaki birleşme bölgesini boydan boya kapsayan DNA dizilimine
karşılık gelen bir primer geliştirilerek elde edilir. Eklenen DNA (T-DNA) ile konak-DNA
arasındaki birleşme bölgesi, oldukça hassas PCR testi için ideal bir hedef sağlayan,
gerçekten özgün bir nukleotid sekansıdır.
Kurs boyunca uygulanan metotlar Şekil 1’de özetlenmiştir. Bölüm 8’de detaylı bir
biçimde açıklanacaktır. Metotların deneysel kısımları ve protokoller Bölüm 9’da
bulunabilir.
Yukarıda belirtildiği gibi numunede GDO varlığının nicel tespitine duyulan ihtiyaç,
yalnızca nitel cevaba (varlığı/yokluğu) değil, verilen numunede GDO varlığının
göreceli ölçümün az veya çok hassas göstergesine (seçilen metoda bağlı olarak) izin
Bölüm 2
9
veren bir çok PCR’a dayalı yöntemin geliştirilmesine neden olmuştur. En sıklıkla
kullanılan DNA’ya dayalı iki yaklaşım karşılaştırmalı PCR ve real-time PCR’dır
(Bölüm 10).
Real time PCR halihazırda sadece bir kaç ticari şirket tarafından üretilen çok özel ve
karmaşık bir cihaz kullanılarak yapılır. Kurs süresince takip edilecek protokoller
Bölüm 11’de bulunabilir.
Son olarak, Bölüm 12’de , genetik olarak değiştirilmiş organizmaların varlığının tespiti
için serolojik yaklaşım hakkında genel bilgi verilerek özellikle ELISA tekniği
anlatılacak ve Roundup Ready® özel ELISA testinin protokolü sağlanacaktır.
Bölüm 2
10
Örnekleme
Homojenizasyon
Kurs sırasında
uygulanmayacaktır.
İşlenmiş ve
işlenmememiş
materyaller
DNA ekstraksiyonu
Bitki DNA’sının PCR ile kontrolü
+
-
Bitki DNA’sı
saptandı
Bitki DNA’sı
saptanamadı
PCR ile tarama
+
GD bitki
Soya için lektin-PCR
ve mısır için zein-PCR
Düzenleyici elementlerin
saptanması (35S promotör
ve nos terminatör)
GD olmayan bitki
GD bitkiyi
nested PCR ile
tanımlama
GD bitkiyi
ELISA ile
tanımlama
Spektrofotometre ile
DNA miktarının
belirlenmesi
Real-time PCR ile
GD miktar
tayini
Şekil 1. Kurs sırasında uygulanacak yöntemler için iş akış şeması
Bölüm 2
11
Kaynaklar
Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an Immunoassay for
detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food
fractions using reference materials: Interlaboratory study. Journal of AOAC
International 83, 919-927.
Lpp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and
Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction
for the detection of genetically modified organisms in various processed
foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.
Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J., and Anklam,E. (1999). IUPAC
collaborative trial study of a method to detect genetically modified soybeans and
maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923-928.
Pietsch, K., Waiblinger, H.U., Brodmann, P., and Wurz, A. (1997). ScreeningVerfahren zur Identifizierung “gentechnisch veranderter” plfanzlicher Lebenmittel.
Deutsche Lebensmittel Rundschau 93, 35-38.
Trapmann, S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,
Le Guern, L., Kramer, G.N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.
Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M and Anklam, E.
(2002). The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with
different mass fractions of Roundup Ready TM soya. Certified Reference Materials
IRMM-410S.
(https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta
chements/ERM-BF410_report.pdf) (accessed January 2010)
Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G.N., Schimmel, H.,
Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, and Anklam, E. (2002). The certification
of reference materials of dry-mixed maize powder with different mass fractions of
MON810
maize.
Certified
Reference
Materials
IRMM-413.
Bölüm 2
Gıda Örneklerinde
Bölüm 3
M. Querci, N. Foti
2
İçindekiler
Bölüm 3
Kurs sırasında kullanılan örnekler
3 Sertifikalı referans materyal
3 Ham ve işlenmiş materyallerin kompozisyonu
4 Kurs sırasında kullanılan örneklerin listesi
6 Beklenen PCR sonuçları
6 Kaynaklar
7 Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 3
3
Kurs sırasında kullanılan örnekler
Kurs sırasında farklı materyallerde MON810 mısır ve Roundup Ready® Soya
varlığını saptamak için değişik yöntemler test edilecektir. Bu amaçla, farklı
konsantrasyonlarda GD içermeyen örnekler ile GD mısır (MON810) veya soya
(Roundup Ready® soya) karışımları kullanılacaktır.
İki tip materyal kullanılacaktır:
Sertifikalı Referans Materyaller
Farklı ham ve işlenmiş materyaller
Sertifikalı referans materyal
Kurs sırasında kullanılan ham bitki materyalleri, Sertifikalı Referans Materyaller
(SRM) olan IRMM-410S (Roundup Ready® Soya) ve IRMM-413 (Mon810 Mısır)’tür.
IRMM-410S ve IRMM-413 farklı kütle fraksiyonlarında (% 0; 0,1; 0,5; 1; 2; 5) genetik
modifiye Roundup Ready® soya ve MON810 mısır içerecek şekilde toz formda
hazırlanmış iki set soya ve mısır SRM’lerdir. Bu SRM’ler, Fluka Chemie AG (Buchs,
Switzarland)
adına
Referans
Materyaller
ve
Ölçüm
Enstitüsü
(IRMM
–
http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm) tarafından Avrupa Komisyonu Ortak
Araştırma Merkezi’nin (Eu JRC Ispra, Italy) bir kolu olan Sağlık ve Tüketiciyi Koruma
Enstitüsü (IHCP – http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/) işbirliğiyle hazırlanmıştır (Trapmann
ve ark., 2002 ve 2001). Bu SRM’ler genetik modifiye gıdaların tespitinde kullanılan
metotların geçerliliğini denetlemek için kullanılır. DNA ve/veya protein miktar
tayini,türüne bağlı olarak değişebildiğinden, SRM’lerden biri veya daha fazlası,
bilinmeyen örneklerin ölçümünden miktar tayini sonuçları oluşturulması için
denemeye alınmak zorundadır. DNA ve/veya protein miktarı farklı türlerde (hatlarda)
değişkenlik gösterebildiği için bilinmeyen örneklerden miktar tayini yaparken çok
dikkatli olunmalıdır.
GD Roundup Ready® soya içeren toz formda soya, modifiye olmayan bir soya hattı
(Asgrow A1900) ile genetik modifiye Event 40-3-2 Roundup Ready® soya (Asgrow
AG5602 RR)’nın tohumlarından üretilmiştir. GD MON810 mısır içeren toz formda
mısır, modifiye olmayan çeşit DK512 ile MON810 DK513’ün mısır tanelerinden
üretimiştir.
Bölüm 3
4
Ham ve işlenmiş materyallerin kompozisyonu
Farklı materyaller test edilecektir: Bisküvi, süt tozu, aperatif gıda, un.
Ham Materyaller
Karışık Un: Her bir GDO’yu temsilen kuru ağırlık üzerinden %0,5 oranı elde
edebilmek için %1 RR soyaya (IRMM-410S) %1 MON810 (IRMM-413) eklenmiştir.
Her iki undan 50 mg tartılmış ve DNA ekstraksiyonu için reaksiyon tüpüne direkt
olarak eklenmiştir. %1’lik MON810 un IRMM-413 Sertifikalı Referans Materyaldir (%1
MON810 mısır).
Aperatif Gıda
Bu örnek bir GDO yeterlilik testinden (GeMMA Scheme, Round 06, test materyali
GMO-06B) alınmıştır. Test materyali, ticari olarak kullanılan GD içermeyen soya bazlı
aperatif gıda ve GD içerikli soya aperatif gıdadan hazırlanmıştır.
Aperatif Gıda
1372 g GD içermeyen soya, 28 g GD soya
Karıştırmadan önce, iki materyal homojenize kırıntı karışımını elde etmek için
öğütülmüş, elenmiş ve sonra bir gece boyunca karıştırılmıştır . Son olarak,
materyaller yaklaşık bir saat karıştırıcı kullanılarak harmanlanmıştır. Materyaller 20°C’de depolanmıştır.
Bisküvi
Materyal, Ortak Araştırma Merkezi, Sağlık ve Tüketiciyi Koruma Enstitüsü’nde
üretilmiş ve işlenmiş gıdalardaki Roundup Ready® soya ve Maximizer mısır (Bt-176)
için bir PCR yöntemini onaylamak için kullanılmıştır (Lipp ve ark., 2001).
Kuru soya ve mısırdan elde edilen un tartılmış ve aşağıda verilen malzemelerle
karıştırılmıştır.
Bisküvi  1
250 g mısır (%0 GDO), 250 g soya (%0 GDO), 300 g
buğday, 200 g şeker, 100 g tereyağ, 10 g tuz, 16 g
vanilin, 2 yumurta.
Bölüm 3
5
Malzemeler, 600 ml oda sıcaklığında su ile dikkatlice karıştırılmış, homojenize edilmiş
ve pişirme kabına eşit olarak yayılmıştır. Önceden ısıtılan fırında 180°C’de 10 dakika
pişirilmiştir. Materyal fırından çıkarılmış, kontaminasyona karşı korumak için örtülmüş
ve takiben oda sıcaklığında soğutulmuştur. Depolama -20°C’de yapılmıştır.
Soya sütü tozu
Bu örnek GeMMA Yeterlilik Testi Round 05’den alınmıştır.
1700 g Amerikan soya sütü tozu, 300 g Roundup Ready® soya protein izolatı ile
birlikte bir gece boyunca karıştırılır. 10 g ağırlığındaki farklı alt örnekler, üstü vidalı
plastik kaplara dağıtılmış ve kullanım öncesi oda sıcaklığında depolanmıştır.
Bisküvi MON810
Bu materyal JRC IHCP Biyoteknoloji ve GDO Birimi’nde üretilmiştir.
Kuru mısırdan elde edilen un tartılmış ve aşağıda verilen miktarlarda diğer
malzemelerle karıştırılmıştır.
Bisküvi MON810
200 g buğday unu, 100 g mısır unu (%2 GDO)*, 150 g
şeker, 100 g tereyağ, 1 yumurta
* %2 MON810 mısır unu, %100 MON810 ununa işlem görmemiş mısır unu katılarak
ve bunlar 30 dakika karıştırılarak elde edilmiştir.
Malzemeler dikkatlice karıştırılmış, pişirme tepsisine eşit olarak yayılmıştır. Önceden
ısıtılmış fırında 10 dakika süreyle 180°C’de pişirilmiştir. Materyal etüvden alınmış,
kontaminasyonu önlemek için üzeri örtülmüş ve oda sıcaklığında soğutulmuştur.
Ürün, 4°C’de saklanmıştır.
Bölüm 3
6
Kurs sırasında kullanılan örneklerin listesi
Örnek
% GMO Özellikleri (Spesifik ingredient)
Bisküvi  1
Karışık un (MON, RR)
MON810 un
Aperatif gıda
Soya sütü tozu
Bisküvi MON810
RR soya
MON810
%0
%1
%2,2
%8,9
-
%0
%1
%1
%2
Beklenen PCR sonuçları
Örnek
IRMM-410S-0(%0)
IRMM-410S-1(%0,1)
IRMM-410S-2(%0,5)
IRMM-410S-3(%1)
IRMM-410S-4(%2)
IRMM-413S-0(%0)
IRMM-413S-1(%0,1)
IRMM-413S-2(%0,5)
IRMM-413S-3(%1)
IRMM-413S-4(%2)
Bisküvi  1
Karışık un
MON810 un
Aperatif gıda
Soya sütü tozu
Bisküvi MON810
zein
lectin
35S
nos
E35S/hsp70(b)
CTP/EPSPS
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Bölüm 3
7
Kaynaklar
Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G., and
foodstuffs. European Food Research Technolgy 212, 497-504.
Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC
collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and
maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923-928.
Trapmann, S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,
Le Guern, L., Kramer, G.N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.,
Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. and Anklam, E.
(2002). The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with
different mass fractions of Roundup Ready TM soya. Certified Reference Materials
IRMM-410S.
Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G.N., Schimmel, H.,
Pauwels, J., Querci, M. Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). The
certification of reference materials of dry-mixed maize powder with different mass
fractions
of
MON810
maize.
Certified
Materials
IRMM-413.
GeMMA Scheme-GMO analysis Round 06. GMO Proficiency Testing, (October
2001). Report N. GMO 06
GeMMA Scheme-GMO analysis Round 05. GMO Proficiency Testing, (October
2001). Report N. GMO 05
Bölüm 3
Gıda Örneklerinde
Bölüm 4
M. Somma
2
İçindekiler
Bölüm 4
Giriş
3 Ekstraksiyon yöntemleri
4 Saflaştırma yöntemleri
4 CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi
6 Spektrofotometre ile DNA miktar tayini
9 DNA’nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri
9 Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi
11 Deneysel
13 Kaynaklar
Bölüm 4
3
Giriş
Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması çoğu moleküler biyolojik çalışmada
ve rekombinant DNA tekniklerinin tümünde ilk adımdır. Nükleik asit ekstraksiyon
yöntemlerinin buradaki amacı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanarak bir GD
spesifik analiz için farklı kaynaklardan nükleik asit saflaştırılmasını sağlamaktır.
Nükleik asitlerin kalitesi ve saflığı PCR analizleri için en önemli faktörlerden
bazılarıdır. Yüksek saflıkta, inhibisyon bulaşanlarından arındırılmış nükleik asitleri
elde etmek için, uygun ekstraksiyon yöntemleri uygulanmalıdır. PCR analiz
performansını inhibe eden olası bulaşanlar Tablo 1’de listelenmiştir. Örnekteki PCR
inhibitorlerinin varlığından kaynaklanan yanlış (negatif) bir sonucun ortaya çıkmasını
engellemek için PCR inhibisyonu test edilerek kontrollü bir deney gerçekleştirilmesi
önemlidir. Bu amaçla, bir bitki-spesifik (ökaryot veya kloroplast) veya türe spesifik
PCR analizi sıklıkla kullanılır.
Tablo 1. PCR işleminin bazı inhibitörleri
İnhibitör
İnhibisyon Konsantrasyonu
SDS
Fenol
Etanol
İzopropanol
Sodyum asetat
Sodyum klorit
EDTA
Hemoglabin
Heparin
Üre
Reaksiyon karışımı
>%0,005
>%0,2
>%1
>%1
>5 mM
>25 mM
>0,5 mM
>1 mg/ml
>0,15 i.u./ml
>20 mM
>%15
Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için çok çeşitli yöntemler vardır, en
uygun tekniğin seçimi genellikle asağıdaki kriterlere bağlıdır:

Hedef nükleik asit

Kaynak organizma

Başlangıç materyali (doku, yaprak, tohum, işlenmiş materyal vb.)

İstenen sonuçlar (verim, saflık, pürifikasyon için gerekli süre)

Bir sonraki uygulama (PCR, klonlama, işaretleme, blotlama, RT-PCR, cDNA
sentezi),vs
Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için günümüzde en yaygın olarak
kullanılan bazı yöntemlerin ilkeleri aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.
Bölüm 4
4
Ekstraksiyon yöntemleri
Biyolojik materyalden nükleik asitlerin ekstraksiyonu hücre parçalanması, hücre
nükleazların inaktivasyonu ve nükleik asitlerin parçalanmış hücreden ayrımını
gerektirir. Genellikle ideal parçalama prosedürü birtakım tekniklerin bileşiminden
oluşur. Bu süreç karmaşık baslangıç materyalini (doku gibi) parçalayacak kadar sert,
ancak hedef nükleik asidi koruyacak kadar da yumuşak olmalıdır. Temel parçalama
prosedürü aşağıdaki yöntemlerle gerçekleştirilebilir:

Mekanik parçalama (öğütme, hipotonik parçalama gibi)

Kimyasal uygulama (deterjanlarla parçalama, tıol ile redükleme, kaotropik katkı
madeleri,vs gibi)

Enzimatik parçalama (Proteinaz K gibi)
Hücre içi nükleazların inaktivasyonu ve hücre membranının parçalanması işlemleri
birleştirilebilir. Örneğin, tek bir çözelti hücre membranını parçalamak için deterjanlar,
hücre içi enzimleri inaktive etmek için de güçlü kaotropik tuzlar içerebilir. Hücre lizizi
ve nükleaz inaktivasyonundan sonra hücre içi diğer faktörlerin uzaklaştırılması
filtrasyon veya presipitasyon(çökeltme) gibi işlemlerle kolayca yapılabilir.
Saflaştırma yöntemleri
Hücre ekstraktlarından nükleik asitlerin saflaştırılması yöntemleri genellikle aşağıdaki
tekniklerden iki veya daha fazlasının birlikte kullanımını gerektirir:
Ekstraksiyon / presipitasyon
Kromatografi
Santrifügasyon
Afinite kolon ayrımı
Bu tekniklerin kısa açıklamaları takip eden paragraflarda verilecektir (Zimmermann
ve ark., 1998).
Ekstraksiyon / Presipitasyon
Çözücü ekstraksiyonu nükleik asitlerden kontaminantları uzaklaştırmak için sıklıkla
kullanılır. Örneğin, fenol ve kloroform kombinasyonu proteinleri uzaklaştırmak için,
izopropanol ve etanol ile presipitasyon genellikle nükleik asitleri konsantre etmek için
kullanılır. Hedef nükleik asitlerin miktarı düşük olduğunda, presipitasyonun etkisini
artırmak için karışıma bir inert taşıyıcı (glikojen gibi) ilave edilebilir. Nükleik asitlerin
diğer presipitasyon yöntemleri yüksek konsantrasyonlu tuz (salting out) kullanılarak
Bölüm 4
5
yapılan seçici presipitasyon ve pH’daki değişiklikler kullanılarak yapılan protein
presipitasyonunu içerir.
Kromatografi
Kromatografi yöntemleri jel filtrasyonu, iyon değişimi, seçici adsorpsiyon veya affinite
ile bağlanma gibi farklı ayrıştırma tekniklerinden oluşabilir. Jel filtrasyonu, jel
partikülleri porlarının moleküler eleme özelliği ile işler. Belirli por çapına sahip bir
matriks daha küçük moleküllerin difüzyon yolu ile porlara girişine izin verir, daha
büyük moleküller porlar tarafından içeri alınmaz ve boş hacimle ayrıştırılılar. Böylece
moleküller molekül büyüklüğü azalışına bağlı olarak sırayla elüye edilir. İyon değişimi
kromatografisinde, bir hedef molekül ve kolon matrisindeki fonksiyonel gruplar
arasındaki elektrostatik interaksiyondan yararlanılır. Nükleik asitler (yüksek negatif
yüklü, lineer polianyonlar) iyon değişimi kolonundan basit tuz tamponları ile
ayrıştırılır. Adsorpsiyon kromatografisinde, nükleik asitler diğer biyolojik moleküllerin
aksine, belirli tuzlar varlığında (örn. kaotropik tuzlar vb.) seçici olarak silika veya cam
yüzeyler üzerine tutunur. Daha sonra düşük konsantrasyonlu bir tuz tamponu veya
su ile nükleik asitleri, bir sonraki uygulamada direkt olarak kullanabilen bir örnek
oluşturacak biçimde, ayrıştırmak mümkündür.
Santrifügasyon
Seçici santrifüj güçlü bir saflaştırma yöntemidir. Örneğin yüksek g-gücünde kendi
kendine oluşan CsCl gradientlerdeki ultrasantrifügasyon, plazmit saflaştıması için
uzun süredir kullanılmaktadır. Genellikle, santrifüj bir başka yöntemle kombine
edilerek kullanılır. DNA ve RNA’yi daha küçük kontaminantlardan (tuzlar, nükleotidler,
vb) tampon degişimi veya büyüklük tespiti amacıyla saflaştırmak için jel filtrasyonla
santrifügasyonu birleştiren spin kolon kromatografisi buna bir örnektir. Bazı
prosedürler, kromatografik bir matriks ( bknz. Bir üst paragraf) üzerindeki selektif
adsorpsiyon ile santrifugal elüsyonu bir nükleik asit çeşidinin seçici saflaştırılmasi için
kombine eder.
Afinite kolon ayrımı
Son yıllarda bir çok saflaştırma yöntemi nükleik asitlerin afinite immobilizasyonunu
manyetik ayrıştırmayla birleştirmiştir. Örneğin, poly(A)+mRNA, biyotin işaretli
oligo(dT) ile streptavidin kaplı manyetik partiküllere bağlanabilir. Bu bağlanmış
partiküller solusyondan ve bağlanmamış kontaminantlatdan bir mıknatıs yardımı ile
ayrıştırabilir. Bu katı faz tekniği, santrifugasyon, organik ekstrasyon ve faz
Bölüm 4
6
ayrıştırmanın bazı aşamalarını basit, hızlı bir manyetik ayrıştırma ile yaptığı için
nükleik asit saflaştırma olayını basitleştirir.
CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi
İlk
kez
Murray
ve
Thompson
tarafından
1980’de
geliştirilen
CTAB
(Cetyltrimethylammonium bromide) protokolü Wagner ve arkadaşları tarafından
1987’de yayınlanmıştır (Wagner ve ark., 1987). Bu yöntem bitki ve bitki kaynaklı gıda
maddelerinden DNA ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için kullanılır. Yöntem özellikle
polisakkaritlerin ve polifenolik bileşenlerin elimine edilmesine uygundur; diğer bir
deyişle saf DNA eldesi ve dolayısıyla da DNA kalitesinde etkilidir. Bu prosedür bitki
moleküler
genetiğinde
yaygın
bir
biçimde
kullanılmakadır
ve
GDO’ların
saptanabilmesi için yapılan validasyon denemelerinde test edilmiştir (Lipp ve ark.,
1999; 2001). Birkaç değişiklik tekniğin birçok ham ve işlenmiş gıda matriksinde
kullanılabilmesi için geliştirilmiştir (Hupfer ve ark., 1998; Hotzel ve ark., 1999; Meyer
ve ark., 1997; Poms ve ark., 2001).
CTAB yönteminin ilkeleri: Liziz, ekstraksiyon ve presipitasyon
Bitki hücreleri, az tuzlu bir ortamda nükleik asitlerle birlikte çözünmez bir kompleks
oluşturan, iyonik bir deterjan olan CTAB ile lize olabilir. Bu koşullarda, polisakkaritler,
fenolik bileşenler ve diğer kontaminantlar süpernatantta kalır ve ortamdan yıkama ile
uzaklaştırılabilir. DNA kompleksi tuz konsantrasyonu arttırılarak çözünülür ve etanol
ve izopraponal ile presipite edilir. Bu bölümde, bu üç temel aşamanın ilkeleri, hücre
duvarı lizizi, genomik DNA ekstraksiyonu ve presipitasyonu açıklanacaktır.
Hücre duvarı lizizi: Daha önce açıklandığı gibi, DNA ekstraksiyonunun ilk aşaması
hücre ve çekirdek duvarlarının parçalanmasıdır. Bu amaçla, homojenize örnek ilk
aşamada EDTA Tris/HCl ve CTAB içeren ekstraksiyon tamponu ile muamele edilir.
Bütün biyolojik membranlar kovalent olmayan bağlarla birbirine bağlı lipit ve protein
moleküllerinden oluşan temel bir yapıya sahiptir.
Bölüm 4
7
Şekil 1. Hücre membranlarının basit gösterimi (Şekil 1, 2, 3 Genetic Science
Learning Center, University of Utah http://gslc.utah.edu)
Şekil 1’de gösterildiği gibi, lipit molekülleri, içinde protein moleküllerinin bulunduğu,
süreklilik gösteren bir çift tabaka biçiminde dizilmiştir. Lipit molekülleri baş olarak
isimlendirilen hidrofilik uçlar ve kuyruk olarak isimlendirilen hidrofobik uçlardan
oluşur. CTAB yönteminde membran lizizi, ekstraksiyon tamponu içinde bulunan bir
deterjan (CTAB) ile yapılır. Lipitler ve deterjan benzer kompozisyonlara sahip olduğu
icin, ekstraksiyon tamponunun CTAB bileşeni hücre ve çekirdek membranını
oluşturan lipitleri tutma özelliğine sahiptir. Bir deterjan kullanılarak çözünen lipitlerin
mekanizmasi Şekil 2’de gösterilmektedir.
Şekil 2. Lipit çözünmesi
Şekil 3, hücre membranının CTAB ekstrasyon tamponuna maruz kaldığında
deterjanın genomik DNA’yı çıkararak lipitleri ve proteinleri nasıl yakaladığını
göstermektedir. Spesifik bir tuz (NaCl) konsantrasyonunda, deterjan nükleik asitlerle
çözünmez bir kompleks oluşturur. EDTA magnezyum dahil farklı metallere
bağlanabilen kelatlayıcı bir bileşendir. Magnezyum DNAaz enziminin kofaktörüdür.
Mg ve EDTA bağlanması ile, varolan DNAaz’ın aktivitesi azalır. Tris/HCl pH’yı
tamponlama kapasitesine sahip bir çözeltidir (düşük veya yüksek pH DNA’ya zarar
verir). Nükleik asitler saflaştırmanın bu aşamasında kolayca degrade olabildiği için
örneğin homojenizasyonu ve CTAB tampon çözeltisinin eklenmesi arasındaki
zamanın en aza indirilmesi önemli bir noktadır. Hücre ve organel membranları
Bölüm 4
(mitokondri
ve
kloroplast
8
gibi)
parçalandıktan
sonra
DNA
pürifikasyonu
gerçekleştirilir.
Şekil 3. Hücre membranının parçalanması ve genomik DNA’nın ekstrasyonu
Ekstraksiyon: Bu aşamada polisakkaritler, fenolik bileşikler, proteinler ve sıvı
çözeltide bulunan diğer hücre lizatları, CTAB nükleik asit kompleksinden ayrılır. Çok
sayıda enzimatik reaksiyonu inhibe etme yetenekleri nedeniyle fenolik bileşiklerin
olduğu gibi polisakkaritlerin de yok edilmesi özelikle önemlidir. Düşük tuz
konsantrasyonlarında ( 0,5 M NaCl), nükleik asit kompleksi kontaminantları çökmez
ve solüsyonun klorofomr ile ekstraksiyonu sırasında uzaklaştırlıbailir. Kloroform
proteinleri denatüre eder ve sıvı ile organik fazların ayrılmasını kolaylaştırır. Normal
olarak, sıvı faz formu üstteki fazdır. Ancak, sıvı faz tuz konsantrasyonu nedeniyle
yoğun ise alt fazı oluşturacaktır. Buna ek olarak, sıvı çözeltinin pH’sı 7,8-8,0
değerlerine yeteri kadar denkleştirilmemiş ise nükleik asitler organik faza
dağılacaktır. Gerektiğinde sıvı fazdaki kirleticileri tamamen ortadan kaldırabilmek için
kloroform ekstraksiyonu iki veya üç kez uygulanır. Nükleik asitleri en iyi şekilde geri
kazanabilmek için organik faz geri özütlenerek bir önceki ekstrakta eklenebilir.
Nükleik asit kompleksi bir kez saflaştırıldığında, prosedürün son aşaması olan
presipitasyon gerçekleştirilebilir.
Presipitasyon: Son aşamada, nükleik asitler deterjandan ayrılır. Bu amaçla, ilk
olarak sıvı solusyon yüksek konsantrasyonlu NaCl ( 0,8 M NaCl) ve CTAB
karışımından oluşan bir presipitasyon çözeltisi ile muamele edilir. Tuz nükleik asit
presipitatı oluşumu için gereklidir. Sodyum asetat tamponlama kapasitesi nedeniyle
NaCl yerine tercih edilebilir. Bu koşullar altında, alkol içerisinde suda olduğundan
daha çözünür olan deterjanlar, nükleik asitler presipite olurken yıkanıp atılabilirler.
Takip eden %70 alkol ile muamele, nükleik asitlerin geri kalan tuzdan arındırılarak ek
bir saflaştırma yapılmasını sağlar.
Bölüm 4
9
Spektrofotometre ile DNA miktar tayini
DNA,
RNA,
oligonükleotidler
ve
hatta
mononükleotidler
seyreltilmiş
veya
seyreltilmemiş sıvı solusyonlar içinde, ultraviyole ışığı altında (aynı zamanda görünür
dalga boylarında) sahip oldukları absorbsiyon A (optik yoğunluk, OD) üzerinden
direkt olarak ölçülebilir. Örnek saf olduğunda (örneğin proteinler, fenol veya agaroz
gibi kontaminantlar çok düşük miktarlda mevcut yahut yoksa) nükleotid bazları
tarafından absorbe olan ultraviyole radasyonun miktarı spektrofotometrik olarak basit
ve doğru biçimde ölçülebilir. Bu yöntem için, düşük iyon konsantrasyonlu sıvı
tamponlar (örneğin TE tamponu) idealdir. Nüklek asitlerin konsantrasyonu genellikle
bir köre (boş örnek) karşı 260 nm’de A ölçülerek belirlenir. Kontaminantların varlığı,
oran hesaplaması ile ayırt edilebilir. Proteinler 280 nm’de absorbladığı için A260/A280
oranı nükleik asitin saflığını hesaplamak için kullanılır. Saf DNA yaklaşık 1,8 , saf
RNA ise yaklaşık 2,0 değerini vermelidir. 230 nm’de görülen absorpsiyon, örneğin
karbonhidratlar,
peptitler,
fenoller veya
aromatik
bileşenler
gibi
maddelerle
kontaminasyonu gösterir. Saf örneklerde A260/A230 oranı yaklaşık 2,2 olmalıdır.
Alternatif bir yöntem olan etidiyum bromidli agaroz yöntemi, nükleik asitlerin düşük
miktarlarda mevcut olduğu durumlarda kullanışlıdır. Nükleik asit miktarı, bir seri
konsantrasyon standardıyla karşılaştırılarak, UV ışığına maruz bırakıldığında
etidiyum bromid tarafindan ışınan floresanın yoğunluğundan hesaplanabilir.
DNA’nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri
Spektrofotometrik ölçümde, bir çözeltideki çözüntü konsantrasyonunu belirlemek için
ışığın çözeltide iletilme oranını kullanır. Cihaz, belirli bir dalga boyunda bir ışık
hüzmesinin bir örnekten geçtiği ve iletilen ışık enerjisi miktarının örneğin diğer
tarafında bir fotosel ile ölçüldüğü basit bir ilkeyle çalışır.
Şekil 4’te gösterildiği gibi tek ışık yolu olan bir spektrometre, ışık kaynağı, prizma,
örnek kuyucuğu ve fotoselden oluşur. Bunların her birine aydınlatma yoğunluğunu ve
dalga boyunu kontrol etmek ve fotoseldeki enerjiyi voltaj dalgalanmasına
dönüştürmek için uygun elektrik ya da mekanik sistemler bağlanmıştır. Oluşan voltaj
dalgalanması daha sonra metre ölçeğinde görüntülenir veya daha sonraki
incelemeler için bir bilgisayara kaydedilir.
Bölüm 4
10
Şekil 4. Işık iletimi şeması
Bütün moleküller ışık enerjisini belirli bir dalga boyunda emerler. Böylece bir çözelti
içindeki çözüntünün konsantrasyonunu bulmak olasıdır. Beer-Lambert kuralına göre
absorsiyon (emilim, soğurma) A (optik yoğunluk, OD olarak da adlandırılır) ile makro
molekülün konsantrasyonu (c) arasında aşağıdaki denklemde verilen doğrusal bir
ilişki vardır:
A=OD= ε.I.c
ε molar sönüm katsayısı (molar extinction coefficient), c konsantrasyon ve l küvetin
ışık yolu uzunluğudur. Proteinler ve nükleik asitler, ultraviyole alanda ışığı 210 ve 300
nm arasında emerler. Daha önce açıklandığı gibi DNA ve RNA çözeltilerinin
maksimum emilimi 260 nm’de, protein çözeltilerinin ise 280 nm’de olmaktadır. DNA
ve RNA çözeltileri ışığı kısmen 280 nm’de ve protein çözeltileri 260 nm’de
soğurduğundan 260 ve 280 nm (A260/A280) ölçüm aralığındaki bir oran, nukleik
asitlerin saflık değerini verir. DNA ve RNA yaklaşık olarak 1,8 ve 2,0 değerlerinde
A260/A280’e sahiptir. 10 mm’ lik bir ışık yolu ve 260 nm’lik bir dalga boyu için A=1
absorpsiyon, yaklaşık 50 µg/ml dsDNA, 37 µg/ml ssDNA, 40 µg/ml RNA veya 30
µg/ml oligonükleotidlere denk gelmektedir. Eğer proteinden kaynaklanan bir
kontaminasyon varsa A260/A280 yukarıda verilen değerlerden daha az olacaktır ve
nükleik asit miktarının doğru ölçümü mümkün olmayacaktır. Burada, DNA
çözeltilerinde RNA’dan kaynaklanan kirlenmelerin spektrofometre ile sağlıklı bir
şekilde tespit edilemeyeceğinin altını çizmek gerekir. 325 nm’de A ölçümü,
çözeltideki çöküntü varlığını ya da küvetin kirli olduğunu göstermede kullanılır.
Bölüm 4
11
Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi
Küvet seçimi: Absorbans (A) ölçümü için kullanılan nükleik asit miktarı küvet
kapasitesine bağlıdır. Örnek konsantrasyonuna, seyreltme faktörüne ve mevcut
örnek hacmine bağlı olarak uygun bir küvet, seçilmelidir. GDO saptaması için
kullanılan birçok prosedürde elde edilen genomik DNA’nın hacmi 50 ile 100 µl
arasındadır. Düşük hacimli nükleik asitlerin spektroskopik ölçümü için 5 ile 70 µl
kapasitede, mikro hacimli küvet çeşitleri kullanılır.
Kurulum : Spektrofotometrenin kalibrasyonu şu nedenlerle önemlidir :

Doğru ışık yolu uzunluğunu ayarlamak,

dsDNA, ssDNA veya RNA için doğru faktörü belirlemek,

Su ya da bir tampon solüsyonundan (A260=0) oluşan boş bir solüsyonu ölçmek
(kör),

Kurulum referansını belirli aralıklarla yenilemek,

Kurulum referansının güvenilirliliğini kontrol etmek için saf nükleik asitten belirli bir
miktar ölçmek
Bilinmeyen örneklerin ölçümü : Kullanılan küvetin kapasitesine bağlı olarak belirli
miktarda DNA çözeltisi konsantrasyon değerlendirmesi için kullanılır (örneğin 0,2
ml’nin altında kapasitesi olan bir küvet için 5 µl DNA 195 µl su ile seyreltilir).
Spektrofotometre ayarlandıktan ve nükleik asit çözeltisi eklendikten sonra küvetin
kapağı kapatılır, çözelti karıştırılır ve absorbans ölçülür. Pipetten kaynaklanan
hataları aza indirmek için ölçüm en az iki kere tekrarlanmalı ve her zaman en az 5 µl
DNA çözeltisi kullanılmalıdır. 0,02’den az veya 1 ile 1,5 (kullanılan cihaza bağlı
olarak) arasındaki A260 ölçümleri, yüksek hata payı olasılığı nedeniyle tavsiye
edilmemektedir.
Bir çözeltide bulunan belirli bir nükleik asitin c konsantrasyonu A260’ın 260 nm’de
ölçülen absorbans olduğu düşünülerek aşağıdaki denklemler kullanılarak hesaplanır.
Tek zincirli DNA
c(pmol/µl) = A260/0,027
Çift zincirli DNA
c(pmol/µl) = A260/0,020
Tek zincirli RNA
c(pmol/µl) = A260/0,025
Oligonükleotid
c(pmol/µl) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG+0,84NT
Bölüm 4
12
Referans DNA’nın, 50 µg/ml icin A260=1 olduğu dsDNA olduğu düşünülerek, 10 mm duvar
kalınlığı olan bir küvette 1x TNE tamponunda çözülmüş saf calf thymus DNA’nın absorbans
ölçümleri Tablo 2’de örneklenmiştir. DNA konsantrasyonu 25 µg/ml’dir.
Tablo 2. 1x TNE tamponundaki çok saf calf thymus DNA’nın absorbans ölçümleri
Dalga boyu
Absorbans
A260/A280
c (µg/ml)
325
0,01
-
-
280
0,28
-
-
260
0,56
2,0
28
230
0,30
-
-
Bölüm 4
13
Deneysel
Ekipman
NOT
Ekipmanların tamamı kullanımdan önce sterilize edilmeli ve herhangi bir olası DNA kalıntısı
uzaklaştırılmalıdır. Kontaminasyondan kaçınmak için, aerosoldan korunmuş filtreli pipet
uçları kullanılmalıdır.
 Steril bir jilet, veya bir havan gibi, örneğin boyutlarını küçültmede kullanılacak
aletler

Su banyosu veya ısıtıcı blok

Mikrosantrifüj

Mikropipetler

Vorteks karıştırıcı

1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri

Tartım kapları veya eşdeğeri

Spatüller

Terazi (0.01 g tartabilen)

Looplar

Mikrosantrifüj tüpleri için taşıyıcı raf

Opsiyonel : DNA peletlerini kurutmak için vakum desikatör
Çözeltiler
NOT
Kimyasalların tümü moleküler biyolojide kullanılabilir saflıkta olmalıdır. Deiyonize su ve
tamponlar kullanımdan önce otoklavlanmalıdır. Ayrıca, hiçbir kimyasal, DNA ve DNaz
içermemelidir.

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)

Kloroform

İsopropanol

Na2EDTA
CAS 124-03-8
CAS 6381-92-6
Bölüm 4
14

Etanol

NaCl

Proteinaz K

RNaz A

Tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)

Steril deiyonize su
CTAB tampon çözeltisi
20 g/l CTAB
4g
1,4 M NaCl
16,4 g
0,1 M Tris HCl
3,15 g
20 mM Na2EDTA
1,5 g

100 ml deiyonize suya eklenir.

1 M NaOH ile pH 8’e ayarlanır.

Deiyonize su ile 200 ml’ ye tamamlanır ve otoklavlanır.

4°C’de maksimum 6 ay depolanır.
CTAB presipitasyon çözeltisi
5 g/l CTAB
1g
0,04 M NaCl
0,5 g

Deiyonize su ile 100 ml’ ye tamamlanır.

Çözeltinin pH’sı 1 M NaOH ile 8’e ayarlanır.

Deiyonize su ile 200 ml’ye tamamlanır ve otoklavlanır.

Çözelti 4°C’ de maksimum 6 ay saklanır.
1,2 M NaCl

7 g NaCl deiyonize suda çözülerek 100 ml’ye tamamlanır.

Otoklavlanır ve oda sıcaklığında saklanır.
%70 (v/v) Etanol çözeltisi
70 ml saf etanol 30 ml steril deiyonize su ile karıştırılır.
Bölüm 4
15
RNAaz A 10 mg/ml -20°C’de saklanır.
Proteinaz K 20 mg/ml -20°C’de saklanır.
Prosedür
Bu prosedür steril koşullar gerektirir. Kontaminasyon, örnek hazırlama sırasında tek
kullanımlık ekipman ve dekontaminasyon çözeltileri kullanılarak ve toz oluşturmaktan
kaçınılarak engellenebilir.

Homojenize örnekten 100 mg steril bir 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüpe aktarılır.

300 µl steril deiyonize su eklenir, bir loop ile karıştırılır.

500 µl CTAB-tampon çözeltisi eklenir, bir loop ile karıştırılır.

20 µl Proteinaz K (20 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 65°C 30-90 dakika inkübe
edilir.

20 µl RNaz A (10 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 5-10 dakika inkübe edilir.

Yaklaşık 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Süpernatant 500 µl kloroform içeren bir mikro santrifüj tüpüne eklenir, 30 saniye
karıştırılır.

Faz ayrılana kadar 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Üst tabakanın 500 µl’si, 500 µl kloroform içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne
aktarılır ve karıştırılır.

16000x g’de 5 dakika santrifüjlenir.

Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

2 hacim (çektiğimiz üst tabaka çözeltinin 2 katı) CTAB presipitasyon çözeltisi eklenir,
pipet ile karıştırılır.

60 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir.


Süpernatant atılır.

Pelet 350 µl NaCI (1,2 M)’de çözündürülür.

350 µl kloroform eklenir ve 30 saniye çalkalanır.

Faz ayrılana kadar 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

0,6 hacim izopropanol eklenir ve çalkalanır.



%70’lik Etanol çözeltisinden 500 µl eklenir ve dikkatlice karıştırılır.
Bölüm 4



Pelet kurutulur ve 100 µl steril deiyonize suda DNA tekrar çözündürülür.
16
DNA çözeltisi buzdolabında maksimum iki hafta, veya dondurucuda -20°C’de daha
uzun bir süre saklanabilir.
Bölüm 4
17
Kaynaklar
Hotzel, H., Müller, W. and Sachse, K. (1999). Recovery and characterization of
residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified
ingredients. European Food Research Technology 209, 192-196.
Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K.H. (1998). Detection of the genetic
modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction.
Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 206, 203-207.
Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and
foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.
Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC
collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and
maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923–928.
Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in
processed food products: development and validation of PCR assay for the
specific detection of glyphosate-tolerant soybeans. In Amadò, R. Battaglia (Eds.).
Proceedings of the ninth European conference on food chemistry (Vol. 1).
Authenticity and adulteration of food-the analytical approach. 24-26 September
1997. Interlaken 1, 23-28. ISBN: 3-9521414-0-2.
Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight
plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321–4325.
Poms, R.E., Glössl, J. and Foissy, H. (2001). Increased sensitivity for detection of
specific target DNA in milk by concentration in milk fat. European Food Research
Technology 213, 361-365.
Wagner, D.B., Furnier, G.R., Saghay-Maroof, M.A., Williams, S.M., Dancik, B.P. and
Allard, R.W. (1987). Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jack pines
Bölüm 4
18
and their hybrids. Proceedings of the National Academy of Science USA 84,
2097–2100.
Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). Quantitative and qualitative
evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean
food samples. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207,
81–90.
Bölüm 4
Gıda Örneklerinde
Bölüm 5
M. Somma, M. Querci
2
İçindekiler
Bölüm 5
Giriş
3 Agaroz jel elektroforezinin fiziksel özellikleri
3 Agaroz jel elektroforez bileşenleri
6 Deneysel
8 Kaynaklar
Bölüm 5
3
Giriş
Jel elektroforezi, makromolekülleri büyüklük, elektrik yükü ve diğer fiziksel özellikler
temelinde
ayıran
bir
yöntemdir.
Elektroforez
(electrophoresis)
terimi
yüklü
partiküllerin elektrik akımı etkisi altında hareketini açıklamaktadır. Elektro (electro)
elektriğe karşılık gelir, forez (phoresis) anlamı karşıya geçirmek/taşımak olan
Yunanca bir kelimedir. Jel elektroforezi elektrik varlığında hareketlenen moleküllerin
jel boyunca karşıya hareket ettiği bir tekniği tanımlar. Elektroforez için gerekli güç,
jelin iki ucunda bulunan elektrotlara uygulanan voltajdır. Bir elektrik alanının bir
molekülü hangi hızla jel ortamında hareket ettirdiği, molekülün özelliklerine bağlıdır.
Birçok önemli biyolojik makromolekül (örn. amino asitler, peptitler, proteinler,
nükleotidler ve nükleik asitler) iyonlaşabilen gruplara sahiptir ve pH’ya bağlı olarak
çözeltide katyon (+) ya da anyon (-) biçiminde, elektrik yükü taşıyan türler olarak
bulunurlar. Net yükün özelliğine bağlı olarak, yüklü partiküller katota veya anoda
doğru hareket edecektir. Örneğin, elektrik alanının uygulandığı jel nötral pH’da ise,
DNA’nın negatif yüklü fosfat grupları anoda doğru hareket eder (Westermeier, 1997).
Agaroz jel elektroforezi DNA moleküllerinin ayrımı, tanımlanması ve saflaştırılması
için kullanılan standart bir yöntemdir. Teknik basit, hızlı ve diğer prosedürlerle
ayrıştırılamayan DNA fragmanlarını çözebilme yeteneğindedir.Ayrıca DNA’nın jeldeki
konumunu, düşük konsantrasyonlarda floresan veren etidiyum bromid ile boyayarak
belirlemek mümkündür. Takip eden bölüm, agaroz jel elektroforezinin hazırlanması
için fiziksel ilkeleri, bileşenleri (jel matriksi, tampon, yükleme tamponu ve markör) ve
prosedürü açıklayacaktır (Sambrook ve ark., 1989).
Agaroz jel elektroforezinin fiziksel özellikleri
Jel elektroforezi nükleik asitlerin ve proteinlerin ayrılması için kullanılan bir tekniktir.
Makromoleküllerin ayrılması iki değişkene bağlıdır: yük ve kütle. DNA gibi biyolojik bir
örnek bir tampon çözeltiye karıştırıldığı ve jele uygulandığı zaman bu iki değişken
birlikte rol oynar. Bir elektrottan gelen elektrik akımı, molekülleri iterken aynı anda
diğer elektrot molekülleri kendine doğru çeker. Jeldeki sürtünme kaynaklı ayrım gücü
molekülleri büyüklüklerine göre ayırarak “moleküler elek” görevi yapar. Elektroforez
sırasında makromoleküller, jelin porlarında hareket etmeye zorlanır. Elektrik alanı
altında hareket oranları şu faktörlere bağlıdır:
 Alanın gücü
Bölüm 5
4
 Moleküllerin büyüklüğü ve şekli
 Örneklerin göreceli hidrofobisitesi
 Moleküllerin içinde hareket ettiği tamponun iyonik kuvveti ve sıcaklığı
Elektroforezle ilgili basit denklemlerin incelenmesi, jel elektroforezinde yüklü
partiküllerin ayrılmasının tam olarak anlaşılması açısından önemlidir. Elektrotlara
voltaj uygulandığında, potensiyal gradient, E, oluşur ve şu eşitlikle açıklanabilir :
E=V/d
(1)
V, uygulanan voltaj ve d elektrotların cm olarak birbirinden uzaklığıdır.
Potansiyel gradient, E, uygulandığı zaman, yüklü moleküller üzerinde bir güç, F,
oluşur ve şu eşitlikle açıklanır :
F=Eq
(2)
q molekül üzerindeki yüktür (Coulomb). Bu güç Newton cinsinden ölçülebilir ve yüklü
molekülün elektroda doğru hareket etmesini sağlar.
Aynı zamanda yüklü moleküllerin hareketini yavaşlatan, sürtünmeden doğan bir de
direnç vardır. Bu direnç fonksiyonları :
 Molekülün hidrodinamik büyüklüğü
 Molekülün şekli
 Elektroforez için kullanılan ortamdaki por büyüklüğü
 Tamponun yoğunluğudur.
Elektrik alanında yüklü moleküllerin hızı (v) potansiyel gradient, yük ve sürtünme
gücünün bir fonksiyonudur ve şu eşitlikle açıklanabilir:
v=Eq/f
(3)
f sürtünme katsayısıdır.
Bir iyonun elektroforetik hareketi, M,iyon hızının potansiyel gradiente bölünmesi
biçiminde gösterilir
M=v/E
(4)
Buna ek olarak eşitlik 3’te görüldüğü gibi elektroforetik hareket M,molekül yükünün q
, sürütnme katsayısı f ‘e bölünmesi bçiminde de gösterilebilir
Bölüm 5
5
M=q/f
Potansiyel gradient
(5)
uygulandığında farklı yüklü moleküller farklı elektroforetik
hareketliliğe (M) bağlı olarak ayrılmaya başlayacaktır. Elektroforetik hareketlilik yüklü
grubun
pK değerine ve molekül büyüklüğüne bağlı olarak, yüklü bir molekülün
önemli ve karakteristik bir parametresidir. Farklı sürtünme kuvvetlerine maruz
kalacaklarından, aynı yükü taşıan moleküüler dahi farklı molekül büyüklüklükleri
sebebi ile ayrılmaya başlayacaktır. Lineer çift zincirli DNA, jel matrislerinde baz
çiftlerin sayısının log10’una ters orantılı şekilde hareket eder. Daha büyük moleküller
daha fazla sürtünme engeli ile karşılaşırlar ve jelin porlarında daha etkisiz bir şekilde
hareket ettikleri için daha yavaştırlar.
Çözeltideki elektrotlar arasındaki akım, çoğunlukla tampon iyonlar tarafından
iletilirken, çok az bir bölümü de örnekteki iyonlar tarafından iletilir. Akım I, voltaj V ve
direnç R arasındaki ilişki Ohm Kanunu’nda şöyle gösterilir:
R=V/I
(6)
Bu denklem, R dirençi için uygulanan V voltajını arttırarak elektroforetik ayrıştırmanın
hızlandırılabileceğini gösterir. Bu da I akımında bir artışla sonuçlanır. Kat edilen
uzaklık hem akım hem de zamanla orantılı olacaktır. Ancak, V voltajındaki artış ve
buna
bağlı
olarak
I
akımındaki
artış,
çoğu
elektroforez
türünun
başlıca
problemlerinden biri olan ısı oluşumuna yol açar. Bu durum, elektroforez sırasında
oluşan Watt olarak ölçülen W gücünün, direnç ile akımın karesinin çarpılması
biçiminde hesaplandığı şu denklemle gösterilir:
W = I2 R
( 7)
Elektroforez işleminde üretilen gücün büyük bölümü ısı olarak dağılacağı için şu
zararlı etkiler ortaya çıkabilir:
 Ayrıştırılan örneklerin yayılmasına neden olan tampon iyonlarının ve örneğin
difüzyon oranında bir artış,
 Ayrıştırılmış
örneklerin
karışmasına
neden
olan
konveksiyon
(ısıyayım)
akımlarının oluşumu,
 Isıya duyarlı olan örneklerde intabilizasyon (örn. DNA’nın denaturasyonu),
 Tampon yoğunluğunda azalma ve buna bağlı olarak ortam direncinin düşmesi.
Bölüm 5
6
Agaroz jel elektroforez bileşenleri
Agaroz
Deniz yosunundan ekstrakte edilen doğal bir kolloit olan agaroz, galaktoz ve 3,6anhidrogalaktoz
ünitelerinin
ardışık
olarak
yer
aldığı
agarobioz
ünitelerinin
tekrarlanmasından oluşan ve moleküler kütlesi yaklaşık 12.000 Da olan lineer bir
polisakkarittir. Agaroz çok hassastır ve elle dokunulduğunda kolayca bozulabilir.
Agaroz jel büyük por çapına sahiptir ve temelde 200 kDa’dan daha büyük
molekülerin ayrılmasında kullanılır.
Agaroz jel elektroforez işlemi hızlıdır, fakat agaroz jellerde oluşan bantlar bulnaıkça
ve dağılmaya meyilli oldukları için çözünürlüğü sınırlıdır. Bu por çapının bir
sonucudur ve kontrol edilemez. Agaroz jel kuru toz halindeki agarozun sıvı bir
tampon içine konması ve sonra karışımın, agaroz berrak bir çözeltiye dönüşene
kadar kaynatılmasıyla oluşturulur. Daha sonra bu çözelti jel tepsisine dökülür ve oda
sıcaklığında katılaşıncaya kadar soğutulur. Katılaştıktan sonra yoğunluğu agaroz
konsantrasyonuyla belirlenen bir matris oluşturur.
Elektroforez tamponu
DNA’nın elektroforetik hareketliliği elektroforez tamponunun kompozisyonuna ve
iyonik gücüne göre değişir. İyonların yokluğunda, eletrik iletimi en düşük düzeydedir
ve DNA çok yavaş hareket eder yahut hiç etmez. Yüksek iyonik güçlü bir tamponda
ise elektrik iletimi çok verimlidir fakat önemli miktarda ısı oluşur. En kötü durumda bu
ısı sebebi ile jel erir ve DNA denatüre olur.
Doğal çift zincirli DNA elektroforezinde kullanılan bir takım tamponlar mevcuttur.
Bunlar genellikle EDTA (pH 8,0) ve yaklaşık 50 mM (pH 7,5-7,8) konsantrasyonunda
Tris-asetat (TAE), Tris-borat (TBE), veya Tris-fosfat (TPE) içerir. Elektroforez
tamponları genellikle konsantre solüsyonlar olarak hazırlanır ve oda sıcaklığında
saklanır. TBE, agaroz jel elektroforezi için başlangıçta 1x çalışma gücünde
kullanılmıştır. Ancak, 0,5x çalışma solüsyonu
yeterinden fazla tamponlama
kapasitesine sahiptir ve artık hemen hemen tüm agaroz jel elektroforezleri bu tampon
konsantrasyonu kullanılarak yapılmaktadır.
Agaroz konsantrasyonu
Belirli büyüklükteki bir DNA parçası agarozun konsantrasyonuna bağlı olarak jel
içinde farklı hızlarda hareket eder. Belirli konsantrasyondaki agaroz ve/veya tampon
Bölüm 5
7
için 20 ile 50.000 bp arasında büyüklüğe sahip bir DNA parçasını ayırmak
mümkündür.
Yatay
jellerde
agaroz
genellikle
%0,7
ile
%3
arasındaki
konsantrasyonlarda kullanılır (Tablo 1) .
Tablo 1. Lineer DNA moleküllerinin ayrımı için tavsiye edilen agaroz jel
konsantrasyonu
% agaroz
DNA büyüklük aralığı (bp)
0,75
10.000-15.000
1,00
500-10.000
1,25
300-5000
1,5
200-4000
2,00
100-2500
2,5
50-1000
Markör DNA
Belirli bir voltaj, agaroz jel ve tampon konsantrasyonu için hareket aralığı, başlangıç
materyalinin molekül ağırlığına bağlıdır. Bu yüzden belirli bir büyüklükteki markör
DNA, jelin sağ ve sol yanlarındaki kuyucuklara yüklenmelidir. Genellikle bir markör
DNA belirli sayıda,ağırlığı bilinen DNA parçaları içerir. Bu da elektroforez sırasında
jel sistematik bir bozukluğa uğrarsa bilinmeyen DNA’ların büyüklüğünü saptamayı
kolaylaştırır.
Yürütme tamponu
Öncelikle agaroz jele yüklenecek DNA örnekleri, genellikle su, sakaroz ve bir
boyadan (örn ksilen siyanol, bromofenol mavi, bromokresol yeşil vb) oluşan yürütme
tamponuyla karıştırılır. Yüklenecek DNA’nın maksimum miktarı parçaların sayısına
bağlıdır. Etidiyum bromid ile boyanmış bir jelin fotoğrafıyla belirlenebilen minimum
DNA miktarı, 0,5 cm genişliğindeki bir bantta, 2 ng’dır. Bu genişlikteki bir bantta 500
ng’dan daha fazla DNA varsa kuyucuk aşırı yüklenecektir ve bu da bulanıklığa yol
açacaktır. Yürütme tamponunun üç görevi vardır:

Örneğin yoğunluğunu arttırarak DNA’nın kuyuya eşit bir şekilde yayılmasını
sağlamak

Örneğe renk katmak ve bu sayede yükleme işlemini basitleştirmek,

Elektrik alanında tahmin edilebilir bir hızda anoda doğru hareket eden örneğe
renk vermek
Bölüm 5
8
Deneysel
NOT
Etidiyum bromid güçlü bir mutajen/karsinojendir ve orta düzeyde toksiktir. Etidiyum bromid
içeren jellere ve solüsyonlara elle dokunurken mutlaka eldiven giyilmelidir.
Malzeme

Güç kaynağı olan yatay elektroforez ünitesi

Mikrodalga fırın yada ısıtıcılı karıştırıcı

Mikropipetler

1,5 ml reaksiyon tüpleri

Terazi (0.1 g tartabilen)

Spatulalar

Reaksiyon tüpleri için taşıma rafı

Cam malzeme

Transilluminatör (UV , 312 nm)

Belgeleme için gerekli cihazlar (örn polaroid fotoğraf makinesi veya kamera)
Çözeltiler

Agaroz, DNA elektroforezine uygun

Tris (hydroxymethyl) aminometan (Tris)

Borik asit

Na2EDTA
(CAS 6361-92-6)

Etidiyum bromid
(CAS 1239-45-8)

Sukroz

Ksilen siyanol FF

DNA Markörleri :

(CAS 77-68-1)
(CAS 2650-17-1)
Lambda DNA EcoRI / Hind III (ya da benzer ve aynı amaçlı kullanılabilecek
markörler)

100 bp DNA ladder
Bölüm 5
9
10x TBE Tamponu (1 litre)
Tris
54,0 g
Borik Asit
27,5 g
Na2EDTA
7,44 g

Tartılan kimyasallar deiyonize suda çözülür, pH 8,3’e ayarlanır ve 1 litreye
tamanlanır.

Oda sıcaklığında depolanır.
6x Yükleme tamponu (10 ml)
Ksilen siyanol FF
0,025 g
Sukroz
4g

Sukroz ve Ksilen siyanol FF 10 ml çözelti hazırlamak üzere deioynize suya
eklenir.

Çözelti iyice karıştırılır ve otoklavlanır. Otoklavlandıktan sonra 4°C’de
saklanır.
Bölüm 5
10
Prosedür

Temiz ve kuru plastik bir jel tepsisinin kenarları bantla ya da başka bir şekilde
kapatılır.Agaroz solüsyonu eklendiğinde yükleme kuyuların oluşması için uygun
tarak yerleştirilir.

Elektroforez haznesini doldurmak ve jeli hazırlamak amacıyla 10x TBE tamponu,
uygun miktarda 0,5x TBE tamponu elde etmek için seyreltilir.

Analiz edilecek örneğe ait standart çalışma prosedürü tarafından önerilen
miktarda toz agaroz tartılır. Agaroz jel konsantrayonunu belirlemek için mutlaka
analizi yapılacak örneğe ait standart çalışma prosedürüne bakılmalıdır. Buna
göre agaroz jel elektroforezi uygulanacak örnek, izole edilen DNA ya da elde
edilen PCR ürünü olabilir.

Toz halindeki agaroz Tablo 2’ye göre tartılır ve bir Erlenmeyerde uygun miktarda
0,5x TBE tamponuna eklenir (genellikle 15x15 cm bir jel tepsisi için 150 ml jel
solüsyonu ve 15x10 cm bir jel tepsisi için 100 ml jel solüsyonu kullanılır).
% 0,8 -1
% 1,5
DNA
X
X
X
%2

genomik
mg4
mg3
GMO8
GMO7
CRYIA4
CRYIA3
HA-nos118-r
HA-nos118-f
p35S-cr4
p35S-cf3
ZEIN4
ZEIN3
GMO4
GMO3
Tablo 2. Kurs sırasında kullanılan agaroz jel konsantrasyonları.
X
X
X
X
X
Karışım agaroz eriyene kadar, kaynayan bir su banyosunda ya da mikrodalga
fırında ısıtılır (ısıttıktan sonra solüsyonun hacmi kontrol edilir)

Karışım 50-60°C’ye kadar soğutulduktan sonra 10 mg/ml stok solüsyonundan
son konsantrasyon 0,2 µg/ml olacak şekilde etidiyum bromid ilave edilir ve iyice
karıştırılır ( jeli köpürtmemeye, kabarcık oluşturmamaya dikkat ediniz).

Solüsyon jel tepsisine dökülür ve jelin katılaşması beklenir. Oluşan jelin kalınlığı
yaklaşık 3-5 mm olmalıdır.

Jel tamamen katılaştıktan sonra tarak ve bant dikkatli bir şekilde çıkarılır ve jel
elektroforez haznesine yerleştirilir.

Jeli 2-5 mm derinliğinde kaplaması için yeterli miktarda 0,5x TBE tamponu
elektroforez ünitesine eklenir.
Bölüm 5
11
Genomik DNA için yükleme örnekleri ve markör hazırlanması aşağıdaki şekilde
gerçekleştirilir.
Örnek
Markör
Su
3 µL
Su
6 µL
Yükleme tampon
2 µL
Yükleme tamponu
2 µL
Örnek
5 µL
DNAEcoRI/HindIII
2 µL
10 µL
10 µL
PCR ürünleri için yükleme örnekleri ve markör hazırlanması aşağıdaki şekilde
gerçekleştirilir.
Örnek
Markör
Yükleme tamponu
2 µL
Örnek
8 µL
100 bp DNA Ladder
15 µL
10 µL

Her örnegin 10 µl’si birbirini izleyen kuyulara, uygun DNA markörü ilk ve son
kuyucuğa yüklenir.

DNA’nın anoda doğru hareket edeceği biçimde jel haznesinin kapağı kapatılır (
anod jelin alt ucunda). 5-10 V/cm voltaj uygulanır.

Ksilen siyanol jelin içinde uygun uzaklığa hareket edene kadar elektroforez
yürütülür (yaklaşık 40-60 dakika).

Akım kapatılır, elektrodlar ve jel haznesinin kapağı çıkartılır. Dışarı alınan jel UV
ışık kutusunun üstüne yerleştirilir ve fotoğrafı çekilir.

Jel etidiyum bromid katı çöp kutusuna atılır.
Bölüm 5
12
Kaynaklar
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Gel electrophoresis of DNA. In:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a
Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, USA, chapter 6.
Westermeier, R. (1997). Electrophoresis in Practice: a Guide to Methods and
Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.
Bölüm 5
Gıda Örneklerinde
Bölüm 6
M. Somma, M. Querci
2
İçindekiler
Bölüm 6
Giriş
3 DNA’nın içeriği, yapısı ve replikasyonu
3 PCR prensipleri
9 PCR cihazları ve içeriği
12 PCR için primer tasarımı
16 Özelleştirilmiş PCR
20 Pratikte PCR
21 Kaynaklar
Bölüm 6
3
Giriş
1985 yılında K. Mullis ve arkadaşları tarafından PCR (Polymerase Chain Reaction)’ın
bulunmasıyla moleküler biyoloji ve moleküler tıp yenilenmiştir (Jaiki ve ark. 1985).
PCR, bir DNA zincirinin bilinen iki parçası arasında uzanan özel bir DNA bölümünün
enzimatik olarak çoğaltıldığı in vitro bir tekniktir. Başlangıçta belirli bir genin sadece
küçük bir parçası elde edilebilirken, günümüzde PCR kullanılarak birkaç saat içinde
tek bir gen kopyasından milyonlarca kopya çoğaltılabilir.
PCR teknikleri diagnostik ve adli tıpta genlerin belirlenmesi ve özel DNA parçalarının
klonlanması ve gen ifade modellerinin tespit edilmesinde önem kazanmıştır.
Günümüzde PCR bakteri kontaminasyonu, genetiği değiştirilmiş DNAnın varlığı ve
gıda içeriklerinin özgünlüğünün kontrolü gibi yeni alanlarda da incelemeye olanak
sağlamaktadır. PCR ve uygulamalarını anlayabilmek içinöncelikle DNA molekülünün
doğal yapısı anlaşılmalıdır. Bu nedenle izleyen bölümlerde DNA’nın yapısı ve
replikasyonu açıklanmıştır.
DNA’nın içeriği, yapısı ve replikasyonu
DNA’nın içeriği:
DNA genetik bilgiyi taşıdığı nükleotidlerin sekansında şifrelenmiş olarak saklayan,
fosforik asit ve deoksiriboz ünitelerinin oluşturduğu iki paralel zincirin, pürin ve
pirimidin bazlarınca çapraz olarak bağlanması ile ortaya çıkan sağ yönlü sarmal
yapıya sahip bir moleküldür. Ökaryot hücrelerde DNA’nın çoğu çekirdek içinde
bulunur ve kromozomal DNA olarak adlandırılır. Çift katlı bir zar (çekirdek kılıfı) ile
hücrenin geri kalanından (sitoplazma) ayrılır.
Buna ek olarak, mitokondri ve kloroplastlarda ekstra kromozomal DNA bulunabilir.
DNA nın yapı taşı olan nükleotidler aşağıdaki gibidir
dATP (deoksiadenozin trifosfat)
dGTP (deoksiguanin trifosfat)
dCTP (deoksisitozin trifosfat)
dTTP (deoksitimin trifosfat)
Bölüm 6
4
İsimlendirme kolaylığı için bu dört nükleotid dNTP (deoksinükleosid trifosfat) olarak
adlandırılır. Bir nükleotid üç ana bölümden oluşur, pürin (adenin A veya guanin G)
veya pirimidin bazları (sitozin C veya timin T), pentoz şeker molekülü (deoksiriboz) ve
trifosfat grup. Şekil 1’de görüldüğü gibi pürin veya pirimidin bazları pentoz zincirine Nglikosidik bağ ile ve fosfat grubu 5’ şekerin karbon atomuna diester bağ ile bağlanır.
Ribonükleik asitte (RNA), timinin yerini urasil, deoksiribozun yerini de riboz alır.
Şekil 1. Nükleotidlerin içeriği (Şekil: Andy Vierstraete, 1999)
DNA’nın yapısı:
Şekil 2 nükleotidlerin bir
nükleotidleri,
fosfat
DNA zincirini nasıl oluşturduğunu göstermektedir. DNA
grubunun
(şeker
molekülünün
beşinci
karbon
atomuna
bağlanmış) önceki nükleotidin şeker molekülünün 3. karbon atomundaki hidroksil
grup ile bağlanması ile oluşur. Bunu sağlamak için difosfat grubu ayrılır (ve enerji
açığa çıkar). Bu zincirin daima 3’ ucuna yeni nükleotidlerin eklenebildiği anlamına
gelir. Şekil 3’de görüldüğü gibi DNA çift ipliklidir (bazı virüsler dışında). İki iplik
birbiriyle tam bir şekilde eşleşir. İplikteki her baz diğer iplikte yalnız bir tip bazla
eşleşerek baz çiftini (bp) oluşturur. A daima T ile iki hidrojen bağı, C daima G ile üç
hidrojen bağı oluşturur. Bu yolla, iki zincir birbirine tamamlayıcı (komplement) olur. Bir
zincir diğerinin üretimi için atasal olarak görev yapar.
Bölüm 6
5
Şekil 2. Tek nükleotidlerden DNA zincir oluşumu (Şekil: Andy Vierstraete, 1999)
Bazlar çift sarmal yapının içinde hidrofobik bir çekirdek oluşturur. Şekerler ve fosfat
grupları (anyonik formlarında) molekülün dış hidrofilik katmanını oluşturur. Fizyolojik
durumlarda çift iplikli DNA sarmalı tek iplikli DNA sarmalından daha dayanıklıdır.
DNA’nın replikasyonu:
DNA bir organizmanın yapısını ve fonksiyonunu bütünüyle tanımlayan tüm genetik
bilgiyi içerir. Genetik bilginin aktarımından üç farklı işlem sorumludur:
Replikasyon
Transkripsiyon
Translasyon
Replikasyon esnasında çift iplikli bir nükleik asit molekülü , eş kopyalar verebilmek
için birebir çoğaltılır. Bu işlem genetik bilginin değişmeden korunarak sürekliliğini
sağlar. Transkripsiyon sırasında, bir gene karşılık gelen DNA parçası okunurak tek
iplikli bir RNA sekansı ile ifade edilir. Bu RNA molekülü çekirdekten sitoplazmaya
hareket eder. Translasyon sırasında RNA sekansı sitoplazmada, protein oluşturan
aminoasit zincirine çevrilir (Alberts ve ark. 1983).
Bölüm 6
6
Şekil 3. Hücrede DNA’nın yapısı (Şekil: Andy Vierstraete, 1999)
Bölüm 6
DNA
replikasyonu
7
PCR
amplifikasyonunun
dayandığı
işlemdir.
Replikasyon
sırasında, DNA molekülünün çift sarmal yapısı çözülerek açılır ve her iplik, yeni bir
tamamlayıcı ipliğin sentezi için ata olur. Her yavru molekül bir eski bir de yeni DNA
ipliğinden oluşur ve ana molekülün birebir kopyasıdır.
Şekil 4. Replikasyon çatalı
Çift sarmalın açılması ve yeni DNA ipliğinin sentezlenmesi için bir çok enzim
gereklidir. Topoizomeraz ve helikazlar DNA’nın sarmal yapısını kırarak çözmek ve
DNA’nın tek ipliğinin çentiklenerek açılmasından sorumludur.
Böylece primaz (primezom olarak tanımlanan bir protein grubunun bir parçası) enzimi
DNA polimerazın senteze başlayacağı 3’ OH bölgesinde görev yapmak için küçük bir
RNA primerini tek iplikli DNA’ya bağlar. Bu RNA primeri daha sonra RNAaz H
tarafından uzaklaştırılır ve kalan boşluk DNA polimeraz I tarafından doldurulur. Bu
safhada, DNA polimeraz DNA’nın tek ipliğinde ilerler. DNA polimerazın farklı tipleri
vardır, fakat yeni DNA ipliklerinin ilerleyen sentezinden prokaryotlarda DNA
polimeraz III sorumludur. DNA polimeraz ata iplikteki bazları uygun komplementer
serbest dNTP ile hidrojen bağları ile bağlar (A, T ile; G, C ile). Aynı zamanda oluşan
ipliğin bir önceki nükleotidi ile bu yeni nükleotid arasında kovalent fosfodiester bağ
oluşturur. Trifosfatta saklanan enerji her yeni nükleotidin büyüyen ikinci ipliğe
kovalent bağla bağlanması için kullanılır.DNA polimeraz yalnızca 5’ uçtan 3’ uca
doğru çalışır. Çift sarmalın bir ipliği 5’ uçtan 3’ uca doğru olduğu için, diğeri de 3’
Bölüm 6
8
uçtan 5’ uca doğrudur. DNA polimeraz 5’ uçtan 3’ uca doğru olan ipliğin (lagging
strand) ikinci kopyasını parçalar halinde (Okazaki fragmanları) oluşturur (Ogawa ve
Okazaki 1980). 5’ uçtan 3’ uca olan ipliğin gen kopyasının sentezlenmesi şekil 4’de
görülmektedir. Diğer iplik (leading strand) sarmal açıldıkça 5’ uçtan 3’ uca direkt
olarak sentezlenir. DNA polimeraz boş bir tek iplikte, ex novo olarak sentezlemeye
başlayamaz, mutlaka dNTP’yi bağlayacağı serbest bir OH grubuna sahip bir primere
ihtiyaç duyar.
Ligaz enzimi serbest ama komşu olan 3’ OH ve 5’ fosfat grupları arasında
fosfodiester bağın oluşumunu katalize eder. Bu aktivite, RNA primerinin ayrılmasını
takiben arada kalan küçük bölümlerin,molekülün geri kalanına bağlanmasını sağlar.
SSB (single strand binding, tek iplik bağlanıcısı) proteinleri replikasyon çatalının
dayanıklılığını korumak için çok önemlidir. Tek
iplikli DNA oldukça kırılgan ve
dayanıksızdır bu nedenle bu proteinler tek iplikli kaldığında DNA’ya bağlanarak onu
parçalanmaktan korur.
Bölüm 6
9
PCR prensipleri
PCR hücre içinde (in vivo) DNA’nın kendini eşlemesi mekanizmasına dayanır. Çift
zincirli DNA (dsDNA), tek zincirli DNA (ssDNA) biçimine çözülür, kopyalanarak
çoğaltılır ve tekrar bağlanır. Bu teknik;

çift sarmal DNA’nın yüksek sıcaklıkta çözülerek tek sarmal haline gelmesi:
denatürasyon

primer olarak kullanılan iki oligonükleotidin hedef DNA’ya bağlanması: primer
eşleşmesi

Mg+2 iyonlarının varlığında, katalizör olan DNA polimeraz ile primerlere
nükleotid eklenmesi ve DNA zincirinin uzaması: primer uzaması
İşlem döngülerinin bir çok tekrarından oluşur.
Genellikle kısa zincirlerden oluşan oligonükleotidler, birbirlerinden dizin olarak
farklıdır. Primerlerin sekansı, çoğaltacak hedef DNA’ya komşu tanımlama bölgelerine
eştir. Denatürasyon, primer birleşmesi ve primer uzaması PCR metodunda bir
döngüyü oluşturur. Şekil 5’de PCR işlemindeki üç ana basamak gösterilmektedir.
Şekil 5. PCR çoğalmasının basamakları (resim Andy Vierstraete,1999)
Bölüm 6
10
Her döngünün sonunda yeni sentezlenen DNA zincirleri, bir sonraki döngü için hedef
(ata)
zincir olabilir. Şekil 6’da görüldüğü gibi, bu reaksiyonun ana ürünü, sonu
oligonükleotid primerlerin 5’ ucu olan ve uzunluğu primerler arası uzaklıkla
tanımlanan bir dsDNA parçasıdır. Başarılı bir amplifikasyonun ilk döngüsünün
ürünleri, iki primerin bağlanma bölgeleri arasındaki uzaklıktan daha fazla uzunluğa
sahip, farklı boyutlarda DNA moleküllerdir. İkinci döngüde, istenen uzunluktaki DNA
zincirleri oluşur. Bu ürünün miktarı diğer amplifikasyon döngülerinde lineer olarak
çoğalır ve reaksiyonun temel çıktısını oluşturur. Amplifikasyon, başlangıçtaki ana
zincirin reaksiyon sonundaki kopya sayısı biçiminde aşağıdaki formülle açıklanır:
(2n-2n)x
Burada n döngü sayısı, 2n ilk ve ikinci döngüden sonra elde edilen uzunluğu
bilinmeyen ürünler, x ana zincirin kopya sayısıdır. Potansiyel olarak 20 döngüden
sonra her döngüde %100 başarı ile, 220 kez amplifikasyon olacaktır. PCR’ın başarısı,
uygulanan
optimizasyon
düzeyine
göre
ve
atadan
ataya
değişir.
PCR
amplifikasyonunun üç aşamsının detaylı tanımları (ata denatürasyonu, primer
bağlanması ve uzaması) aşağıdaki paragraflarda verilmiştir (Sambrook ve ark 1989).
Şekil 6. DNA’nın PCR ile üstel çoğaltılması
Template Denatürasyonu:
Denatürasyon esnasında, çift sarmal çözüler, bütün enzimatik reaksiyonlar durur
(örn. bir önceki döngüdeki uzama). İki eş zincir artan sıcaklık ile birbirinden ayrılır. Bu
işlem denatürasyon (bozulma) olarak adlandırılır. DNA denatürasyonunu sağlamak
Bölüm 6
11
için sıcaklık yaklaşık 93-96°C ‘ye çıkarılır. Bu sayede kuvvetli hidrojen bağları kırılır
ve eşleşmemiş bazların sayısı artar. Ortamdaki tüm çift sarmal (ds) DNA, tek sarmal
(ss) DNA formuna dönüştüğünde reaksiyon tamamlanır. Mevcut dsDNA’nın yarısının
tek sarmal haline dönüştüğü sıcaklık Tm, erime sıcaklığı olarak bilinir. Kullanılan
çözücü, tuz derişimleri ve ortam pHsı denatürasyon işlemini etkiler. Örneğin, düşük
tuz derişimlerinde, yüksek pH ve formaldehit gibi organik çözücülerin varlığında Tm
düşer. DNA’nın içerdiği nükleotid çiftlerinin oranı yani G/C ve T/A miktarları da Tm
değerini etkiler. G/C miktarı yüksek olan DNA’nın Tm’i, T/A miktarı yüksek olan
DNA’ya göre daha yüksektir. Örneğin Serratia marecescens %60 G/C ile yaklaşık
94°C Tm’e sahipken, Pneumococcus %40 G/C ile 85°C Tm’e sahiptir.
Primer Eşleşmesi:
DNA zincirlerinin eşleşmesi veya yeniden bağlanması daha düşük sıcaklıklarda
gerçekleşir (genellikle 55-65°C). Sıcaklık düşünce, birbirine eş iki ssDNA zinciri
yeniden bağlanarak dsDNA oluşturur. Bu fazda, tek zincir primerler ile tek zincir
hedef DNA arasında hidrojen
bağlar oluşur ve kırılır. Hedef DNA’ya tam olarak
eşleşen primer ile ana zincir arasındaki bağlar daha sağlam ve uzun süreli olur.
Ortaya çıkan bu küçük dsDNA parçası (primer-template) üzerine DNA polimeraz
bağlanarak ana zinciri kopyalamaya başlar. Birkaç baz eklendikten sonra primer ve
template arasındaki iyonik bağ kuvvetlenir ve kırılmaz.
Primer Uzaması:
Sıcaklığa dayanıklı DNA polimeraz (genellikle Taq DNA Polimeraz) ile dNTP’lerin
varlığında primerler hedef zincir boyunca uzatılır. Bu reaksiyon başlangıçtaki hedef
DNA materyalinin iki katına çıkması ile sonuçlanır (birebir kopyalama). Taq
Polimerazın optimum çalışma sıcakllığı 72°C’dir. Primerler bir kaç baz uzadıktan
sonra, hedef DNA’ya karşı daha yüksek iyonik çekime sahip olurlar. Bu da yapılan
işlemin geri dönüşünü engeller. Tam olarak eşleşmeyen (uyuşmayan) primerler
yüksek sıcaklıktan dolayı gevşer ve böylelikle reaksiyon DNA parçasının uzaması ile
sonuçlanmaz. Ana DNA’ya eş olan bazlar primere 3’ kısmından bağlanır. Polimeraz
ana zinciri 3’-5’ yönünde okurken, 5’-3’ yönünde dNTP ekler. Primer uzama
basamağının süresi, çoğaltılacak DNA uzun ise arttırılabilir. Ancak genellikle PCR
deneylerinde 1 dakikalık uzama zamanı tam sentez için yeterlidir.
Bölüm 6
12
PCR aletleri ve içeriği
Aletler
PCR işleminin otomatik hale gelmesini iki temel gelişme izin sağlamıştır
a. Sıcağa dayanıklı, yüksek sıcaklıkta aktivitesini koruyan DNA polimerazların
kullanımı. Böylece reaksiyonun başlangıcında eklenen polimeraz sayısız işlem
döngüsü boyunca aynı aktiviteyi gösterir.
b. Sıcaklığın programlı olarak hızlı bir şekilde düşürüp yükseltilebildiği ısı
banyolarının gelişmesi. Bunlar PCR cihazları ya da termal cycler olarak bilinir.
Kullanılan PCR cihazlarının farklı tasarımları mevcuttur. Örneğin: sıvılarla ısıtma ve
soğutma, elektriksel rezistansla ısıtma ve sıvılarla soğutma ve elektrik rezistansla ısıtma
yarı iletkenlerle soğutma. Üç aşamalı işlemin tipik sıcaklık döngü profili Şekil 7’de
görülmektedir.
Aşağıda
bahsedilecek
olan
reaksiyon
girdileri
ve
döngü
sayısının
yanısıra,
denatürasyon, primer bağlanması, primer uzaması gibi daha önce bahsedilen termal
döngü parametreleri de başarılı bir PCR için kritiktir.
Şekil 7. PCR sıcaklığı değişim profili
Hedef DNA
PCR amplifikasyonu prensip olarak, hedef genin en azından bir tam kopyası
bulunduğunda yapılabilir. Çok sayıda hedef gen kopya sayısı başarılı DNA
amplifikasyon olasılığını arttırır. Hedef DNA yapısında herhangi bir hasar (örneğin
kırılma) PCR amplifikasyonunu durdurur. Hedef zincirin uzunluğu <0,1’den birkaç
kilobaza kadar olabilir. PCR’de kullanılan toplam DNA miktarı hedef DNA’nın tek
Bölüm 6
13
kopyasının belirlenmesine olanak sağladığı için 0,05 ile 1 µg arasında olur. Kullanılan
numunenin çok saf olması gerekmemekle beraber heparin, heme, formalin, Mg+2
şelatlayıcı ve deterjan gibi maddeler amplifikasyon işlemini engelleyebilir.
Primerler (Öncüler)
Genellikle yüksek bağlanma sıcaklıklarında kullanılabilmesi açısından 16-30
nükleotid uzunlukta primerler kullanılır. Primerlerde hedef ile uygun olmayan
bağlanmalar yapabilecek polibaz zincir uzamalarından (örneğin poli dG), veya tekrar
eden motiflerden kaçınılmalıdır. Hedef DNA’ya hibridizasyonu engelleyeceği için
primerde ikincil yapı oluşmasına yol açan tekrar eden ters zincirlerden kaçınılmalıdır.
PCR’da kullanılan primerlerin birbirlerine tamamlayıcı olmaması primerler arasında
hibridizasyon veya primer–dimer oluşumlarını engellemek için önemlidir (özellikler
primerin 3’ ucu için). Eğer mümkünse uzayacak olan kısmın bağlanmasını arttırmak
için primerin 3’ ucunda çok sayıda G ve C bazları bulunmalıdır. Primerler arasındaki
mesafe 10kb’den az olmalıdır. Genellikle primerler arasındaki uzaklık 3kb’den fazla
olunca
PCR
ürününde
önemli
ölçüde
azalma
görülür.
Genelde
PCR’da
oligonükleotidler 1 µM derişimde kullanılırlar. Bu miktar 30 döngülük bir PCR için
yeterlidir. Yüksek miktarlarda oligonükleotid istenmeyen bölgelerin amplifikasyonuna
sebep olabilir. Buna karşılık düşük primer konsantrasyonları PCR verimini azaltır.
DNA Polimeraz
Orijinal PCR metodunda E. coli DNA polimeraz I’in Klenow parçası kullanılmıştır
(Saiki ve ark. 1985). Ancak bu enzim hedef dsDNA’yı denatüre etmek için gerekli
olan sıcaklıktan daha düşük sıcaklıklarda bozulmaktadır. Bu nedenle ilk çalışmalarda
her döngüden sonra reaksiyonayeni enzim eklenmesi gerekiyordu. Buna ek olarak
farklı sıcaklıklarda gerçekleşen denatürasyon, bağlanma ve uzama basamakları için
örneklerin bir sıcaklık banyosundan diğerine aktarılması gerekiyordu. Sıcağa
dayanıklı DNA polimerazın kullanımı, her denatürasyon basamağından sonra enzim
eklenmesi gereğini ortadan kaldırdığı için PCR işlemini kolaylaştırmıştır. DNA
polimerazlar polinükleotidin sadece 3’ ucuna yeni nükleotid ekleyebilmektedir.
Kullanılan ilk sıcağa dayanıklı DNA polimeraz Thermus aquaticus’dan izole edilen
Taq DNA polimerazdır (Saiki ve ark. 1988). Bu enzim PCR uygulamalarında en
yaygın kullanılan enzim olmasına karşın başka DNA polimerazlar da bulunmaktadır.
Tablo 1 PCR için kullanılan ısıya dayanıklı DNA polimerazların özelliklerini
göstermektedir.
Bölüm 6
14
Tablo 1. PCR’da kullanılan bazı DNA polimerazların özellikleri
Taq/
AmpliTaq®
Vent TM
DeepVent TM
Pfu
Tth
UITma TM
Kaynak
Thermus
aquaticus
Thermoco
ccus
litoralis
Pyrococc
us GB-D
Pyrococc
us
furiosus
Thermus
thermophil
us
Thermotog
a maritima
Uygulama
Taq: doğal
AmpliTaq:gen
etik müh. Için
Genetik
müh. için
Genetik
müh. için
Doğal
Genetik
müh. için
Genetik
müh. için
95°C’deT1/2
aktivitesi(dk)
5’ - 3’
Ekzonükleaz
aktivitesi
3’ - 5’
Ekzonükleaz
aktivitesi
İşlevsellik
Uzama hızı
(nt/sn)
Son DNA ucu
Moleküler
Ağırlık (kDa)
40
1380
400
>120
20
>50a
Evet
Hayır
Hayır
Hayır
Evet
Hayır
Hayır
Evet
Evet
Evet
Hayır
Evet
50-60
?
7
?
30-40
?
75
?
>80
60
>33
?
3’A
>%95 kör
>%95 kör
?
3’A
Kör
94
?
?
92
94
70
Taq/AmpliTaqDNA Polimeraz
Daha önce bahsedildiği gibi bu enzim Amerika Yellowstone Doğal Parkında yaklaşık
85°C sıcaklıktaki kaynak sularında yaşayan Thermus aquaticus bakterisinden izole
edilmiştir. Bu enzimin optimal çalışma sıcaklığı 70-80°C arasındadır. Bu sıcaklıkta
bakteri saniyede 35-100 nükleotid sentezleyebilme hızına sahiptir. Enzimin hedef
DNA’dan ayrılmadan önce DNA’ya bağlayabildiği nükleotidlerin ortalama sayısı
“işlem kapasitesi” olarak tanımlanır. AmpliTaq DNA polimeraz E.coli tarafından
ifade edilen ve genetiği değiştirilmiş bir enzimdir. AmpliTaq rekombinant olduğu için
bu enzimin saflığı ve verimliliği doğal enzimden daha fazladır. Ancak DNA
amplifikasyonu sırasında bazı homolog E.coli sekansları ile potansiyel bir
kontaminasyon meydana gelebilir, bu durumda konak organizma olarak E.coli’de
ifade edilmeyen bir DNA polimeraz tavsiye edilir. Hem Taq hemde AmpliTaq DNA
polimerazlar büyüyen zincirin başından nükleotidleri ayıran 5’ uçtan 3’ uca
ekzonükleaz aktivitisine sahiptirler.
Vent ™- ; Deep Vent ™- ; Pfu- ve UITma™- DNA Polimerazlar
Bu enzimler doğru eşleşmiş bir baz çiftine gelinceye dek yanlış eşleşmiş tüm
parçaları kesebilen 3’ uçtan 5’ uca ekzonükleaz aktivitesine sahiptir. Ancak 3’-5’
ekzonükleaz aktivite, aynı zamanda primerlerin parçalanmasın da neden olabilir. Bu
Bölüm 6
15
nedenle enzim yanlızca reaksiyon başladıktan sonra eklenmeli ya da alternatif olarak
kimyasal olarak değiştirilmiş primerler kullanılmalıdır.
AmpliTaqGold ™ - DNA Polimeraz
AmpliTaqGold DNA polimeraz oda sıcaklığında inaktif olan ve yanlızca 94°C’lik
inkübasyon aralığında aktive olabilen bir enzimdir. Bu durumda kullanılacak termal
cycler programı 92-95°C’de bir ön inkübasyon safhası içermelidir. Time-released
PCR için ön inkübasyon elimine edilebilir, ancak klasik PCR’den farklı olarak
reaksiyonlar en az 10 döngü fazla sürdürülmelidir.
PCR Reaksiyonlarında Reaksiyon Tampon Çözeltileri ve MgCl2
PCR için reaksiyonda direk olarak yer alan maddelerin yanısıra uygun bir tampon
çözeltisine ihtiyaç duyulur. Tampon içeriği kullanılan enzimin özellik ve tipine bağlıdır
ve bir çok üretici enzimle beraber 10X tamponunu da sağlar. Taq/AmpliTaq®DNA
polimeraz ile en yaygın olarak kullanılan tampon;
10mM Tris, pH 8.3
50mM KCl
1,5-2,5 mM MgCl2 içermektedir.
PCR’da divalent katyonların bulunması çok önemlidir. Reaksiyon karışımında MgCl2
konsantrasyonu 0,5 ile 5 mM arasındadır ve optimum konsantrasyon ampirik olarak
belirlenir (Innis ve Gelfland 1990). Mg+2 iyonları;
-dNTP bağlanması için gerekli olan dNTP’ler ile çözünebilen bir karışım
oluşturur.
-polimeraz aktivitesini artırır.
-primer/hedef DNA etkileşmininin Tm’ni artırır (böylece ikili etkileşimi daha
dengeli hale getirir).
Genellikle düşük Mg+2 konsantrasyonu düşük miktarda ürün (ya da hiç) oluşmasına
sebep olurken yüksek miktarlardaki Mg+2, özel olmayan ürünlerin (yanlış eşleşme)
artmasına sebep olur. Hedef DNA solüsyonunda yüksek miktarlarda fosfat gibi
negatif olarak yüklenmiş iyonik gruplardan ya da EDTA gibi şelatlayıcı maddelerden
kaçınılması gerekir. Güncel literatürde çeşitli PCR tamponları ve DMSO, PEG 6000,
formamid, gliserol, spermidin ve iyonik olmayan deterjanlar gibi reaksiyon hassasiyeti
ve etkisini arttırmak için kullanılan ek maddelerin kullanılması üzerine tartışmalar
bulunmaktadır (Roux, 1995).Belli DNA polimeraz türleri sadece bu tür ek maddelerin
varlığında optiumum aktivite göstermektedir ( Ralfs ve ark. , 1992)
Bölüm 6
16
Deoksiribonükleosit Trifosfatlar
Serbest deoksiribonükleosit trifosfatlar (dNTP’ler) DNA sentezi için gereklidir. PCR
için kullanılan her dNTP için konsantrasyon 20 ile 200 µM arasında olmalıdır ve
yanlış bağlanma hatalarını önlemek için 4 dNTP de eşit miktarlarda kullanılmalıdır
(Innis ve ark 1988). Yüksek saflıkta dNTP’ler üretici firmalar tarafından dört ayrı stok
ya da dört dNTP karışımı olarak sağlanmaktadır. dNTP stok solüsyonları (genellikle
100 mM) için pH, son reaksiyon pH’sı 7,1’in altına düşmeyecek biçimde, 1M NaOH
ile pH 7,0-7,5 arasında ayarlanmalıdır (Sambrook ve ark 1989). Şu anda üretilen
dNTP stok solüsyonlarının çoğu pH ayarlı olarak sağlanmaktadır.
Döngü Sayısı ve Plato Etkisi
Jelde görülebilecek bir DNA bantı elde edebilmek için gerekli olan amplifikasyon
döngülerinin sayısı hedef DNA’nın başlangıç derişimine bağlıdır. 50 hedef molekülü
çoğaltmak için 40-45 döngü önerilir, ancak aynı derişimde 3x105 molekülü çoğaltmak
için 25-30 döngü de yeterlidir (Innıs ve Gelfald 1990). Bu oransızlık “Plato etkisi”
olarak adlandırılır. Sebebi ürün konsantrasyonu 0,3-1 nM’e ulaştığı PCR’ın son
safhalarında reaksiyonun lineer hızındaki azalmadır. Reaksiyon girdilerinin (dNTP,
enzim) parçalanması kısa hedefler için, azalması ise (primerler, dNTP)uzun hedefler
için bir problem olabilir.Son ürün inhibisyonu (pirofosfat oluşumu), özel olmayan
ürünlerin reaksiyon girdileri için yarışması, konsantre ürünün (10 nM) yeniden
bağlanma ile primer bağlanması için yarışması bu duruma yol açabilir (Innıs ve
Gelfald 1990). Eğer istenilen ürün 30 döngüde elde edilmiyorsa, döngü sayısını
arttırmak yerine çoğaltılan üründen çok az bir örnek (1 μl) alınarak yeni bir reaksiyon
karışımı ile 20-30 döngü çoğaltılmalıdır. Ana molekül derişiminin sınırlı olduğu
durumlarda bu yeni amplifikasyon iyi sonuç verirken döngü sayısının 40 ya da daha
fazla yapılması iyi sonuç vermez.
PCR için primer tasarımı (dizaynı)
Başarılı bir PCR için en kritik parametre primerlerin tasarımıdır. Tüm koşulların uygun
olduğu bir durumda, sadece zayıf tasarlanmış bir primer PCR reaksiyonun
çalışmamasına neden olabilir. Primer sekansı ürünün gen üzerindeki pozisyonu ve
uzunluğu, erime sıcaklığı, ve nihayetınde PCR verimi dahil pek çok parametreyi
etkiler (Innıs ve Gelfald 1994). Zayıf tasarlanmış bir primer, ürün oluşumunu
bastıracak biçimde rakip olabilen primer-dimer oluşumu ve/veya özel olmayan
Bölüm 6
17
amplifikasyon sonucu çok az veya hiç ürün üretilmemesine neden olabilir. Bu
uygulama notu PCR için primer tasarlanırken dikkat edilmesi gereken kuralları
içermektedir. Bu konuda daha detaylı bilgi başka kaynaklardan bulunabilir
(Dieffenbach ve ark. 1995).
Primer Seçimi
PCR primerleri tasarlanırken çeşitli parametrelere dikkat edilmelidir. En kritikleri;
-Primer uzunluğu
-Erime sıcaklığı Tm
-Hassasiyet (specificity)
-Tamamlayıcı primer sekansları
-G/C miktarı ve polipirimidin (T, C) ve polipurin (A, G) uzamaları
-3’ uc sekansıdır.
İzleyen bölümlerde bu kritik maddeler tartışılacaktır.
Primer uzunluğu
PCR hassasiyeti, bağlanma sıcaklığı ve bağlanma süresi primer uzunluğuna bağlı
olduğundan bu parametre başarılı bir PCR için çok önemlidir. Genel olarak,
bağlanma sıcaklığı uygun olduğunda 18 ile 24 bazlık oligonükleotidler belli bir
sekansa özel olarak bağlanırlar. Primer uzunluğu aynı zamanda bağlanma verimi ile
de doğru orantılıdır. Genel olarak primer uzadıkça , bağlanma verimi azalır. Her
basamakta daha az ana molekül primerle bağlandığından çoğaltılan üründe önemli
derecede azalmaya neden olur.
Uygulama özellikle gerektirmedikçe, primerler çok kısa olmamalıdır. Aşağıda
bahsedildiği gibi hedef en az 50°C’lik bağlanma sıcaklığına sahip bir primer
tasarlamaktır. Bağlanma sıcaklığı ile erime sıcaklığı arasındaki bağlantı PCR’ın kara
kutularından biridir. Genel kural bağlanma sıcaklığını erime sıcaklığından 5°C daha
düşük olarak kullanmaktır.Genellikle sadece bu şekilde hesaplanan bağlanma
sıcaklığ, enı uygun sıcaklık olmayıp
belirlemek için ampirik deneyler yapılmak
zorunda kalınabilir. Bu optimizasyon kademeli termal döngü kullanılarak kolaylıkla
yapılabilir.
Bölüm 6
18
Erime sıcaklığı (Tm)
Hedef/bölge yönlü PCR reaksiyonu için iki primer kullanıldığı unutulmamalıdır. Her iki
oligonükleotid primer de benzer erime sıcaklıklarına sahip olacak şekilde
tasarlanmalıdır. Eğer primerler Tm nedeni ile yanlış bağlanırsa, amplifikasyon daha
az verimli olacaktır. Düşük sıcaklıkta Tm’ye sahip primer yüksek sıcaklıkta, yüksek
sıcaklıkta Tm’ye sahip primer düşük sıcaklıkta çalışmayacaktır. Oligoların erime
sıcaklığı en yakın komşu termodinamik hesaplamaları kullanılarak kesin olarak
hesaplanabilir.
Tm primer=ΔH [ΔS+R ln(c/4)]-273,15°C+16,6 log10 [K+]
Burada sarmal oluşum için H; entalpi, S; entropi, R molar gaz sabiti ve c de
primerlerin derişimidir. Primer tasarımı yazılım paketleri kullanılarak yapılabilir
(Sharrocks 94). Bu değerin iyi çalışan yaklaşık hesabı (genellikle 18-24 baz
aralığında oligolar için) aşağıdaki formül kullanılarak yapılabilir;
Tm=2(A+T)+4(G+C)
A,T,C,G purin ve pirimidin bazlarıdır. Tablo 2, bu eşitlik (Wallace formülü) kullanılarak
ve %50 G/C içeriği tahmini ile çeşitli uzunluklardaki primerlerin hesaplanmış
değerlerini göstermektedir.
Tablo 2. Wallace eşitliği ile primerlerin Tm değerlerinin hesaplanması (G/C içeriği
%50 kabul edilmiştir)
Primer uzunluğu
Tm=2(A+T)+4(G+C)
Primer uzunluğu
Tm=2(A+T)+4(G+C)
4
12°C
22
66°C
6
18°C
24
72°C
8
24°C
26
78°C
10
30°C
28
84°C
12
36°C
30
90°C
14
42°C
32
96°C
16
48°C
34
102°C
18
54°C
36
108°C
20
66°C
38
114°C
Bölüm 6
19
Wallace kuralı kullanılarak hesaplananerime sıcaklıkları bu tablonun uç değerlerinde
kesin değildir. Primerlerin erime sıcaklığı hesaplanırken ürünün erime sıcaklığının
92°C’de %100 erime elde edilebilecek kadar düşük olmasına dikkat edilmelidir. Bu
parametre, daha etkili PCR elde edebilmek için önemli fakat her zaman gerekli
değildir.
Genel olarak, 100-600 bp arasındaki ürünler PCR reaksiyonlarında etkili olarak
çoğaltılabilir. Eğer kuşku varsa ürünün Tm’i aşağıdaki formul ile hesaplanmalıdır.
Tm=81,5+16,6(log 10 [K+]+0,41(%G/C)-675/uzunluk
Primer hassasiyeti
Yukarıda bahsedildiği gibi, primerin hassasiyeti (specificity), primer uzunluğuna
bağlıdır. 24 bazlık özgün oligo sekansları 15 bazlık oligo sekanslarından daha
hassastır. Primerler kısmi olarak çoğaltılıcak hedef DNA içinde özgün bir sekans
taşıyacak biçimde tasarlanmalıdır. Tekrarlanan sekanslar içeren primer ile genomik
DNA çoğaltılması bulanıklık ile sonuçlanacaktır ( birden fazla ürün türü). Ancak aynı
primer, genomik kütüphaneden tek bir klon çoğaltıldığında net, tek bir bant verebilir.
Taq polimeraz geniş bir sıcaklık aralığında aktif olduğu için primer uzaması düşük
bağlanma sıcaklıklarında meydana gelebilir. Sıcaklık çok düşük olduğunda primer ile
özgün olmayan bağlanma gerçekleşebilir. Eğer 3’ ucunda kısa da olsa homoloji varsa
polimeraz bu noktadan çalışmaya devam eder. Genel olarak 55-72°C arasındaki
erime sıcaklığı en iyi sonucu verir (bu sıcaklık aralığı Wallace kuralına göre 18-24
bazlık primer uzunluğu düşünülerek verilmiştir)
Tamamlayıcı primer sekansları
Primerler 3 bazdan daha fazla iç primer homolojisine sahip olmayacak şekilde dizayn
edilmelidir. Primerler kendi içinde homolojiye sahip olursa, “snap back” veya “hairpin”
( saç tokası) tabir edilen, primerin homolog sekansları sebebiyle kendi üzerine
katlanarak çift zincir oluştrması görülebilir. Bu da primerin hedef DNA’ya
bağlanmasını etkileyecektir. Diğer bir tehlike primerler arası homolojidir. İki primerin
orta bölümündeki kısmi homoloji hibridizasyonu engelleyebilir. Eğer homoloji
primerlerden birinin 3’ ucuna karşılık geliyorsa primer-dimerleri ( birbirine bağlanmış
Bölüm 6
20
iki primer molekülü) oluşur. Bu da elde etmek istenen ürünle yarışacağı için istenilen
ürünün oluşmasını engelleyecektir.
G/C miktarı ve poliprimidin (T,C) ve polipurin (A,G) uzamaları
Primerlerin baz kompozisyonu %45 ile %55 arası GC taşıyacak şekilde olmalıdır.
Primer sekansı özel olmayan bağlantıları arttıracak poli G ve poli C uzamaları
olmayacak şekilde seçilmelidir. Primer-hedef kompleksinde gevşemeye yol açacak
Poli A ve poli T uzantılarından da kaçınılmalıdır. Bu amplifikasyonun verimini
düşürebilir. Polipirimidin (T,C) ve polipurin (A,G) uzantılarından da kaçınılmalıdır.
İdeal olarak bir
primer %50 GC içerik taşıyan ve yaklaşık 20 bp uzunluğunda
nükleotidlerin rastgele karışımına sahiptir. Bu yapı erime sıcaklıpı Tm’yi 56-62°C’lik
aralıkta tutar (Dieffeanbach ve ark. 1995).
3’- uc sekansı (zinciri)
3’ terminal pozisyonu yanlış bağlanmayı kontrol için çok önemlidir. Bu bölgede yer
alan primer homolojilerinin yaratacağı sorunlardan bahsedilmişti. Diğer bir değişken
primerlerin 3’ ucuna G ve C bazlarının eklenmesidir. Bu GC kıskacı G/C
nükleotidlerinin daha kuvvetli hidrojen bağlarla bağlanması nedeni ile 3’ ucun sonuna
doğru bağlanmayı garanti eder. Bu aynı zamanda primer-hedef kompleksinde
gevşemelere bağlı olaraak reaksiyon hızının yavaşlamsının önüne geçerek süre
kaybını azaltır ve reaksiyon verimini arttırır.
Özelleştirilmiş PCR
Yukarıda bahsedilen tipik PCR prosedürleri yoluyla hedef DNA’nın amplifikasyonun
yanısıra özel uygulamalar için geliştirilmiş özel PCR’lar vardır.
Nested PCR
Hedef DNA’nın PCR verimini arttırmak için nested yanı bırbırı için gömülmüş primer
setleri kullanılabilir (Newton ve Graham 1994). Nested PCR’da birinci primer seti ile
15-30 döngü arası amplifikasyonun ardından bu ilk PCR’ın ürünü kullanılarak bu
bölgede bir sekansa karşılık gelen ikinci bir primer seti ile 15 ile 30 döngü arasında
ikinci bir PCR yapılır. Böyle ilk PCR’dan elde edilen uzun parça ikinci PCR’ın hedef
Bölüm 6
21
DNA’sı olur. Nested PCR metodu kullanılarak, DNA amplifikasyon hassasiyeti ve
özgünlüğü önemli ölçüde arttırılabilir. Özgünlüğün artmasının nedeni bu tekniğin
benzer lakin özgün olmayan olmayan çoğalma ürünlerini ortadan kaldırmasıdır. İlk
PCR döngüsünden sonra ortaya çıkan özel olmayan ürünler, ikinci PCR primerleri
için de tamamlayıcı olma ihtimalleri çok düşük olduğundan çoğaltılmayacak ve
dolayısıyla sadece istenilen hedef sekans çoğaltılacaktır. Lakin bu yüksek
hassasiyetin dezavantajı yüksek kontaminasyon riskidir. Bu nedenle bu tip PCR’lar
yapılırken özellikle diagnostik laboratuvarlarda çok dikkatli olunmalıdır.
Multiplex PCR
Standart bir PCR reaksiyonunda özel bir sekansı çoğaltmak için tek primer çifti
kullanılırken, multiplex (çoğul) PCR’da bir çok sekansı eş zamanlı çoğaltmak
amacıyla birden fazla primer çifti kullanılır. Bir tüp içinde bir çok primerin bulunması
yanlış eşleşmiş PCR ürünleri, “primer-dimer” oluşumu ya da daha kısa DNA
parçalarının çoğaltılmasının yeğlenmesi gibi problemler yaratabilir(Atlas ve Bey
1994). Bu tip PCR çoğaltımı için benzer bağlanma sıcaklığına sahip primerler seçilir.
Çoğaltılan ürünlerin uzunluğu da benzer olmalıdır; hedef DNA’ların uzunluğundaki
büyük farklılıklar, kısa parçaların uzun parçaların üzerinde çoğalmasına sebep olur.
Bu da ürün verimlerinde farklılık yaratır. Multiplex PCR tampon çözeltileri amplikonlar
arasındaki yarışı ve kısa DNA parçalarının multiplex PCR esnasında yeğlenmesini
azaltan Taq polimeraz katkısı içerir. Multiplex PCR ürünleri, kontrol amaçlı olarak,
söz konusu gene özel prob ile hibridize edilebilir.
Pratikte PCR
Daha önceki bölümlerde gösterildiği gibi, PCR yaygın olarak kullanılan hızlı bir
analitik ve hazırlık tekniğidir. Yanlız bu işlemin doğası gereği, eser miktarlarda DNA
kontaminasyonu dahi hedef DNA olarak davranabilir ve bu da yalnış nükleik asidin
çoğaltılmasına neden olur (false pozitif). Bu nedenle PCR amplifikasyonunu DNA’dan
arındırılmış ortamda yapmak çok önemlidir. Fiziksel olarak ayrılmış alanlarda
çalışmak kontaminasyon riskini azaltır. Dekontaminasyon kurallarına tamamen
uymak (nükleik asitlerin dekontaminasyonu, aerosollerin önlenmesi gibi) yanlış pozitif
sonuçları minimuma indirmek için en önemli zorunluluktur. PCR kontaminasyonu
çeşitli sebeplerle oluşabilir;
Bölüm 6

22
Laboratuvar masaları, pipetleme aletleri ve diğer cihazlar (daha önceki DNA
deneyleri sırasında kontamine olmuş olabilir.)

Örnekler arası çapraz kontaminasyon

Daha önceki amplifikasyonlardan bulaşmış PCR ürünleri
Bu bölüm, çalışılacak örnek sayısına bakılmaksızın PCR için gerekli olan temiz bir
ortamın kurulması ve korunması için gerekli olan rutin ihtiyaçları belirtmektedir (Roth
ve ark. 1997).
Fiziksel önleme metodları
Laboratuvar Ortamı: Kontaminasyonu önlemek için fiziksel olarak ayrılmış çalışma
alanları aşağıdaki gibi düzenlenmelidir.
1. Numune hazırlama bölgesi: Bu oda hedef DNA amplifikasyonu öncesi bütün
diğer işlemlerinin yapıldığı alandan oluşur (DNA’nın izolasyonu ve saflaştırılması
gibi).
2. PCR odası: Bu “temiz oda” PCR reaksiyonu için gerekli olan işlemlerin yapıldığı
yerdir (mastermiks, primer seyreltilmesi gibi).
3. PCR sonrası alan: Bu alan hedef DNA zincirinin çoğaltılması ve PCR ürünlerinin
tayini ve analizi için ayrılmıştır.
Ek olarak aşağıdaki genel kurallar uygulanmalıdır.

Bütün odalarda PCR için ayrılan ve yeri değiştirilmeyen aletler ve malzemeler
bulunmalıdır (eldiven, kimyasal, önlük gibi).

Sıvılar ve diğer malzemeler içerik ve hazırlama tarihi ile etiketlenmelidir.

Tek yönlü akış sistemi kullanılmalıdır. Örneğin hiçbir zaman PCR sonrası
alandan, PCR öncesi alana, numune ya da örnek getirilmemelidir.

DNAaz ve RNAaz ari, tek kullanımlık PCR reaksiyon tüpleri kullanılmalıdır.

Aerosol dayanıklı pipet uçları ve PCR için özel olarak ayrılmış pipetler kullanılır
(tercihen pozitif yer değiştirmeli pipet).

Eğer mümkünse PCR reaksiyonları UV lambalı laminarda yapılmalıdır. Laminar
içinde mikrosantrifüj ve yanlızca PCR için kullanılan eldivenler bulundurulmalıdır.

Periyodik olarak çalışma alanları ve raflar %10 çamaşır suyu ve ardından %70
etanol ile yıkanmalıdır.
Bölüm 6
23
Örneğin çalışılması

Daha önce bahsedilen alanlarda steril teknikleri kullanın ve daima eldiven giyin.
Eldivenleri sık sık değiştirin. Özellikle hedef DNA içeren sıvılarla kontamine
olduğunu düşündüğünüzde hemen yeni eldivenler kullanılmalıdır.

PCR solusyonları ve hedef DNA hazırlarken daima yeni ve steril cam ve plastik
malzeme, pipet, vs. kullanılmalıdır.

Otoklavda bozulmayacak bütün solüsyon ve sıvıları otoklavlayın. Primerler,
dNTPler ve Taq polimeraz otoklavlanmaz.

Küçük miktarlarda saklanan, sadece sizin tarafınızdan kullanılan PCR kimyasal
seti ve solüsyonlarını kulanın.

DNA’yı pipetlerken kontaminasyon taşıyacak aerosoller oluşturmaktan kaçının

Daima kontrol reaksiyonları yapın. Örneğin DNA içermeyen negatif kontrol ve
daha önceki PCR’lerde başarı ile kullanılan pozitif kontrol.
Biyokimyasal önleme metodları
Urasil DNA Glikosilaz
PCR tek kopya molekülü milyarlarca kopya olarak çoğaltabilir. Bu yüzden çok küçük
miktarlardaki kontamine DNA dahi çoğaltılarak yanlış pozitif sonuç verebilir. Bu tip
kontaminasyonun
kaynağı
genellikle
daha
önceki
PCR
ürünleridir
(taşıma
kontamisyon). Bu nedenle bu tip kontaminasyonları engelleyecek yöntemler
geliştirilmiştir.Yaygın yöntemlerden biri PCR sırasında dTTP yerine dUTP kullanarak
urasil içeren DNA (U-DNA)’lar üretmektir (Longo ve ark. 1990). Bu reaksiyonu izleyen
PCR öncesi tüm PCR reaksiyon karışımlarını urasil-DNA glikosilaz (UNG) ile
muamele edip, alkalin koşullarda ilk denatürasyon basamağında yüksek sıcaklığa
(95°C’de) maruz bırakmak primidin polinükleotidlerin kırılması ve kontamine eden UDNA’nın örnekten ayrılmasını sağlayacaktır (şekil 8).
Bölüm 6
24
Şekil 8. Urasil-DNA glikosilaz reaksiyonu
Bu yöntem laboratuvardaki bütün PCR reaksiyonlarını dTTP yerine dUTP ile
yapılmasını gerektirmektedir. dU içeren PCR ürünlerini kullanırken aşağıdakilere
dikkat edilmesi gerekmektedir.

dU içeren PCR ürünleri dideoksi sekansı için ana molekül olarak ya da hibridizasyon
hedefleri olarak kullanıldığında dT içerenler kadar iyi sonuç verir.

dU içeren PCR ürünleri UNG bakteri hostlarına transfer edilirse direkt olarak
klonlanabilir

dU içeren substrat bazı reaksiyon enzimleri ile (EcoRI, BamHI gibi) kolayca kesilirken
diğerleri bu substratlar üzerinde daha düşük aktiviteler gösterebilirler (HpaI, Hind II ve
Hind III gibi).

dU içeren DNA’ların kullanımı protein bağlanması veya DNA-protein etkileşim
çalışmalarında tavsiye edilmemektedir.
DNaz I, Ekzonükleaz III
Diğer biyokimyasal yöntemler kontamine olmuş DNA’nın DNAz, ekzonükleaz III veya
uzaklaştırılmak istenen DNA yapısı içinde hedef bölgesi bulunan bir restriksiyon
enzimine tabi tutulmasına dayanır. Çok kuvvetli reaksiyon koşulları gerektiği için bu
enzimler PCR amplifikasyonunun hassasiyetini düşürebilirler.
Bölüm 6
25
PCR reaksiyonu için karışım hazırlama
PCR için gerekli kimyasallar nükleaz ari su, reaksiyon tamponu, ısıya dayanıklı DNA
polimeraz, oligonükleotid primerler, deoksinükleotidler (dNTP), hedef DNA ve Mg
iyonlarıdır. Genel olarak bütün maddeler (hedef DNA dışında) reaksiyon sayısına göre
yeterli olacak miktarda tek bir tüpte karıştırılır (master karışım). Bu karışım tek tek tüplere
dağıtılır ve hedef DNA eklenir. Master karışım solüsyonunun kullanımı kontaminasyon
riskini azaltır ve aşağıdaki sebeplerden ötürü PCR reaksyion performansını arttırır :

Bir seri analiz için aynı kalitede karışım garantisi vardır.

Orijinal ve yeni hazırlanan karışımların kontaminasyon riski düşer.

Daha yüksek hacimler pipetlenebilir.

Pipetleme safhaları azalır, böylece zamandan kazanılır.
İlgilenilen bölgenin başarı ile çoğaltılması hedef DNA’nın miktarı ve kalitesine bağlıdır.
Gereken hedef DNA’nın miktarı DNA örneğinin ne kadar karmaşık olduğuna bağlıdır.
Organizmalar arasında nüklear genomun uzunluğunun farklı olduğu göz önünde
bulundurularak reaksiyondaki DNA derişimi sabit tutulmalıdır (genellikle 10 ng/µl).
Transformasyonda sıkça kullanılan bitki türlerinin genom boyutu ile belirli miktardaki
DNA’nın içerdiği genom kopya sayılarının karşılaştırılması Tablo 3’de verilmektedir.
Tablo 3: Bazı bitki türlerinin genom boyutunun, belirlenmiş miktardaki DNA’nın
içerdiği genom kopyaları ile karşılaştırılması
Örnek
Mısır
Soya
Genom boyutu
9
5x10 bp
9
1,55x10 bp
9
1 µg DNA’daki genom kopya
1 ng DNA’daki genom
sayısı
kopya sayısı
1,85x10
5
185
5,98x10
5
598
5
245
Tütün
3,8x10 bp
2,43x10
Pirinç
4x108 bp
2,31x106
2310
Örneğin 1 kb’lik bir DNA parçası eklenmiş 4kb’lik bir plazmid için reaksiyona dahil
edilen DNA’nın %25’i istenilen bölgedir.Halbuki mısır genomunda (5x109 bp) yer alan
1 kb’lik bir gen, reaksiyona dahil DNA’nın yaklaşık olarak %0,00002’sini
oluşturmaktadır. Yani her reaksiyonda hedef kopya sayısını sabit tutabilmek için
yaklaşık olarak bir milyon kez daha fazla mısır genomik DNA’sı gerekmektedir.
Bölüm 6
26
Optimize edilmiş sonuç için hedef sekansın en az 104 , tercihen daha fazla kopyası
25-30 döngüde sinyal alabilmek için başlangıç atası olarak kullanılmaldır. Pratikte
hedef sekansın 10’dan az kopyasını dahi çoğaltmak mümkün olsa bile bu durumda
da elektroforezde sinyal alabilmek için daha fazla PCR döngüsü gerekecektir. Genel
protokolerde 30 ile 40 döngü arası rutin olarak uygulanır. Özel olmayan çoğaltmayı
da arttırabileceği için döngü sayısını arttırırken dikkatli olunmalıdır.
Kontroller
Daha önceki bölümlerde belirtildiği gibi laboratuvarda birçok kontaminasyon kaynağı
bulunabilir.
Örnekler,
lab
personeli,
havalandırma,
aletler
ve
kimyasallar
kontaminasyon kaynağı olabilir. Kontamine ajanları arasında aşağıdakiler sayılabilir:
1. Daha önceki PCR’larda çoğaltılan DNA’ların taşınması yoluyla kontaminasyon
2. Örnekler arası kontaminasyon; hedef DNA’nın bir örnekten diğerine aktarılmaınsa
neden olur
3. Daha önceki DNA’ların hazırlanmasından kalan genomik DNA
4. Dekontaminasyon reaksiyonlarından parçalanmış ürünler.
İlk üç kontaminasyon biçimi yanlış pozitif sonuçlar verirken, sonuncusu yanlış negatif
sonuç verir. PCR reaksiyonlarının engellenmesine neden olan bu tip kontaminasyon
ilk olarak Neiderhauser ve ark. tarafından 1994 yılında gösterilmiştir. UNG yöntemi
kullanılarak yapılmış dekontaminasyon, primerlerle kompleks oluşumu ihtimalini
arttırır. Güvenilir sonuçlar elde edebilmek için PCR reaksiyonu sırasında hem pozitif
hem de negatif kontroller kullanılmalıdır. Tablo 4 nüklek asit amplifikasyonu
prosedürlerinden emin olmak için yaygın olarak kullanılan bazı kontrolleri
göstermektedir.
Tablo 4. PCR dayalı testlerde kullanılabilecek kontroller
Kontrol
Ayraçların hedef DNA ile kontaminasyonu
Yöntem
DNA template olmadan yapılan PCR (yanlızca
master karışım) – kontrol
Reaksiyonun özgünlüğü
İkincil ve özel olmayan ürünleri bulmak için
yapılan kontroller
Reaksiyonun geliştirlmesi ve hassasiyeti
+/- kontroller (istenilen koşulları ve ürünleri
sağlayabilmesi için)
PCR karışımının bütünlüğü
DNA ile + kontrol PCR’ı
Bölüm 6
27
Pozitif (+) kontroller
DNA ekstraksyonu ve amplifikasyon verimliliği pozitif (+) kontrollerle sınanmalıdır. İdeal
olarak elde etme limitleri genomik karşılık olarak verilmelidir. Bu düşük kopya sayısında
bile tanımlanan hassas bir şekilde üretilmesine izin verecek şekilde olmalıdır. Kural olarak
incelenen hedef DNA’nın bilinen miktarlarını içeren referans hazırlanabilmelidir.
Negatif (-) kontroller
Hedef DNA’nın izolasyonu ve saflaştırılması veya amplifikasyon reaksiyon karışımlarının
hazırlanması esnasında kontaminasyon olabileceğinden
(çoğaltılan ürün veya nükleik
asitleri taşıyan) her PCR reaksiyonu için DNA içermeyen bir örnekle negatif (-) kontrol
yapmak gereklidir.
Bölüm 6
28
Kaynaklar
Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Watson, J.D. (1983).
Molecular biology of the cell. Garland Publishing, Inc., NewYork.
Atlas, R.M., and Bej, A.K. (1994). Polymerase Chain Reaction. In: Gerhardt, P.,
Murrey, R.G.E., Wood, W.A. and Krieg, N.R., (Eds) Methods for general and
molecular bacteriology. Washington, D.C., American Society for Microbiology, pp.
418-435.
Dieffenbach, C.W., Lowe, T.M.J. and Dveksler, G.S. (1995). General Concepts for
PCR Primer Design. In: Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S. (Eds.) PCR
Primer: a Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, USA, pp. 33-155.
Innis, M.A. and Gelfand, D.H. (1990). Optimization of PCRs. In: Innis, M.A., Gelfand,
D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. (Eds.) PCR Protocols: a Guide to Methods
and Applications. New York, Academic Press, pp. 3-12.
Innis, M.A. and Gelfand, D.H. (1994). Optimization of PCRs. In: Innis, M.A., Gelfand,
D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. (Eds.) PCR Protocols: a Guide to Methods
and Applications. London, CRC Press, pp. 5-11.
Innis, M.A, Myambo, K.B., Gelfand, D.H., and Brow, M.A. (1988). DNA sequencing
with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase
chain reaction-amplified DNA. Proceedings of the National Academy of Science
USA 85, 9436-9440.
Longo, M.C., Berninger, M.S., and Hartley, J.L. (1990). Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reaction.
Gene 93, 125-128.
Newton, C.R. and Graham, A. (1994). PCR. BIOS Scientific Publishers, Limited,
Oxford.
Bölüm 6
29
Niederhauser, C., Höfelein, C., Wegmüller, B., Lüthy, J., and Candrian, U. (1994).
Reliability PCR Decontamination Systems. PCR Methods and Applications 4,
117-123.
Ogawa, T., and Okazaki, T. (1980). Discontinuous DNA replication. Annual Review of
Biochemistry, 49, 421-457.
Roux, K.H. (1995). Optimization and troubleshooting in PCR. PCR methods and
Applications 4, 185-194.
Rolfs, A., Schuller, I., Finckh, U., and Weber-Rolfs, I. (1992). Substances affecting
PCR: Inhibition and enhancement, 51-58. In: PCR: Clinical diagnostics and
research, Springer.
Roth, A., Mauch, H., and Göbel, U. (1997). Nucleic acid Amplification TechniquesRecommendations for Employing Molecular Methods in Diagnostic Routine
Microbiology Laboratories and Measures for Internal Quality Assurance. Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart.
Saiki, R.K., Scharf, S.J., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and
Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and
restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350.
Saiki, R.K. et al. (1988) Primer directed enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase. Science 239, 487.
Sambrook, J. and Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). In vitro Amplification of DNA
by the Polymerase Chain Reaction. In: Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis,
T. (Eds.) Molecular Cloning : A Laboratory Manual. New York, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cols Spring Harbor, NY, USA, chapter 14.
Sharrocks, A.D. (1994). The design of primers for PCR. In: Griffin, H.G. and Griffin,
A.M. (Eds.) PCR Tehnology:Current Innovations. London, CRC Press pp.5-11.
Suggs, S.V. Hirose, T., Miyake, E.H., Kawashima, M.J., Johnson K.I., and Wallace,
R. B. (1981) Using Purified Genes. IN ICN-UCLA Symp. Developmental Biology,
Vol.23, Brown, D.D. Ed., Academic Press, New York, 1981, 683.
Bölüm 6
30
Ek Kaynaklar
Gayer-Herkert, G., (1992). Molekularbiologische Methoden für den Nachweis von
Mikroorganismen in Mischpopulationen-eine Literaturstudie. Bioengineering 5+6,
55-64.
Horton, H., Moran, L., Ochs, R., Rawn, J. and Scrimgeour, K., (1994). Principes de
Biochimie. De Boeck-Wesmael, S.A. Bruxelles.
Knippers, R. (1995). Molekulare Genetik. Geaorg Thieme Verlag, Stuttgart.
Kwok, S., Kellog, D.E., McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C. and
Sninsky, J.J. (1990). Effects of primer-template mismatches on the polymerase
chain reaction: Human Immunodeficienecy Virus 1 model studies. Nucleic Acids
Research 18, 999-1005.
Larzul, D. (1993). Le PCR: un procede de replication in vitro. Tec&Doc Lavoisier,
Paris.
Stryer, L. (1991). Biochemie. Spectrum Akademischer Verlag, GmbH, Heidelberg.
Watson, D.J., Hopkins, N., Roberts, J., Steitz, J., and Weiner, A. (1988) Molecular
Biology of the Gene. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., New
York.
Bölüm 6
Gıda Örneklerinde
Bölüm 7
MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready®
Soyanın Özellikleri
M.Querci, M.Mazzara
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
2
İçindekiler
Bölüm 7
Roundup Ready ® Soyanın Özellikleri
3 MON810 Mısırın Özellikleri
7 Bt-176 Mısırın Özellikleri
11 Kaynaklar
Bölüm 7
Roundup Ready ® Soyanın Özellikleri
3
1
Kısa Tanımlama
İsim
GTS 40-3-2
Başvuran
Monsanto Canada Şirketi
Bitki Türü
Glycine max L. (Soya Fasülyesi)
Yeni Özellikler
Roundup ready® herbisitinin aktif içeriği Glufosat
toleransı
Genetik Modifikasyon Metodu
Partikül bombardımanı (biyolistik)
Önerilen Kullanım
Hayvan besini (çoğunlukla yağdan arındırılmış olarak
sıkıştırılmış gevrek ve yemek) ve insan tüketimi
(çoğunlukla yağ, protein ve diyet liflerinde) için soya
üretimi
Temel Bilgi
Soya hattı GTS 40-3-2 Monsanto Canada Şti. tarafından soya üretiminde zararlı
bitkilerle mücadelede alternatif bir sistem olarak glufosatın kullanımına olanak
sağlamak
için
geliştirilmiştir.
GTS
40-3-2
nin
geliştirilmesi,
Agrobacterium
tumefaciens suşu CP4’den izole edilen glufosat dirençli 5-enolpurivil-şikimat-3-fosfat
sentaz (EPSPS) enzimini kodlayan genin, ticari soya çeşidi (Asgrow Tohum Şirketi)
A5403’e aktarılması yolu ile olmuştur.
Yeni Karakterin Tanımı
Glufosat toleransı
Roundup®’ın aktif molekülü olan Glufosat, sistemik, seçici olmayan zararlı ot kontrol
maddesi olarak dünya çapında kullanılan bir herbisittir. Glufosat 5-enolpurivil-şikimat3-fosfat sentaz (EPSPS) enziminin kompetitif inhibitörü olarak görev yapar. EPSPS
fenilalanin, tirosin ve triptofan aromatik aminoasitlerinin üretiminde yer alan şikimat
biyokimyasal yolunda zorunlu bir enzimdir (Şekil 1). EPSPS’in engellenmesi
büyümenin durdurulması ve bitki ölümüne yol açar.
Aktarılan Glufosat tolerans geni bu enzimin bakteri kökenli (Agrobacterium
tumefaciens CP4 suşundan) versiyonudur. Bitki, mantar ve mikroorganizmalarda
1
Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar DD95-05’den alınmıştır.
Bölüm 7
4
bulunan bu enzim glufosata yüksek derecede dirençlidir. Bu nedenle inhibisyona
uğramaz ve bitkinin aromatik amino asit metabolik ihtiyaçlarını karşılayabilir.
Fosfoenolpiruvat
+
Eritroz-4-fosfat
Şikimat-3-fosfat
Fosfoenolpiruvat (PEP)
Glifosat (Roundup®)
N-(fosfonometil) glisin
5-enolpiruvil-şikimat-3-fosfat (EPSP)
Fenilalanin
Tirosin
Triptofan
Şekil 1. EPSPS enzimi şikimat-3-fosfat ve fosfoenolpiruvat (PEP) arasındaki
reaksiyonu katalize eder. 5-enolpiruvil-şikimat-3-fosfat (EPSP) ile fosfat bu
reaksiyonun ürünleridir. EPSP, aromatik aminoasit sentezinde gerekli bir ara
moleküldür. Bu biyokimyasal yolun glufosat tarafından engellenmesi, protein
sentezini engelleyerek bitki ölümüne yol açar. EPSPS, glufosatın bitkideki tek hedef
enzimidir ve PEP kullanan diğer enzimler glufosattan etkilenmezler
EPSPS geni kuvvetli bir konstitütif promotör olan karnıbahar mozaik virüsü (PCaMVE35S) ve A. tumefaciens kaynaklı nopalin sentaz terminatörü (T-nos) ile
kontrol edilmektedir (Şekil 2). Bitki kökenli, kloroplast transit peptidi (Petunia
hibrida’dan CTP4) kodlayan DNA sekansı glufosat tolerans geninin 5’ ucuna
klonlanmıştır. EPSPS genine birleştirilen sinyal peptidi yeni sentezlenen enzimin
şikimat yolunun bulunduğu ve glufosatın etkisini gösterdiği kloroplastlara geçişini
Bölüm 7
5
sağlar. Geçiş gerçekleştikten sonra, transit peptidi özel bir proteaz ile enzimden
ayrılır ve hızlı bir şekilde parçalanır.
EPSPS sentaz doğada yaygın olarak bulunur ve toksik ve allerjik olması beklenmez.
Toksik ve allerjik polipeptidlerin sekans databazlarında karşılaştırma analizleri
yapıldığında bilinen herhangi bir toksin yada allerjenin aminoasit sekansı ile önemli
bir homoloji göstermemiştir.
P-E35S
CTP4
CP4 EPSPS
T-nos
Şekil 2. Roundup Ready® soya gen kasetinin şematik gösterimi (Padgette ve ark.
1995’ten uyarlamam).
Geliştirme Metodu
Ticari soya çeşidi A5403 (Asgrow Tohum Şirketi) altın partikül bombardıman yoluyla,
E.coli’ den elde edilen plasmid vektörü PV-GMGT04 ile transforme edilmiştir (bakınız
Şekil 3). PV-GMGT04, glufosat toleransı kodlayan CP4 EPSPS genini, seçici markör
olarak β-glukoronidaz üretimi için gus genini, ve antibiyotik direnci için nptII genini
(kanamisin direnci) içermektedir. Seçilen ilk transformantta biri gus seçici markörü,
diğeri glufosat tolerans geni ile olmak üzere iki integrasyon bölgesi görülmüştür. Bu
iki bölge, izleyen eşeyli üreme jenerasyonlarında bağımsız olarak ayrışmış ve
analizler sonucu, hat GTS 40-3-2’de sadece glufosat tolerans geninı içeren tekil bir
bir integrasyon bölgesi bulunduğu görülmüştür.
Bitki Genomuna Sabit İntegrasyon
İlk verilere göre (Padgette ve ark. 1995, 1996) GTS 40-3-2, nos poliadenilasyon
sinyali, CP4 EPSPS sekansı, kloroplast sinyal peptidi ve CaMV 35S promötörü
içeren CP4 EPSPS gen kasetinin tek bir fonksiyonel kopyasını içermektedir. Orjinal
plasmid vektörden bitkiye bu füsyon gen dışında başka bir kodlama bölgesinden
geçiş
bulunmamıştır.
İzleyen
nesillerde
bu
birleşik
genin
ayrışması
gözlenmediğinden, GTS 40-3-2 hattının birleşik gen için homozigot olduğu kabul
Bölüm 7
6
edilmiştir.6 nesil boyunca yapılan DNA analizleri, gen entegrasyonunun sabit
kaldığını göstermiştir.
Güncel karakterizasyon çalışmaları, DNA entegrasyonu sırasında farklı düzenlemeler
meydana geldiğini göstermiştir. Roundup Ready® soya 40-3-2, işlevsel olan birincil
gen entegrasyonu bölgesi haricinde 250 bp ve 72 bp’lik iki küçük, fonksiyonel
olmayan DNA dizisi daha içermektedir (Mansanto 2000, Windels ve ark. 2001).
Şekil 3. Roundup Ready® soya vaka 40-3-2 geliştirmek için kullanılan PV-GMGT04
plazmid (Monsanto, 2000)
Düzenleme Kararı
Roundup Ready® (RR) soya şu anda Avrupa Birliğinde pazara sunum için onaylanan
tek transgenik soya hattıdır. 1994’de ABD’de onay almasından sonra Avrupa Birliğine
ithaline 96/281/EC Komisyon kararı ile 3 Nisan 1996’da onay verilmiştir. Bu karar
yanlızca tohumun Avrupa Birliğine ithaline, kısmi olarak soya içeren besin, hayvan
gıdası gibi canlı olmayan ürünlerin endüstriyel işlenmesi amacı ile üretimi için izin
verir.
Bölüm 7
7
MON810 Mısırın Özellikleri 2
Kısa Tanımlama
İsim
Vaka MON810 mısır (ticari ismi Yieldgard®)
Başvuran
Monsanto Canada Şirketi
Bitki Türü
Zea mays L. (mısır)
Yeni Özellikler
Avrupa Mısır kurduna direnç (Ostrinia nubilalis)
Partikül bombardımanı (biyolistik)
Önerilen Kullanım
İnsan tüketimi için Z. mays üretimi (tohum yağı ve yaş
veya kuru öğütme) ve çiftlik hayvanları besini olarak
Temel Bilgi
Mısır MON810 (YieldGard®) Avrupa Mısır kurduna (ECB, Ostrinia nubilalis) dirençli
olarak Monsanto Canada Şirketi tarafından geliştirilmiştir. Geleneksel pestisitler
kullanılmadan ECB’nin larval dönemlerinde sebep olduğu ürün kayıplarını önlemek
için bir yöntem sağlamıştır.
MON810 bitki hücrelerine mikroprojektil bombardıman ve rekombinant DNA
teknolojisi yolu ile, doğada bulunan insektisidal (böcek öldürücü) proteini (Bacillus
thuringiensis ssp. Kurstaki’den) kodlayan genin aktarılması ile geliştirilmiştir. Bu
protein ECB’nin de dahil olduğu kelebek ve güveleri içeren bazı Lepidoptera türlerine
karşı aktiftir. MON810’da ifade edilen insektisidal protein CRYIA(b) δ-endotoksinin
kısaltılmış bir gen versiyonu ile ifade edilir ve mısır bitkilerini ECB larvaları tarafından
verilen yaprak ve bitki sapı zararından korur.
Yeni Karakterin Tanımı
Avrupa Mısır kurduna direnç
Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki endospor oluşturan, gram pozitif, toprakta
yaşayan bir bakteridir. Sporogenik döneminde endospora ek olarak Avrupa mısır
kurdu (ECB), Ladin tomurcuk kurdu, Çingene güvesi, Diamondback güvesi, Tütün
tomurcuk kurdu, Lahana kurdu gibi bazı lepidoptera böceklere karşı, aralarında aktif
2
Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar 97-19’dan alınmıştır.
Bölüm 7
8
CRYIA(b) δ-endotoksin aktif proteini de olmak üzere bir çok insektisidal protein
kristali üretmektedir.
Bu proteinin insanlara, diğer omurgalılara ve yararlı böceklere toksik olmadığı
defalarca gösterilmiştir (Lee ve ark. 1995). MON810, konstitütif CaMV 35S promotörü
ve HSP70 intron lider sekansının kontrolünde olan tek kopya cryIA(b) geninin
aktarılması yoluyla geliştirilmiştir (Şekil 4).
Bacillus thuringiensis ssp.HD-1’den alınan cryIA(b) genini kodlayan sekans,
CRYIA(b) δ-endotoksin proteinin bitkilerde ifadesini en iyi şekilde arttırmak için
modifiye edilmiştir. Protein kırılma sonrası tripsin dirençli bio-aktif bir moleküle
dönüşür ve lepidopteran larvalarına toksik hale gelir. İnsektisidal aktivitenin, bu aktif
proteinin hassas böceklerin orta bağırsak epitel hücrelerindeki özel alıcılara
tutunmasına bağlı olduğu düşünülmektedir. Bunu izleyen gözenek oluşumu ozmotik
dengeyi bozarak hücrenin patlamasına yol açar. Bu proteine hassas olan mısırın
lepidoptera zararlıları ECB ve mısır kulakkurdu’dur.
Değiştirilmiş mısırda ifade edilen toksinin aminoasit sekansının doğada bulunan
proteinle aynı ve organik besin endüstrisi tarafından biopestisit olarak yaygın biçimde
kullanılan protein ile eşdeğer olduğu tespit edilmiştir.
P-E35S
hsp70
cryIA(b)
T-nos
Şekil 4. MON810 mısırda kullanılan PV-ZMBK07 plasmidinde yer alan cryIA(b) gen
kasetinin ve hsp70 intron 1’in şematik gösterimi (BATS, 2003).
P-E35S: geliştirilmiş CaMV 35S promotör
hsp70: mısır hsp70 intron 1 sekansı
sentetik cry1A(b)geni
T-nos terminasyon sekansı
Bölüm 7
9
Geliştirme Metodu
MON810 PV-ZMBK07 ve PV-ZMGT10 plazmidlerinin biyolistik yöntemi ile birlikte
mısır genotipi Hi-II’ye aktarılması ile elde edilmiştir. PV-ZMBK07 plazmidi cryIA(b)
genini (Şekil 5) PV-ZMGT10 plazmidi ise CP4 EPSPS ve gox genlerini taşımaktadır.
Her iki plazmid de E. coli’de replikasyon için gerekli olan pUC plasmidi replikasyon
orijin sekansını(ori-pUC) ve bakteri promotör kontrolu altında nptII genini (bakteri
seçimi için) taşımaktadır. Her iki vektör de bitki kültürü hücrelerine mikroprojektil
bombardımanı ile aktarılmıştır. Aktarılan hücrelerden Glufosat dirençli olanlar
seçilmiş ve bitki rejenerasyonu için gerekli doku kültürü ortamlarına alınmıştır
(Amstrong ve ark. 1991)
Yazarlar
tarafından
sağlanan
moleküler
analizlerde,
sadece
PV-ZMBK07
plazmidindeki genetik elementlerin MON810 genomuna tek bir kopya olarak yerleştiği
görülmüştür. Geliştirilmiş CaMV 35S promotörü, hsp70 ön sekansı ve kısaltılmış
cryIA(b) gen sekansları tam iken, gen kasedinin 3’ ucunun kopması sebebi ile PVZMBK07’de bulunan nos 3’ terminasyon sinyalinin kaybolduğu, bu nedenle alıcı
genomuna yerleşmediği tespit edilmiştir (BATS 2003).
Şekil 5. MON810 mısırda kullanılan PV-ZMBK07 plasmidinin şematik gösterimi
(Agbios Database, Essential Biosafety)
Bölüm 7
10
Bitki Genomuna Sabit İntegrasyon
Yazarlar tarafından sağlanan veriler, segregasyon ve stabilitenin, cryIA(b) geninin
MON810 genomuna tek bir bölgeden entegre olmuş olması ile uyum gösterdiğini
ortaya koymaktadır. Entegrasyon stabilitesi birçok nesil boyunca çaprazlama ile
gösterilmiştir.
Bu
mısır
hattı
farklı
mısır
genotipleri
ile
4
nesil
boyunca
çaprazlandığında ECB’ye karşı direnç devam etmiştir. MON810 hattı üçüncü
nesilden geri çaprazlama yolu ile elde edilmiştir. Üç nesil boyunca bu tekli
yerleşmenin sabit integrasyonu Southern Blot analizleri ile gösterilmiştir.
Düzenleme Kararı
Mısır hattı MON810’un Birleşik Devletlerde ekilmesi Temmuz 1996’da Çevre Koruma
Ajansı tarafından onaylanmıştır. Bu mısır hattının Avrupa Birliğinde ticarileşmesi 22
Nisan 1998 tarih 98/294/EC nolu Komisyon kararı ile teyit edilmiştir
(Komisyon
Kararı 98/294/EC).
Kanada Besin Teftiş Ajansı, bu mısır hattının besin ve yem olarak onayını Karar
Dokümanı 97-101 ile yayınlamıştır. MON810 hattı Arjantin, Avustralya, Japonya,
Güney Afrika ve İsviçre’de onaylanmıştır. Bu mısır hattı insan tüketimi için (yaş ve
kuru öğütme ve tohum yağı) ve çiftlik hayvanlarının yemi olarak tasarlanmıştır.
Bölüm 7
11
Bt-176 Mısırın Özellikleri 3
Kısa Tanımlama
İsim
Vaka 176 Bt mısır
Başvuran
Ciba-Geigy Ciba Tohumculuk ve Mycogen Şirketi
Bitki Türü
Zea mays L. (mısır)
Yeni Özellikler
Avrupa mısır kurduna direnç (Ostrinia nubilalis),
glufosinat amonyum herbisitine tolerans
Olgunlaşmamış embryolarda partikül bombardımanı
(biyolistik)
Önerilen Kullanım
Hibrid tane mısır olarak tarım (yetiştirme)
Temel Bilgi
Ciba Tohumculuk ve Mycogen Anonim Şirketi Avrupa Mısır kurduna (ECB) dirençli
bir mısır hattı geliştirmişlerdir. Vaka Bt-176 olarak tanımlanan bu mısır hattı,
embriyolara mikroprojektil bombardıman ve rekombinant DNA teknolojisi yolu ile
doğada bulunan, insektisidal bir proteini (Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki’den)
kodlayan genin aktarılması ile geliştirilmiştir. Bu protein Lepidoptera takımına ait,
ECB’nin de dahil olduğu bazı kelebek ve güve türlerine karşı aktiftir. Bu protein
doğadaki CRYIA(b) δ-endotoksinin en sekansı kısaltılmış bir versiyonudur şeklidir ve
mısır bitkilerini ECB larvaları tarafından verilen zararlardan korur. Buna ek olarak bu
hat mısıra, genetik olarak değişikliğe uğratılmış bitkileri
çok erken gelişme
dönemlerinde seçip ayrıştırabilmek için herbisit glufosinat amonyum herbisitine
direnç sağlayan bir başka gen de aktarılmıştır.
Yeni Karakterlerin Tanımlanması
Avrupa mısır kurduna (ECB) direnç
Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki endospor oluşturan, gram pozitif, toprakta
yaşayan bir bakteridir. Sporogenik döneminde endospora ek olarak Avrupa mısır
kurdu (ECB), Ladin tomurcuk kurdu, Çingene güvesi, Diamondback güvesi, Tütün
tomurcuk kurdu, Lahana kurdu gibi bazı lepidoptera böceklere karşı, aralarında aktif
3
Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar 96-09’dan alınmıştır.
Bölüm 7
12
CRYIA(b) δ-endotoksin aktif proteini de olmak üzere bir çok insektisidal protein
kristali üretmektedir.
Bu proteinin insanlara, diğer omurgalılara ve yararlı böceklere toksik olmadığı
defalarca gösterilmiştir (Lee ve ark. 1995).
Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki HD-1 suşundan alınan sentetıik cryIA(b) geni,
CRYIA(b) δ-endotoksin proteinin daha kısa bir versiyonunu kodlar. Bu gen mısırdaki
ifadesini arttırmak için sentetik olarak geliştirilmiştir ve nükleotid dizini düzeyinde
doğal genle %65’lik bir homoloji göstermektedir (Koziel ve ark. 1993). Kısaltılmış
cryIA(b) geni doğal CRYIA(b) proteinin insektisidal aktivite gösteren bölgesini
içermektedir. İnsektisidal aktivitenin, bu aktif proteinin hassas böceklerin orta
bağırsak
epitel
hücrelerindeki
özel
alıcılara
tutunmasına
bağlı
olduğu
düşünülmektedir. Bunu izleyen gözenek oluşumu ozmotik dengeyi bozarak hücrenin
patlamasına ve böceğin ölümüne yol açar
Vaka Bt-176 iki ayrı sentetik cryIA(b) gen konstrüksiyonu taşıyan bir vektörün
transformasyonu ile elde edilmiştir. Konstrüksiyonların birinde cryIA(b) geni mısır
fosfoenolpiruvat-karboksilaz
(P-PEPC)
promotörünün
transkripsiyonel
kontrolü
altındadır ve sadece yeşil dokularda ifade edilir. İkinci konstrüksiyonda aynı gen mısır
kalsiyuma bağlı protein kinaz promotörü (P-CDPK) kontrolü altındadır ve özellikle
polende ifade edilir. Her iki konstrüksiyonda da gen kaseti Karnıbahar Mozaik Virüs
kökenli terminatör ile durdurulur. Gen kasetleri ayrıca mısır fosfoenolpiruvatkarboksilaz geninin intron 9 parçasını içermektedir (bakınız Şekil 6 ve Şekil 7).
CRYIA(b) proteinin yeşil dokularda ifadesi ilk nesil yapraklar üzerinde beslenen ECB
larvalarına karşı direnç kazandırmak için tasarlanmıştır. Polendeki ifade ise polen
üzerinde beslenen ikinci nesil ECB larvalarını hedef alarak tasarlanmıştır. Bt-176
yapraklarından elde edilen CRYIA(b) proteini, memeli mide koşulları taklit edilerek in
vitro sindirim denemelerine maruz bırakılmış ve geleneksel besin proteinleri gibi
parçalandığı gösterilmiştir.
P-CDPK
cryIA(b)
T-35S
PEPC Intr # 9
Şekil 6. CDPK promotör kontrolü altında sentetik cryIA(b) gen kaseti şematik
gösterimi (Matsuoka ve ark., 2000).
Bölüm 7
13
PEPC Intr # 9
T-35S
cryIA(b)
P-PEPC
Şekil 7. PEPC promotör kontrolü altında sentetik cryIA(b) gen kaseti şematik
gösterimi (Matsuoka ve ark., 2000).
Glufosinat amonyum herbist toleransı
Glufosinat amonyum tolerans geni (bar geni) toprak bakterisi Streptomyces
hygroscopicus’dan elde edilmiştir. Bu gen CaMV35S konstitütif promotörünün
transkripsiyonel kontrolü altında fosfinotrisin asetiltransferaz (PAT) enzimini kodlar
ve polen dışında bütün bitki dokularında aktiftir. Fosfinotrisin, glutamin sentetaz
inhibitörüdür ve glufosinat amonyum’un aktif içeriğidir. Fosfinotrisinin herbisidal
aktivitesi glutamin sentetaz enziöiminin inhibe edilmesi ile bitkide öldürücü
miktarlarda amonyum akümülasyonu ile sonuçlanır. PAT fosfinotrisin asetilasyonunu
katalize eder ve herbisidal aktivitesini ortadan kaldırır.
Fosfinotrisin’in L-izomeri (L-PPT) yaygın olarak yabani ot kontrolünde kullanılır. LPPT glufosinat amonyumun herbisitinin aktif maddesidir. Hoechst tarafından
geliştirilmiştir ve BASTA ticari ismi ile anılır. Bu izomer glutamin sentetazın substratı
olan glutamatın yapısal analoğudur (L-PPT ve glutamatın karşılaştırılması için
bakınız Şekil 8).
Şekil 8. L-PPT (sol) ve glutamatın (sağ) karşılaştırılması
Bölüm 7
14
L-PPT ilk olarak Streptomyces viridochromogenes’den izole edilmiştir. Bu organzima
yanlızca fosfinotrisin L-izomerini sentezler. Sentetik glufosinat amonyum PPT’nin Dve L- izomerlerinin eşit mollarda rasemik bir karışımıdır (D-PPT herbisidal aktivite
göstermez). PAT enzimi fosfinotrisin üzerinde etki gösterir,piruvat, kolin ve serin
içeren diğer yaygın asetiltransferaz substratları üzerinde etkisi gözlenmemiştir.
Memeli mide koşullarının taklit edildiği, E.coli tarafından ifade edilen PAT enzimi
varlığında gerçekleştirilen in vitro sindirim çalışmalarında bu proteinin geleneksel
besin proteini gibi sindirildiği görülmüştür.
Glufosinat amonyum tolerans geni, bitki ıslahı sırasında transfer edilen
genlerin
izlenebilmesi ve transforme olan embryoların seçici ortamda tanımlanabilmesi için
markör olarak bitkiye aktarılmıştır. Rapor edilen (FSANZ 2000), moleküler veriler, BT176 vakasının karnıbahar mozaik virüsü 35S promotörü ve 35S terminatörü (sırasıyla
P-CaMV-35S ve T-35S) kontrolünde tek kopya bar geni taşıdığını işaret
etmektedir(bakınız şekil 9).
P-35S
bar T-35S
Şekil 9. bar genine ait şematik gösterim (Matsuoka ve ark., 2000)
Geliştirilme Metodu
Bt-176 vakası iki plazmidin biyolistik transformasyon yolu ile kendilenmiş mısır hattı
CG00526 (Zea mays L.) ‘ya aktarılması sonucu elde edilmiştir. İki sentetik cryIA(b)
geni tek bir plazmide (pCIB4431) birlikte klonlanmıştır. Aktarılan ikinci plazmid
vektörü (pCIB3064), toprak bakterisi Streptomyces hygroscopicus’dan izole edilen
herbisit tolerans geni (bar) taşımaktadır. İki vektör, mısır hattı CG00526’ın
olgunlaşmamış embriyolarına partikül bombardıman yoluyla aktarılmıştır. Gen
aktarılan bitkilerde yapılan moleküler analizler bu mısır vakasının genomuna her
plazmid vektörün iki ya da daha fazla kopyasının yerleştiğini göstermiştir. Testler ve
Northern Blot analizleri, bakteri geriplanında vektörleri seçmek amavı ile aktarılmış
olan bakteri promotörü tarafından kontrol edilen ampisilin direnç geninin (bla geni)
Bölüm 7
15
yaprak dokusu ya da polende ifade edilmediğini göstermektedir. İki bağımsız
transgenik mısır bitkisi daha sonraki çaprazlama ve karakterizasyon için seçilmiştir:
Vaka 171 ve Vaka 176 (Koziel ve ark. 1993).
Buna ek olarak yapılan karakterizasyon çalışmaları Bt-176 mısırda cry1A(b) (Koziel
ve ark 1993), bar ve bla genleri (Privalle 1994) bulunduğunu ispatlamıştır. Yeni
Zelanda gıda standartları (FSANZ 2000) tarafından rapor edilen verilere göre Bt-176
mısır DNA Southern Blot analizleri ile görüldüğü üzere, bu vakada 6 kopyaya kadar
cry1A(b)
ve bla geni ve en az iki kopya bar geni (35S promotörü ile birlikte)
bulunabilir (Privalle 1994).
Karakterlerin Yerleşmesindeki Sabitlik
Rapor edildiği üzere (FSANZ 2000), serada büyüyen bitkilerin polen ve yeşil
yapraklarında CRY1A(b) ve PAT protein üretimi 4 başarılı geri çaprazlama nesli
boyunca sabit kalmıştır. Segregasyon analizleri ECB’ye direnç ve herbisit toleransı
özelliklerinin Mendel karakterleri gibi ko-segrege olduğunu göstermiştir. 3240 bitki
üzerinde yapılan bir çalışmada yalnızca 5 bitki (%0,15) glufosinat amonyuma dirençli
fakat ECB larvalarının zararlarına karşın hassas bulunmuştur.
Düzenleme Kararları
Ağustos 1995’de, ABD Çevre Koruma Birimi 2000 yılına kadar Vaka 176’dan gelen
tarla mısırının ticarileştirilmesini koşullu olarak onaylamıştır.
Bu mısır hattının Avrupa Birliğinde ticarileşmesi için gerekli komisyon kararı
(97/98/EC) 23 Ocak 1997’de yasallaşmıştır. Bu mısır hattı ziraai, endüstriyel
işlemlerde tohum olarak ve hayvan besini olarak üretimi ve tohum üretimi amacıyla
ekilmek üzere tasarlanmıştır (Komisyon Kararı 97/98/EC).
Bölüm 7
16
Kaynaklar
Agbios database on Essential Biosafety. Molecular Characterization of MON810
inserted DNA. http://www.agbios.com/main.php (accessed January 2010)
Armstrong, C.L., Green, C.E. and Phillips, R.L. (1991). Development and avaibility of
germplasm with high type II culture formation response. Maize Genetics
Cooperation Newsletter 65, 92-95.
BATS (2003). Genetically Modified (GM) Crops: molecular and regulatory details.
http://www.bats.ch/gmo-watch/index.php (accessed January 2010)
Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety
Office. Decision Document DD96-09: Determination of Environmental Safety of
Event 176 Bt Corn (Zea mays L.) Developed by Ciba Seeds and Mycogen
Corporation.
http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9609e.shtml
(accessed January 2010)
Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety
Office. Decision Document DD95-05: Determination of Environmental Safety of
Monsanto Canada Inc.s Glyphosate Tolerant Soybean (Glycine max. L.) Line
GTS
40-3-2.
Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety.
Decision Document 97-19: Determination of the safety of Monsanto Canada
Inc.’s
Yieldgard
TM
Insect
Resistant
Corn
(Zea
mays
L.)
MON810.
(accessed
January 2010)
Commision Decision 97/98/EC of 23 January 1997 concerning the placing on the
market of genetically modified maize (Zea mays L.) with the combined
modification for insecticidal properties conferred by the t-endotoxin gene and
increased tolerance to the herbicide glufosinate ammonium, pursuant to Council
Directive 90/220/EEC.(OJ L 31,1.2.1997, p.69)
Bölüm 7
17
Commision Decision 96/281/EC of 3 April 1996 concerning the placing on the market
of genetically modified soyabeans (Glycine max L.) with increased tolerance to
the herbicide glyphosate, pursuant to Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 107,
30.4.1996), p. 10)
Commision Decision 96/294/EC of 22 April 1998 concerning the placing on the
market of genetically modified maize (Zea ays L. line MON810) pursuant to
Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 131, 5.5.1998, p. 33).
Foods Standarts Australia New Zealand-FSANZ (formerly Australia New Zeland
Food Authority-ANZFA) (2000). Draft risk analysis report. Food produced from
insect-protected
Bt-176
corn.
Application
385,
http://www.foodstandards.gov.au/_srcfiles/A385%20FA.pdf (accessed January
2010)
Koziel, M. G.et al. (1993). Field performance of elite transgenic maize plants
expressing
an
insecticidal
protein
derived
from
Bacillus
thrungiensis
BIO/Technology 11, 194-200.
Lee, T.C., Zeng, J., Bailey, M., Sims, S.R., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1995).
Assessment of equivalence of insect protected corn- and E-coli –produced B.t.k.
HD-1 protein. Plant Physiol. Suppl. 108, 151.
Matsuoka, T., Kawashima, Y., Akiyama, H., Miura, H., Goda, Y., Kusakabe, Y.,
Isshiki, K., Toyota, M. and Hino. A. (2000). A method of detecting Recombinant
DNAs from four lines of genetically modified maize. Journal of Food Hygienic
Society of Japan 41, 137-143
Monsanto Company (2000). Updated Molecular Characterization and safety
Assessment of Roundup Ready Soybean Event 40-3-2. Monsanto Report,
Product Safety Centre.
Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Delannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,
Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Perchke, V.M., Nida,D.L.,
Taylor, N.B. and Kishore, G.M. (1995). Development, identification and
characterization of a glyphosate-tolerant soyabean line. Crop Science 35, 14511461
Bölüm 7
18
Padgette, S.R., Re, D.B., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Delannay, X., Fuchs, R.L.,
Kishore, G.M and Fraley, R.T. (1996). New weed control opportunities:
Development of soybeans with Roundup Ready gene. In Duke, S.O. (ed.).
Herbicide-Resistant Crops. Agricultural, Economic, Regulatory and Technical
Aspects. CRC Lewis Publishers., pp 53-84.
Privalle L. (1994). Quantification of Cry1A(b) and PAT proteins in Bt corn (corn)
tissues, whole plants and silage. Performing laboratory: Ciba Seeds Agricultural
Biotechnology Research Unit, Ciba-Geigy Corporation, research Triangle Park.
NC, USA. Study No CAB-009-94.
Windels, P., Taverniers, I., Depicker, A., Van Bockstaele, E. and De Loose, M.
(200!). Characterization of the Roundup Ready soybean insert. European Food
Research Technology 213, 107-112.
Bölüm 7
Gıda Örneklerinde
Bölüm 8
El Kitabında tanımlanan Nitel PCR’ın Özellikleri
Nitel PCR’ın Özellikleri
2
İçindekiler
Bölüm 8
El Kitabında tanımlanan Nitel PCR’ın Özellikleri
El kitabında tanımlanan Nitel PCR sistemlerinin özellikleri
3
Bitki spesifik PCR
3
Lektin geninin saptanması
3
Zein geninin saptanması
3
Tarama yöntemi : CaMV 35S promotör ve nos terminatörün saptanması
4
CaMV 35S promotörün saptanması
4
nos terminatörün saptanması
5
GDO spesifik PCR
7
Roundup Ready® soya CTP/EPSPS gen kasetinin spesifik saptanması
7
Bt-176 mısır cryIA(b) sentetik geninin saptanması
7
MON810 mısır E35S promotör/hsp70 ekson-intron bölgesininin spesifik saptanması
9
Kaynaklar
11
Bölüm 8
3
El Kitabında tanımlanan Nitel PCR sistemlerinin özellikleri
Kurs süresince birden fazla saptama sistemi kullanılacaktır: 1) Bitki spesifik
primerler ile örneklerden ekstrakte edilen DNA’nın varlığını ve kalitesini (amplifiye
olabilirliğini) doğrulamak amacı ile kullanılan yöntem; 2) En yaygın kullanılan
düzenleyici sekanslardan 35S promotör ve nos terminatör’ ün spesifik olarak
saptanmasına dayanan, “tarama yöntemi” olarak adlandırılan yöntem. Bu iki yöntem
için basit bir PCR protokolü izlenecektir. Son olarak, GDO-spesifik primerler
kullanılarak farklı transgenik hatların selektif saptanması ve tanımlanması için
“nested PCR” gerçekleştirilecektir. Bu bölüm Roundup Ready® soya, MON810 mısır
ve CryIA(b) geni içeren Bt-176 mısırın saptanması ve tanımlanması için kullanılan
farklı sistemlere genel bir giriş niteliğindedir. Primer dizilimi ve kompozisyonu üzerine
daha fazla bilgi için Bölüm 9’a bakınız.
Bitki spesifik PCR
Lektin geninin saptanması
Soya DNA’sının tanımlanabilmesi için soyaya özgü lektin geninin (Le1) bir parçasını
tanımlayan GMO3 ve GMO4 primerleri (Meyer ve ark., 1996) kullanılacaktır.
Yukarıda açıklandığı gibi, bu yöntemin amacı, soya içeren örneklerden ekstrakte
edilmiş DNA’nın varlığını ve kalitesini doğrulamaktır. Burada DNA kalitesi olarak
aranan vasıf, istenen PCR ile amplifiye olabilme (çoğaltılabilme) özelliğidir. GMO3 ve
GMO4 primerleri, işlenmiş gıdalardan DNA ekstraksiyonu üzerine Meyer ve Jaccaud
(1997) tarafından rapor edilmiş bir çalışmada tanımlanmış olup, nested PCR için
kullanılmaktadır. Beklenen ürün, 118 bp büyüklüğünde bir amplikondur. Bu
amplikonun varlığı, analiz edilen örnekte soya bulunduğunu doğrular.
Zein geninin saptanması
Mısır zein (10 kb’lik bir protein kodlayan Ze1,) genine spesifik ZEIN3 ve ZEIN4
primerleri, (Studer ve ark., 1997) mısır içeren örneklerden ekstrakte edilmiş DNA’nın
varlığı ve kalitesini doğrulamak için kullanılacaktır. ZEIN3 ve ZEIN4 primerleri
işlenmiş gıdalardan ekstrakte edilen mısır DNA’sının saptanması için bir nested PCR
sisteminde internal primerler olarak tasarlanmıştır. Eğer ekstrakte edilen hedef DNA
zarar görmemişse ve amplifiye olabiliyorsa, beklenen ürün 277 bp büyüklüğünde bir
Bölüm 8
4
amplikondur. Bu amplikonun varlığı, analiz edilen örnekte mısır bulunduğunu
doğrular.
Tarama yöntemi : CaMV 35S promotör ve nos terminatörün
saptanması
Bitki
kaynaklı
gıda
maddelerinde,
herhangi
bir
genetik
modifiye
girdinin
tanımlanması, tarama yöntemi olarak adlandırılan bir yaklaşımla analiz edilen
örnekte 35S promotör ve/veya nos terminatörün varlığının PCR ile saptanması
yoluyla olur . Bugüne dek AB onayı almış genetik modifiye gıdaların hemen hepsinde
bulunduğu için 35S promotör ve nos terminatörün hedef dizilimler olarak kullanımı,
birçok genetik modifiye gıdanın saptanmasını sağlamaktadır (Hemmer, 1997). AB
pazarında kabul görmüş bazı mısır hatlarının karakteristik özellikleri Tablo 1’de örnek
olarak listelenmiştir. Kurs sırasında kullanılan 35S promotör ve nos terminatör
spesifik primerleri, işlenmiş gıdada Roundup Ready® soya ve Maximizer mısır (Bt176)’ın saptanması için geliştirilen bir PCR yönteminin geçerliliğini denetlemek için de
kullanılmıştır (Lipp ve ark., 2001).
Tablo 1. AB pazarına resmi olarak giriş yapan transgenik mısırlar
Ad
Şirket
Karakter Promotör
Genler
Terminatör
Vaka 176
Ciba-Geigy
Bt, bar
35 S
PEPC
CDPK
bar
cryIA(b)/int.9 PEPC
cryIA(b)/int. 9 PEPC
35S
35S
35S
Hat Bt-11
Novartis
Bt, pat
35S
cryIA(b)/int.IVS6
nos
Hat T25
AgrEvo
pat
35S
pat
35S
Monsanto
Bt
E35S
E35S
cryIA(b)/int. hsp70
cryIA(b)/int. hsp 70
-
Hat MON810
CaMV 35S promotör saptanması
Bu promotör Roundup Ready® soya ve Bt-176 mısır gibi birçok transgenik bitkinin
gen ekspresyonunu düzenler. Spesifik saptama için p35S-cf3 ve p35S-cr4 primerleri
kullanılacaktır. Bu primerlerin CaMV 35S promotör diziliminin ilgili bölgesine
Bölüm 8
5
yerleştirildiği Şekil 1’de açıklandığı üzere, beklenen amplifikasyon ürünü 123 bp’lik bir
sekanstır.
ID
AC
FT
FT
FT
SQ
A18053_3; parent: A18053
A18053;
promoter
396..1779
/note="35S3 promoter sequence derived from cauliflower
mosaic virus isolate CabbB-JI"
Sequence 1384 BP;
nnnnnnnnnnn
1140
ctgccgacag
1200
acgttccaac
1260
atgacgcaca
1320
atttggagag
1380
aacc
1384
//
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn
nnnnnnnnn
tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag
cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga catctccact gacgtaaggg
p35S-cf3
atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc
p35S-cr4
gacacgctga aatcaccagt ctctctctat aaatctatct ctctctctat
Şekil 1. Cauliflower Mosaic virüsü (CaMV) 35S promotör dizi parçası ve p35S-cf3 ve
p35S-cr4 primerlerinin hibridizasyon bölgesi.
nos terminatör saptanması
HA-nos118-f ve HA-nos118-r
primerleri (Lipp ve ark., 2001) nos terminatörünün
saptanması için kullanılmaktadır. Nos terminatörü Roundup Ready® soya ve diğer
transgenik bitkilerde (örn. Bt-11) bulunur.
Nos terminatörün amplifikasyonu
sonucunda 118 bp’lik bir DNA sekansı ortaya çıkar. Şekil 2’de Ha-nos118-f ve HAnos118-r primerleri Roundup Ready® soya transgenik bölgesinin dizilimi üzerinde
gösterilmiştir.
Bölüm 8
151
HA-nos118-r >
nnnnnnnnnn nnnnnnnnga tccccgatct agtaacatag atgacaccgc
251
gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt
< HA-nos118-f
attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat
301
aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag
351
aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga
201
6
/ /
1601
gatccaggtg tcgccttcct tacggatcct ggcgcccatg gcctgcatgg
1651
1701
ccttgcccgt attgatgacg tcctcgcctt ccagaaggcc ggtgatgcgc
GM09 >
gtttcaccgc tcgcgagacc gccgaacatg aaggaccggt gggagatcga
1751
cttgtcgccg ggaatgcgga cggttccgga aaggccagag gatttgcggg
1801
cggttgcggg ccggctgctt gcaccgtgaa gcatgcaggc tgtagccact
1851
gatgctgaaa tcctaaagga acaaaacttt tgcataaaaa ttgaatcttt
1901
tttcaaaacc aacatagaat ttgctgaatt tttcagtttt ttagatccaa
GM08 >
aaacaagaaa acttgaagat ttaggaactt ggggtttatg gaaattggaa
1951
2001
2151
ttgggattaa gggtttgtat cccttgagcc atgttgttaa tttgtgccat
p35S-cr4 >
tcttgaaaga tctgctagag tcagcttgtc agcgtgtcct ctccaaatga
< GM07
aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg
< GM05
< p35S-cf3
tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg
2201
aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg
2251
ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt
2301
tcctttatcg caatgatggc atttgtagga gccaccttcc ttttccacta
2351
tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt
2401
ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca catcg
2051
2101
Şekil 2. Patent WO 92/04449’a göre Monsanto’dan alınan Roundup Ready® soya
transgenik bölgesinin dizilimi
Bölüm 8
7
GDO spesifik PCR
Roundup Ready® soya, Bt-176 mısır ve MON810 mısır tanımlanması için kullanılan
amplifikasyon primerleri, sırasıyla Roundup Ready® soya, Bt-176 ve MON810 mısır
genomlarına
eklenen
genetik
yapıyı
özgün
bir
biçimde
tespit
edebilme
potansiyellerinden dolayı özellikle seçilmiştir.
Roundup Ready® soyanın CTP/EPSPS gen bölgesinin spesifik saptanması
GMO9/GMO5 ve GMO8/GMO7 primerleri Roundup Ready® soya transgenik
bölgesinin nested PCR yöntemiyle spesifik olarak saptanması için düzenlenmiştir
(Meyer ve Jaccaud, 1997). GMO9 ve GMO5 eksternal primerleri, CP4 EPSPS geni
ve CaMV 35S promotörü DNA dizilimlerinin tamamlayıcısıdırlar. DNA’nin bu iki
primer ile amplifiye olması, 447 bp büyüklüğünde bir amplikon ortaya çıkmasına
neden olur. İnternal primerler olan GMO8 ve GMO7, EPSPS petunya geni ve CaMV
35S promotörünün tamamlayıcısıdır. Bu internal primerler ile amplifiye olan DNA
Şekil 2’de görüldüğü gibi 169 bp büyüklüğünde bir dizi parçası verir.
Bt-176 mısırın cryIA(b) sentetik geninin saptanması
CRYIA1/CRYIA2 ve CRYIA3/CRYIA4 primer çiftleri sentetik cryIA(b) geninin nested
PCR yöntemiyle spesifik olarak saptanması için düzenlenmiştir (Studer ve ark.,1997).
CRYIA1 ve CRYIA2 eksternal primerleri ve CRYIA3 ve CRYIA4 internal primerleri
cryIA(b) geninin DNA dizilimine tamamlayıcıdır. Şekil 3’te gösterildiği gibi, internal
primerler CRYIA3/CRYIA4 189 bp’lik bir amplikon ortaya çıkarırken iki eksternal
primer (CRYIA1/CRYIA2) 420 bp’lik bir dizi parçasını kapsar.
Bölüm 8
8
ID
I41419
standard; DNA; UNC; 1947 BP.
AC
I41419;
………
DE
Sequence 3 from patent US 5625136.
………
RA
Koziel M.G., Desai N.M., Lewis K.S., Kramer V.C., Warren G.W., Evola
S.V.,
RA
Crossland L.D., Wright M.S., Merlin E.J., Launis K.L., Rothstein S.J.,
RA
Bowman C.G., Dawson J.L., Dunder E.M., Pace G.M., Suttie J.L.;
RT
"Synthetic DNA sequence having enhanced insecticidal activity in
maize";
RL
Patent number US5625136-A/3, 29-APR-1997.
………
1..1947
FT
source
FT
/db_xref="taxon:12908"
FT
/organism="unclassified"
SQ
Sequence 1947 BP; 412 A; 729 C; 528 G; 278 T; 0 other;
atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag
60
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg
120
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg
180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc
240
gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg
300
gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac
360
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc
420
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg
480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag
540
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc
600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt
660
cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg
720
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg
780
agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc
840
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg
900
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag
960
1020
atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc
CRYIA1 forward primer outer PCR
atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc
1080
accctgagca gcaccctgta
1140 CRYIA3 forward primer
agcgtgctgg acggcaccga
1200
taccgcaaga gcggcaccgt
1260
ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg
inner (nested) PCR
gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg
ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg
CRYIA4 reverse primer inner (nested) PCR
Bölüm 8
9
ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc
1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc
1380
1440
gagttcaaca acatcatccc cagcagccaa atcacccaga tccccctgac caagagcacc
CRYIA2 reverse primer outer PCR
aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg
1500
cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc
1560
cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc
1620
atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac
1680
ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc
1740
agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac
1800
cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct
1860
cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg
1920
accgactacc acatcgatca ggtgtag
Şekil 3. Bt-176 mısıra eklenen optimize crylA(b) geni: US Patent no 5625136 ve
Genbankası Erişim no 141419’a göre (SEQ ID no.3) crylA(b) geninin dizilimi
MON810 mısırın E35S promotör/hsp70exon-intron bölgesininin spesifik
saptanması
mg1/mg2 ve mg3/mg4 primer çiftleri E35S/hsp70exon-intron bölgesininin nested
PCR ile spesifik olarak saptanması için geliştirilmiştir (Zimmermann ve ark., 1998).
Bu gen bölgesi MON810 mısıra spesifiktir. Internal primerler mg3 ve mg4 sırasıyla
E35S promotör ve hsp70 exon 1 bölgesinin DNA diziliminin tamamlayıcısıyken, mg1
ve mg2 external primerleri sırasıyla E35S promotör diziliminin ve hsp70 intron 1
bölgesinin tamamlayıcılarıdır. Şekil 4’de gösterildiği gibi iki eksternal primer
(mg1/mg2) 401 bp büyüklüğünde bir amplikon üretirken mg3 ve mg4, 149 bp
büyüklüğünde bir amplikon üretir.
Bölüm 8
10
hsp70 intron
hsp70 exon 1
Plant P-E35S
DNA
hsp70 intron 1
hsp70 exon 2
401 bp
mg1
149 bp
mg3
mg2
mg4
Şekil 4. Geliştirilmiş CaMV 35S promotörü, mısır hsp70 intronu ve sırasıyla mg1,
mg2, mg3 ve mg4 primerlerinin göreceli konumlarını da içerecek biçimde MON810
mısır gen kasetinden bir bölgenin şematik gösterilmesi (Zimmermann ve ark., 1998)
Bölüm 8
11
Kaynaklar
Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and
Detection Methods. Biosafety Research and Assessment of Technology
Impacts of the Swiss Priority Program Biotechnology – Report 2/97, 61
pages.
http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php
Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and
Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain
reaction for the detection of genetically modified organisms in various
processed foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.
Meyer, R., Chardonnens, F., Hubner, P. and Luthy, J. (1996). Polymerase chain
reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of soya
in processed meat products. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung A 203, 339-344.
Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in
processed food products: development and validation of a PCR assay for the
specific detection of Glyphosate-Tolerant Soybeans. Proceedings of the
EURO FOOD CHEM IX Conference, Interlaken, Switzerland, Event No. 220
1, 23–28.
Studer, E., Dahinden, I., Lüthy, J. and Hübner, P. (1997). Nachweis des
gentechnisch
veränderten
“Maximizer"-Mais
mittels
der
Polymerase-
Kettenreaktion (PCR). Mitteilungen aus dem Gebiet der Lebensmittel und
Hygiene 88, 515–524.
Zimmermann, A., Liniger, M., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). A sensitive detection
method for genetically modified MaisGardTM corn using a nested-PCR
system. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 31, 664-667.
Bölüm 8
Gıda Örneklerinde
Bölüm 9
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready
Soya’nın PCR ile Nitel Saptanması
M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya’nın PCR ile Nitel Saptanması
2
İçindekiler
Bölüm 9
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya’nın PCR ile
Nitel Saptanması
Deneysel
3 Giriş
3 Bitki spesifik PCR : Soya - Lektin
6 Bitki spesifik PCR : Mısır - Zein
9 Genetik yapısı değiştirilmiş bitkilerin saptanması için Tarama metodu
12 35S Promotörün Saptanması
12 nos Terminatörün Saptanması
14 MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready® soyanın nested PCR ile spesifik
saptanması
17 MON810 mısırın saptanması
17 Bt-176 Mısırın Saptanması
21 Roundup Ready Soyanın Saptanması
Bölüm 9
3
Deneysel
Giriş
Aşağıdaki protokoller, işlenmiş ve işlenmemiş materyalde genetiği değiştirilmiş (GDO)
organizmaları, GDO olmayan örneklerle (soya ve mısır) karşılaştırarak, PCR’a dayalı tarama
(35S promotör ve nos terminatör kullanılarak) ve spesifik tanımlama (Roundup Ready
soya, MON810 mısır ve Bt-176 mısır) yöntemlerini açıklamaktadır.
Bu yöntemlerde sonuçlar, örnekte hedef dizinin varlığı/yokluğu şeklinde araştırılmakta ve
yalnızca nitel sonuç vermektedir.
Ekipmanlar

Mikro pipetler

Termal cycler

Setüstü Santrifüj (Mikrosantrifüj)


Reaksiyon tüpleri için taşıyıcı raf

0,2 ml’lik PCR reaksiyon tüpleri

1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüpleri

UV lambalı çeker ocak bulunan ayrı bir steril oda
DİKKAT
Bütün ekipmanlar DNA bulaşıksız olmalı ve kullanımdan önce sterilize edilmiş olmalıdır.
Kontaminasyonu önlemek için, filtreli pipet uçları kullanılmalıdır.
Çözeltiler

dATP
CAS 1923-31-7

dCTP
CAS 102783-51-7

dGTP
CAS 93919-41-6

dTTP
CAS 18423-43-3

10x PCR tampon solusyonu (genellikle Taq Polimerazın satın alındığı firma
tarafından sağlanır)
Bölüm 9

25 mM MgCl2

Taq DNA Polimeraz

5’ ve 3’ primer solusyonları

Mineral yağ (kapak ısıtmasız PCR kullanıldığında gereklidir)

Nükleaz ari su
4
4mM dNTP Stok çözeltisi

dNTPler eşit konsantrasyonlarda dATP, dCTP, dGTP, dTTP içeren önceden
karıştırılmış stok çözelti olarak veya her biri ayrı konsantre stoklarından sağlanabilir.
Herbiri ayrı ayrı olan stoklar kullanıldığında, her dNTP, son konsantrasyonda 4 mM
dNTP stok çözeltisi olacak şekilde steril deiyonize suda çözülür.

Tüplere dağıtılır ve –20°C’ de saklanır. dNTP’ler bir kaç ay stabildir.
20 µM primer çözeltisi
Primer olarak kullanacak oligonükleotidler genelde liyofilize şekilde elde edilir ve son
konsantrasyonu 20 µM olacak şekilde seyreltilir.

20 µM primer çözelti, sağlandığı firmanın açıklamaları doğrultusunda hazırlanır
-
1 µM=1 pmol/µl ise 20 µM=20 pmol/µl
-
X nmol primer + 10X µl steril su = 100 pmol/µl = 100 µM
-
65C’de 5 dakika inkübe edilir, karıştırılır ve 65C’de 3 dakika daha inkübe edilir.
-
Dilüsyon 1:5  Bir ependorf tübe 400 µl steril su hazırlanır ve primer
çözeltisinden 100 µl eklenir (100 µM)  Son konsantrasyon: 20 µM

Küçük miktarlara bölünerek tüplere dağıtılır ve –20C’de saklanır. Bu saklama
koşulunda primerler en az 6 ay stabildir. Liyofilize primerler –20C’da 3 yıl boyunca
stabil olarak sakalnabilir.
10X PCR tamponu

500 mM KCl, 100 mM Tris HCl (25C’de pH 9,0) ve %1 Triton X-100 içeren 10X PCR
tampon solusyonu genelikle Taq DNA polimeraz ile birlikte temin edilir ve kullanıma
hazırdır. Tampon her kullanımdan önce karıştırılmalı ve kısa süreli santrifüj
edilmelidir.

Tüplere dağıtılan tampon solusyonu –20C’da saklanır ve bir kaç ay stabildir.
Bölüm 9
5
25 mM MgCl2 Çözeltisi
“PCR düzeyi” MgCl2 çözeltisi genellikle Taq DNA polimeraz ile temin edilir ve kullanıma
hazırdır. Çözelti her kullanımdan önce vorteks ile karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir ( uzu
süreli saklama sonucu oluşabiliecek konsantrasyon değişimini önlemek için). –20C’de
saklanır.
Nükleaz içermeyen su
Master reaksiyon karışımı ve DNA’nın seyreltilmesi için kullanılacak olan steril, nükleaz
içermeyen, deiyonize su, küçük miktarlarda tüplere dağıtılarak kullanılır. Her analiz serisi
için, yeni tüpler hazırlanmalıdır.
Bölüm 9
6
Bitki spesifik PCR : Soya - Lektin
Soya DNA’sının belirlenmesi lektin geni kullanılarak gerçekleştirilir. Eğer örnekte çoğaltılabilir
soya DNA’sı bulunuyorsa GMO3/GMO4 primerleri kullanılarak PCR ile belirlenir.
GMO3 VE GMO4 Primerlerin Özellikleri
Primer
Uzunluk
Molekül Ağırlığı (g/mol)
Erime Noktası* (G/C)
Primer
Uzunluk
GMO3
GCCCTCTACTCCACCCCCATCC
22
6471,6
65,1
GMO4
GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG
23
6981,1
59,6
*50 mM’lık [Na+] varlığında
Kontroller
Her PCR analizi icin kontrol deneylerinin yapılması önemlidir. Negatif kontroller, PCR
çözeltilerinde DNA ile kontaminasyonun varlığını kontrol etmek üzere düzenlenir. Karakterize
edilecek örneklere ait pozitif kontroller PCR analizinin verimliliğini/etkinliğini ve spesifikliğini
belirlemek için önemlidir. Aşağıdaki kontroller her PCR analiz performansı için tanımlanmak
zorundadır.

Pozitif kontrol: Geleneksel/genetik modifikasyona uğratılmamış soyadan izole edilmiş
saf DNA

Negatif kontrol : Lektin geni içermeyen diğer türlerden izole edilmiş saf DNA

Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı, master karışımın negatif
kontrolü
Master Karışım Hazırlama
10 örneklik bir seri için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler
Tablo 1’de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.
Bölüm 9
7
Takip eden prosedür, 48 µl GMO3/GMO4 master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi içeren bir
reaksiyon için uygundur. Çözeltilerin tümü
master karışımın hazırlanması sırasında buz
içinde muhafaza edilir.
Tablo 1. GMO3-GMO4 master karışım
Son
Konsantrasyon
Tek örnek için master
karışım
10 örnek için master
karışım
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
20 µM oligonükleotid GMO3
Taq DNA polimeraz
TOPLAM

Bir adet 1,5 ml’lik ependorf tüp hazırlanır

Tablo 1’deki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir

GMO3-GMO4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir

0,2 ml’lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 48’er µl dağıtılır

Üzerlerine 2 µl DNA solüsyonu eklenir

Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir

Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir
PCR Programı* (GMO3-GMO4)
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Primer Bağlanması (Annealing)
Primer Uzaması (Extension)
Döngü Sayısı
95C
63C
72C
40
30 sn
30 sn
30 sn
Son Primer Uzaması (Extension)
Soğutma
72C
4C
3 dk

İlk Denatürasyon
Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur.
Bölüm 9
8
* NOT: Kurs sırasında, Perkin Elmer Gene Amp PCR System 9600, ABI 9700 thermocycler
(PCR cihazı) kullanılacaktır. Farklı model ya da marka bir cihaz kullanıldığında PCR
programlarının gerekli şekilde uyumlanması ve test edilmesi koşuluyla aynı sonuçlar elde
edilecektir 1 .
PCR Ürünlerinin Analizi
Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra, PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agarsz jel
elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile
karıştırıldıktan sonra örnekler agaroz jele (%1,5) yüklenir. Elektroforez yürütmesi 100 Volt’da
1 saattir.
Boyut markörleri (100 bp ladder, 15 µl) jelde amplikon bantların büyüklüğünü tam olarak
ölçmek
için
kenardaki
kuyucuklara
yüklenerek
yürütülür.
Yürütmeden
sonra
UV
transillüminatör ışığında jeldeki DNA’lar görüntülenir. Deney sonuçlarını kalıcı olarak
kaydetmek amacıyla jelin fotoğrafı çekilebilir.
Sonuçların Yorumlanması
GMO3 ve GMO4 primer dizisi doğal lektin geninin saptanmasında soyanın internal kontrolü
olarak kullanılır. Amplifiye edilen DNAnın soyaya ait olduğu, 118 bp büyüklüğünde lektin
spesifik bandı ile doğrulanır.
Pozitif kontrol 118 bp büyüklüğünde bir bant verecektir.Negatif kontrol ve hedef içermeyen
kontrol görünür bir bant vermeyecektir.
Eğer pozitif/negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa seçilen örneklerin PCR analizi
doğru ve geçerli değildir. Kontroller beklenen sonuçları veriyor ve örnekler 118 bp
büyüklüğünde bir bant vermiyorsa bu örnekte çoğaltılabilir soya DNA’sı bulunmuyor
demektir. Bu bölümün konusu olan protokoller nitel yöntemlerdir. Bu nedenle de sonuçlar
var/yok şeklinde alınır.
1
JRC ve WHO bu el kitabında adı geçen yahut kurs esnasında kullanılan hiç bir cihazın kullanımını
özel olarak telkin etmemektedir. Laboratuarlarımızda gerçekleştirilen analizler, alternatif ekipmanın
s’stem gereklilikleri göz önünde tutularak kolayca yinelenebilmelidir
Bölüm 9
9
Bitki spesifik PCR : Mısır - Zein
Mısır DNA’sını tanımlamak için zein geni kullanılır.
Eğer örnekte çoğaltılabilir mısır DNA’sı bulunuyorsa ZEIN3/ZEIN4 primerleri kullanılarak
PCR ile belirlenir.
ZEIN3 ve ZEIN4 Primerlerinin Özellikleri
Primer
Uzunluk
ZEIN 3
AGTGCGACCCATATTCCAG
19
5772,3
55,2
Primer
Uzunluk
ZEIN 4
GACATTGTGGCATCATCATTT
21
6410,9
51,7
Kontroller

Pozitif Kontrol : Geleneksel mısırdan izole edilmiş saf DNA

Negatif Kontrol : Zein geni içermeyen diğer türlerden izole edilmiş saf DNA

Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı Master karışımın negatif
kontrolü
10 örnek için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 2’de
verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.
Takip eden prosedür, 48 µl ZEIN3/ZEIN4 master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi içeren bir
reaksiyon için uygundur. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması sırasında buz
içinde muhafaza edilir.
Bölüm 9
10
Tablo 2. ZEIN3/ZEIN4 master karışımı
Son Konsantrasyon
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
20 µM oligonükleotid ZEIN3
20 µM oligonükleotid ZEIN4
Taq DNA polimeraz
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
TOPLAM
Tek örnek için
master karışım
10 örnek için
master karışım
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl



ZEIN3/ZEIN4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüj edilir




PCR Programı (ZEIN3/ZEIN4)
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Primer Bağlanması / Uzaması (Annealing /
Extensıon)
Döngü Sayısı
96C
60C
1 dk
1 dk
Son Primer Uzaması (Final Extension)
Soğutma
72C
4C
İlk Denatürasyon
40
3 dk

Bölüm 9
11
Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra, PCR ürünleri etidiyum bromid ile boyanmış agaroz
jel elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile
1 saattir.
ölçmek
için
kenardaki
kuyucuklara
yüklenerek
yürütülür.
Yürütmeden
sonra
UV
Sonuçların Yorumlanması
ZEIN3 ve ZEIN4 primer dizisi doğal zein geninin saptanması suretiyle mısır için internal
kontrol olarak kullanılır. Amplifiye edilen DNAnın mısıra ait olduğu, 227 bp büyüklüğünde
zein spesifik bandı ile doğrulanır.
Pozitif kontrol 227 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir.Negatif kontrol ve hedef olmayan
kontrol görünür bir bant vermemelidir.
Eğer pozitif/negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa bu deney için seçilen örneklerin
PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller beklenen sonuçları veriyor ve örnekler 227
bp büyüklüğünde bir bant vermiyorsa bu örnekte çoğaltılabilir mısır DNA’sı bulunmuyor
demektir. Bu bölümün konusu olan protokoller nitel yöntemlerdir. Bu nedenle de sonuçlar
var/yok şeklinde alınır.
Bölüm 9
12
Genetik yapısı değiştirilmiş bitkilerin saptanması için Tarama
metodu
Genler promotör ve terminatörlerin düzenleyici etkileri ile kontrol edilir. 35S promotör
(CaMV’den elde edilen) ve nos terminatör (A. tumefaciens bakterisinden elde edilen) gen
aktarımında en çok kullanılan düzenleyicilerdir. Araştırılan örneğin içeriğindeki soya ve/veya
mısırda bu düzenleyivi dizinlerinden birinin tespit edilmesi GDO varlığını gösterir.
Roundup Ready soyada 35S promotör ve nos terminatör dizinlerinin her ikisinin de
tanımlanması mümkünken, Mon810 ve Bt-176 mısırda yalnızca 35S promotör bulunur.
35S Promotörün Saptanması
p35S-cf3 ve p35S-cr4 Primerlerin Özellikleri
Primer
Uzunluk
Primer
Uzunluk
p 35S-cf3
CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG
21
6414,5
57,4
p 35S-cr4
TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC
25
7544,2
56,3
Kontroller

Pozitif kontrol : Referans materyal DNA’sı (% 0,5 GD mısır)

Negatif kontrol : %0 oranında GDO mısır içeren referans materyalden elde edilen
DNA

Hedef içermeyen kontrol : Master karışım negatif kontrolü, DNA yerine yalnızca su
içerir.
10 örnek için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 3’de
Bölüm 9
13
Takip eden prosedür, 48 µl p35S-cf3/p35S-cf4 master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi içeren
bir örnek reaksiyon için geçerlidir. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması sırasında
buz içinde muhafaza edilir.
Tablo 3. p35S-cf3/p35S-cf4 master karışım
Son
Konsantrasyon
Tek örnek için
master karışım
10 örnek için
master karışım
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
20 µM oligonükleotid p35S-cf3
20 µM oligonükleotid p35S-cr4
Taq DNA polimeraz
TOPLAM



p355-cf3/p355-cf4 master karışımı
pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli
santrifüjlenir




PCR Programı (p35S-cf3/p35S-cf4)
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Döngü Sayısı
95C
62C
72C
50
25 sn
30 sn
45 sn
Soğutma
72C
4C
7 dk

İlk Denatürasyon
Bölüm 9
14
Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agaroz jel
1 saattir.
ölçmek
için
kenardaki
kuyucuklara
yüklenerek
yürütülür.
Yürütmeden
sonra
UV
Sonuçların Değerlendirilmesi
p355-cf3/p355-cr4 primer çifti CaMV 355 promotörü saptanmasında kullanılır, elde edilen
ürün 123 bp büyüklüğünde bir bant verir. Bu promotör Roundup Ready® soya ve Bt-176
mısır gibi bir çok transgenik bitkinin gen ekspresyonunu düzenler.
Pozitif kontrol 123 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir. Negatif kontrol ve hedef içermeyen
kontrol görünen bir bant vermemelidir. Pozitif ve negatif kontroller beklenen sonuçları
vermiyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir.
Eğer kontroller beklenen sonuçları veriyor ve
örnekte 123 bp büyüklüğünde bir bant
gözlemleniyorsa örnekte modifiye DNA bulunuyor demektir.
nos Terminatörün Saptanması
HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r Primerlerinin Özellikleri
HA-nos 118-f
Primer
Uzunluk
GCATGACGTTATTTATGAGATGGG
24
7462,8
56,2
HA-nos 118-r
Primer
Uzunluk
GACACCGCGCGCGATAATTTATCC
24
7296,9
61,2
*50 mM’lık [Na] varlığında
Bölüm 9
15
Kontroller

Pozitif Kontrol : Referans materyalden elde edilen DNA (%0,5 GD RR Soya)

Negatif Kontrol: Referans materyalden elde edilen DNA (%0 GD soya)

Hedef içermeyen kontrol: Master karışımın negatif kontrolü, DNA yerine yalnızca su
içerir.
10 örneklik bir seri için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontrolleri içerir) gerekli çözeltiler
Takip eden prosedür, 48 µl HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r master karışımı ve 2 µl DNA
çözeltisi içeren reaksiyon için geçerlidir. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması
sırasında buz içinde muhafaza edilir.
Tablo 4. HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r master karışım
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
20 µM oligonükleotid HA-nos 118-f
20 µM oligonükleotid HA-nos 118-r
Taq DNA polimeraz
Son
Konsantrasyon
Tek örnek için
master karışım
10 örnek için
master karışım
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
TOPLAM



HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa
süreli santrifüjlenir




PCR Programı (HA-nos 118-f/HA-nos 118-r)
Bölüm 9
16
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Döngü Sayısı
95C
62C
72C
50
25 s
30 s
45 s
Soğutma
72C
4C
7 dk

İlk Denatürasyon
1 saattir.
ölçmek
için
kenardaki
kuyucuklara
yüklenerek
yürütülür.
Yürütmeden
sonra
UV
.
HA-nos 118-f/HA-nos 118-r primer çifti nos terminatörün saptanmasında kullanılır, elde
edilen ürünler 118 bp büyüklüğünde bir bant verir. Bu terminatör, Roundup Ready soya,
Bt-11 mısır gibi gibi birçok transgenik bitkide bulunur .
Pozitif kontrol 118 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir.
Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünen bir bant vermemelidir.
Pozitif ve negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa seçilen örneklerin PCR analizi
doğru ve geçerli değildir. Eğer kontroller beklenen sonuçları veriyor ve herhangi bir örnekte
118 bp büyüklüğünde bir amplifikasyon bandı gözlemleniyorsa bunun anlamı örneğin genetik
modifiye DNA içerdiğidir.
Bölüm 9
17
MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready® soyanın nested
PCR ile spesifik saptanması
MON810 mısırın saptanması
Bu saptama sistemi MON810 mısır için özeldir. Hedef elementler, yüksek veya arttırılmış
transkripsiyon düzeyi için yapısal birer düzenleyici olan CaMV 35S promotör ve ısı şok
protein geni hsp70 exon/intron1 bölgesi dizilimleridir.
mg1, mg2, mg3, mg4 Primerlerin Özellikleri
Primer
Uzunluk
mg1
TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC
25
7665,1
59,6
Primer
Uzunluk
mg2
TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT
25
7560,2
57,9
Primer
Uzunluk
mg3
ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC
25
7472,2
61,2
Primer
Uzunluk
mg4
GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC
25
7722,9
59,6
Bölüm 9
18
Kontroller

Pozitif kontrol: Referans materyal DNA’sı (%0,1 MON810 Mısır)

Negatif kontrol : Referans materyalden elde edilen DNA (%0 GD mısır)

Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı master karışımın negatif
kontrolü
Master Karışım Hazırlama I
Tablo 5’de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır. Bir örnek için mg1/mg2 içeren
master karışım 48 µl ve DNA çözeltisi 2 µl olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir. Master
karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır.
Tablo 5. Master karışım I (mg1/mg2)
Son Konsantrasyon
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
20 µM oligonükleotid mg1
Taq DNA polimeraz
Tek örnek için
master karışım
karışım
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
Toplam



mg1/mg2 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir




Bölüm 9
19
PCR Programı (mg1/mg2)
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Döngü Sayısı
95C
60C
72C
35
45 sn
50 sn
50 sn
Soğutma
72C
4C
3 dk

İlk Denatürasyon
Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur
Master Karışım Hazırlama II
Tablo 6’da verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.
Bir örnek için 49 µl mg3/mg4 içeren master karışım ve 1 µl ön amplifiye edilmiş DNA
çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir.
Master karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır.
Tablo 6. Master karışım I (mg3/mg4)
Son Konsantrasyon
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
Taq DNA polimeraz
Tek örnek için
master karışım
karışım
33,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
337,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
49 µl
490 µl
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
Toplam


Tablo 6’daki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir

mg3/mg4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir

0,2 ml’lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 49’ar µl dağıtılır


Bölüm 9

20
PCR Programı (mg3/mg4)
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Döngü Sayısı
95C
60C
72C
40
45 sn
50 sn
50 sn
Soğutma
72C
4C
3 dk

İlk Denatürasyon
1 saattir.
ölçmek
için
kenardaki
kuyucuklara
yüklenerek
yürütülür.
Yürütmeden
sonra
UV
Sonuçların değerlendirilmesi
mg1/mg2 ve mg3/mg4 primerleri MON810 içeren ürünlerin nested PCR ile spesifik
saptanması amacıyla tasarlanmıştır. Amplifikasyon ürünü olarak gözlemlenecek son nested
PCR bandı 149 bp büyüklüğündedir.
Pozitif kontrol 149 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir. Negatif kontrol ve hedef içermeyen
kontrol görünür bir bant vermemelidir. Pozitif kontrol ve negatif kontrolde beklenen sonuçlar
alınamıyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller ve örnekler
149 bp büyüklüğünde bir bant veriyorsa örnekler genetik modifiye DNA içermektedir.
Bölüm 9
21
Bt-176 Mısırın Saptanması
Hedef gen bölgesi, bitkiyi European Corn Borer gibi zararlı böceklerden koruyan cryIA(b)’dir.
CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3, CRYIA4 Primerlerin Özellikleri
CRYIA 1
Primer
Uzunluk
CGGCCCCGAGTTCACCTT
18
5394,6
59,5
Primer
Uzunluk
CRYIA 2
CTGCTGGGGATGATGTTGTTG
21
6519,2
57,6
Primer
Uzunluk
Primer
Uzunluk
CRYIA 3
CCGCACCCTGAGCAGCAC
18
5397,6
61,7
CRYIA 4
GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA
21
6479,2
57,6
Kontroller

Pozitif kontrol : Referans materyal DNA’sı (%0,1 GD Mısır)

Negatif kontrol : Referans materyal DNA’sı (%0 GD mısır)

kontrolü
Master Karışım Hazırlama I
10 örneklik bir seri için için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler
Bölüm 9
22
Bir örnek 48 µl CRYIA1/CRYIA2 içeren master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi olmak üzere
toplam hacim 50 µl’dir.
Tablo 7. CRYIA1/CRYIA2 master karışımı
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
20 µM oligonükleotid CRYIA1
Taq DNA polimeraz
Son
Konsantrasyon
Tek örnek için
master karışım
10 örnek için
master karışım
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl
Toplam



CRYIA1/CRYIA2 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli
santrifüjlenir




PCR Programı (CRYIA1/CRYIA2)
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Döngü Sayısı
95C
60C
72C
25
40 sn
40 sn
40 sn
Soğutma
72C
4C
3 dk

İlk Denatürasyon
Bölüm 9
23
Master Karışım Hazırlama II
10 örnek için gerekli çözeltiler Tablo 8’de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.
İkinci PCR’da bir örnek için 49 µl CRYIA3/CRYIA4 içeren master karışım ve 1 µl ön amplifiye
edilmiş DNA çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir.
Tablo 8. CRYIA3/CRYIA4 Master karışımı
Son Konsantrasyon
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
Taq DNA polimeraz
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
Toplam
Tek örnek için
master karışım
karışım
33,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
337,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
49 µl
490 µl



CRYIA3/CRYIA4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli
santrifüjlenir




Bölüm 9
24
PCR Programı (CRYIA3/CRYIA4)
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Döngü Sayısı
95C
60C
72C
35
40 sn
40 sn
40 sn
Soğutma
72C
4C
3 dk

İlk Denatürasyon
Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içerisine konur.
1 saattir.
ölçmek
için
kenardaki
kuyucuklara
yüklenerek
yürütülür.
Yürütmeden
sonra
UV
CRYIA1/CRYIA2 ve CRYIA3/CRYIA4 primer çiftleri nested PCR ile sentetik cryIA(b) geninin
spesifik saptanması için tasarlanmıştır. Bu primer çifti kullanılarak elde edilen amplifiye ürün
189 bp büyüklüğünde bir bant verir. Bu gen Bt-176 mısır , Bt-11 ve benzerleri gibi diğer GD
organizmalarda bulunur.
Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünür bir bant vermemelidir.
Pozitif kontrol ve negatif kontrolde beklenen sonuçlar alınamıyorsa seçilen örneklerin PCR
analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller ve örnekler 189 bp büyüklüğünde bir bant
veriyorsa örnekler genetik modifiye DNA içeriyordur.
Bölüm 9
25
Roundup Ready Soyanın Saptanması
Hedef gen, Roundup herbisidine direnç sağlayan CP4 EPSPS’dir.
GMO9, GMO5, GMO8 ve GMO7 Primerlerin Özellikleri
Primer
Uzunluk
GMO5
CCACTGACGTAAGGGATGACG
21
6479,4
59,5
Primer
Uzunluk
GMO9
CATGAAGGACCGGTGGGAGAT
21
6559,4
59,5
Primer
Uzunluk
GMO7
ATCCCACTATCCTTCGCAAGA
21
6309,6
55,8
Primer
Uzunluk
GMO8
TGGGGTTTATGGAAATTGGAA
21
6579,8
51,7
*50 mM’lık [Na] varlığında
Kontroller

Pozitif kontrol : Referans materyal DNA’sı (%0,1 GD soya)

Negatif kontrol : Referans materyal DNA’sı (%0 GD soya)

kontrolü
Bölüm 9
26
Master Karışım Hazırlama I GMO5/GMO9
Tablo 9’da verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.
İlk PCR’da bir örnek için 48 µl GMO5/GMO9 içeren master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi
olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir.
Tablo 9. Master karışım I (GMO5/GMO9)
Son Konsantrasyon
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
Taq DNA polimeraz
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,025 U/µl
Toplam
Tek örnek için
master karışım
karışım
32,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
0,25 µl
327,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
12,5 µl
2,5 µl
48 µl
480 µl



GMO5/GMO9 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir




Bölüm 9
27
PCR Programı (GMO5/GMO9)
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Döngü Sayısı
95C
60C
72C
25
30 sn
30 sn
40 sn
Soğutma
72C
4C
3 dk

İlk Denatürasyon
Master Karışım Hazırlama II GMO7/GMO8
10 örnek için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 10’da
İkinci PCR’da bir örnek için 49 µl GMO7/GMO8 içeren master karışım ve 1 µl ön amplifiye
edilmiş DNA çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir.
Tablo 10. Master karışım II GMO7/GMO8
Steril deiyonize su
10xPCR Tamponu
25mM MgCl2
4mM dNTPs
20 µM oligonükleotid
GMO7
20 µM oligonükleotid
GMO8
Taq DNA polimeraz
Son
Konsantrasyon
Tek örnek için master
karışım
karışım
1x
2,5 mM
0,2 mM
0,5 µM
33,75 µl
5 µl
5 µl
2,5 µl
1,25 µl
337,5 µl
50 µl
50 µl
25 µl
12,5 µl
0,5 µM
1,25 µl
12,5 µl
0,025 U/µl
0,25 µl
2,5 µl
49 µl
490 µl
Toplam



GMO7/GMO8 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir


Bölüm 9


28
PCR Programı (GMO7/GMO8)
Sıcaklık
95C
Zaman
3 dk
Denatürasyon
Döngü Sayısı
95C
60C
72C
35
30 sn
30 sn
40 sn
Soğutma
72C
4C
3 dk

İlk Denatürasyon
1 saattir.
ölçmek
için
kenardaki
kuyucuklara
yüklenerek
yürütülür.
Yürütmeden
sonra
UV
GMO5/GMO9 ve GMO7/GMO8 primer çiftleri nested PCR ile Roundup Ready® soyada
bulunan modoıfıye gen kasetinin spesifik saptaması için kullanılır. Bu primer çifti kullanılarak
elde edilen amplifiye ürün 169 bp büyüklüğünde bir bant verir. GMO5 ve GMO7 primerleri
CaMV 35S promotör bölgesine komplementerdir. GMO9 primeri Agrobacterium sp CP4
suşuna ait CP4 EPSPS geni ile ve GMO8 primeri de CTP EPSPS geni ile komplementerdir.
Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünür bir bant vermemelidir.
Bölüm 9
29
Pozitif kontrol ve negatif kontrolde beklenen sonuçlar alınamıyorsa seçilen örneklerin PCR
analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller ve örnekler 169 bp büyüklüğünde bir bant
veriyorsa örnekler genetik modifiye DNA içeriyordur.
Bölüm 9
Gıda Örneklerinde
Bölüm 10
GDO’ların Saptanması İçin Nicel PCR
F. Weighardt
2
İçindekiler
Bölüm 10
Giriş
3 Nicel ölçüm için kullanılan PCR yöntemleri
4 Eş zamanlı PCR (RT-PCR) tarihçesi
6
Eş zamanlı PCR (RT-PCR) ilkeleri
7 Eş zamanlı PCR kullanılarak yapılan nicel ölçüm prensipleri
13 Kaynaklar
Bölüm 10
3
Giriş
Bir gıda ürününde bır ya da daha fazla GM vakasının varlığı tespit edildiğinde
(Roundup Ready® soya, Bt 176 mısır, Bt 11 mısır, t25 mısır) bir sonraki analitik
adım, EC 1829/2003 ve 1830/2003 yasal düzenlemelerinin gereği olarak içerikte
bulunan her bir GD ürünün kesin miktarının belirlenmesidir (Şekil 1).
Yukarıda belirtilen düzenlemeler GDO’dan oluşan veya GDO içeren veya GDO’dan
üretilen tüm ürünlerin bu şekilde etiketlenmesini gerektirir. Etiketleme, gıdanın içerdiği
maddelerin herbirinin %0,9’dan fazla olmayan bir oranda GDO’dan oluşan, GDO
içeren ya da GDO’dan üretilen ürünler ve bu GDO varlığıın tesadüfi yahut teknik
olarak önlenemez olması durumunda gerekli değildir.
Tek bir tür bitkiden (mısır, soya vb.) elde edilmiş gıda içeriklerinin (un, yağ) tümü tek
bir gıda içeriği olarak düşünülür.
Şekil 1. Etiketleme gerekli değildir. GD mısır ve GD soya miktarları yasal seviyenin
altındadır.
Örneğin, yalnızca mısırdan elde edilmiş bir gıda maddesi eğer %0,9 dan daha az
oranda GD mısır içeriyorsa, bundan elde edilen gıda ürünleri için etiketleme
zorunluluğu yoktur. Diğer yandan, eğer %0,9 dan daha fazla oranda GD mısır içeriyor
ise, gıda ürünleri etiketlenmelidir. Etiketleme son üründe, farklı türlerden elde edilen
içeriklerin toplamı düşünüldüğünde (örnek: soya ve mısır) GD mısırın göreceli oranı
%0,9’un altına düşse bile geçerlidir. Eğer iki ya da daha fazla farklı GD mısır
varyetesi kullanılmış ise derişimleri hesaplanıp toplanmalı ve etikletme için toplam
yüzde oranı kullanılmalıdır (Şekil 2). Eğer sonuç %0,9 eşik değerinin altında ise
etiketlemeye gerek yoktur.
Bölüm 10
4
Şekil 2. Mısır içeriği için etiketleme gereklidir. Bt-11 (%0,6) ve Bt-176 (%0,6) toplamı
yasal seviye olan %0,9’u geçmektedir.
GDO içeriğinin göreceli oranı (yüzdesi), bir bitki türüne özel, tek kopya olarak
bulunan bir referans genin miktarına karşı (örneğin soya için lektin, mısır için zein
veya invertaz) GDO spesifik sekansın miktarı normalize ederek belirlenir. GDO
yüzdesi bu yüzden şu şekilde ifade edilir :
GDO (%) = GD-DNA / referans-DNA x100
Nicel ölçüm için kullanılan PCR yöntemleri
Geleneksel PCR’ın biri dezavantajı, amplifikasyon verimindeki değişkenlik sebebiyle
kesin nicel bilginin eksikliğidir. Her bir amplifikasyon döngüsü için reaksiyon verimi
sabit kalır ise, PCR sonrasındaki DNA konsantrasyonu, başlangıçtaki hedef DNA’nın
miktarı ile direkt orantılı olurdur. Lakin amplifikasyon verimi, değişik reaksiyonlar
arasında farklılık gösterdiği gibi, tek bir reaksiyonun ardışık döngülerinde de farklılık
gösterir. Özellikle PCR’ın son döngülerinde, amplifikasyon ürünleri, bilinmeyen
reaksiyon oranlarında, yani logaritmik olmayan bir şekilde oluşurlar.
Geleneksel PCR’a dayalı DNA miktar tayini, en yüksek duyarlılığı sağlayabilmek için,
son nokta ölçümlerine, yani amplifikasyon maksimum ürüne ulaştığında yapılan
ölçümlere dayanır. Kullanılan polimerazın aşamalı olarak termal inaktivasyonu ve
kullanılan maddelerin tükenmesi sonucunda reaksiyon, logaritmik olarak artış
gösteren fazdan çıkar. En sondaki ürünün derişimi ve başlangıçtaki hedef
moleküllerin miktarı arasındaki ilişki bu nedenle zayıftır.
Bölüm 10
5
Bu problemin üstesinden gelebilmek için, nicel karşılaştırmalı PCR ve real time (eş
zamanlı) PCR gibi teknikler geliştirilmiştir. Bunlar hedef DNA’nın derişimi ile
amplifikasyon boyunca üretilmiş olan PCR ürününün miktarı arasındaki ilişkiyi
kurmada karşılaşılan problemleri çözebilir.
Nicel karşılaştırmalı PCR (qc-PCR)
Geliştirilen ilk nicel PCR yöntemlerinden biri nicel karşılaştırmalı PCR’dır (Giacca ve
ark., 1994; Studer ve ark., 1998; Hardegger ve ark., 1999). Bu yöntem, hedef DNA
aynı primer bağlanma bölgelerini taşıyan belirli miktardaki internal DNA standardının
amplifikasyonuna dayanır. Başlangıçtaki standart DNA’nın miktarı bilindiği için,hedef
ile standart DNA’nın amplifikasyon veriminin aynı olduğu düşünüldüğünde jel
elektroforezi ile belirlenen iki PCR ürününün miktarlarının oranı, amplifikasyondan
önceki reaksiyon karışımı içerisinde bulunan hedef ve standart DNA’nın oranı ile
temsil edilir.
Genellikle standart DNA, jel elektroforezi ile belirlenebilecek iki farklı boyutta (
standart ve hedef DNAyı ayrıştırabilmek için) bant elde edebilmek üzere eklenmiş ya
da çıkarılmış bölgeler dışında hedef DNA ile aynı nükleotid sekansına sahip, lineer
bir plazmittir.
Karşılaştırmalı PCR, gerek DNA gerekse RNA miktarlarını ölçmek için başarı ile
kullanılmaktadır. Fakat dinamik aralık hedef ve standart DNA oranının yaklaşık 1:10
ile 10:1 arasında olduğu alanda sınırlınır (Şekil 3). Aslında en doğru sonuç hedef ve
standart DNA’nın 1:1 olduğu yani eşit olduğu noktada elde edilir. Bunu başarabilmek
için çeşitli dilüsyonlar test edilmeli ve hedef ile standart DNA arasındaki en uygun
oran bulunmalıdır.
Hedef DNA
Standart DNA
Şekil 3. Sabit miktarda hedef DNA ve değişik miktarlarda standart DNA’nın birlikte
amplifikasyonu sonrası jel elektroforez görüntüsü.
Bölüm 10
6
Bu yöntemin diğer bir dezavantajı ise ölçülecek her bir hedef DNA için farklı bir
standart DNA kullanma ihtiyacıdır. Amplifikasyon verimindeki küçük bir farklılık bile,
nicel karşılaştırmalı PCR vasıtası ile gerçekleştirilen nicel ölçümün doğruluğunu
tehlikeye atar. Ayrıca her karşılaştırmalı PCR reaksiyonunu takiben, genellikle
zahmetli PCR sonrası işlemler gerektiren, hedef ve standart amplikonların doğru bir
şekilde miktar tayininini gerektirir.
Karşılaştırmalı PCR sistemi yarı-nicel bir yöntemdir ve örnek ile karşılaştırılabilecek
bir standart (rakip) gerektirir. Sonuçlar yalnızca, numunenin tanımlanan standart
konsantrasyonunun altında, üzerinde ya da ona eşit olduğunu gösterir.
Karşılaştırmalı PCR yöntemi genellikle standart PCR ve moleküler biyoloji laboratuar
donanımı ile gerçekleştirildiği için, fazladan özel bir cihaz, vs. gerektirmez ve bu
yüzden avantajlı bir sistemdir.
Eş zamanlı (Real Time) PCR (RT-PCR)
Günümüzde en yaygın olarak kullanılan ve kesin sonuçlar veren nicel PCR metodu,
eş zamanlı PCR’dır (RT-PCR). Son ürün analizlerinden farklı olarak bu PCR
sistemleri, reaksiyonun gerçekleştiği zamanla eş zamanda reaksiyonu görüntüler. Bu
sistemlerdeki PCR reaksiyonunda, ardı ardına gerçekleşen döngülerde üretilen PCR
ürününün miktarı orantılı biçimde yayılan bir florasan sinyali ile ilişkilendirilmiştir. Her
bir reaksiyon döngüsünde, üretilen PCR ürününün miktarı ile orantılı olarak bu sinyal
artar. Her bir döngüde florasan sinyal miktarı kayıt edilir ve logaritmik faz boyunca
PCR reaksiyonu görüntülenir. Florasan sinyalinin ilk önemli artışı, hedef DNA’nın
başlangıçtaki miktarı ile ilişkilidir (Ahmed, 2002).
Eş zamanlı PCR (RT-PCR)’ın tarihçesi
Higuchi ve ark. (1992, 1993), PCR ürünlerinin biriktikçe tespit edilebildiği bir sistem
kurarak, PCR kinetiğinin analizine öncülük etmişlerdir. Bu eş zamanlı PCR sistemi,
her reaksiyon karışımına, DNA’ya bağlanma özelliği olan etidiyum bromid eklenmesi
presnsibi ile işlemekteydi. Numunelerin üzerine UV ışınları yayacak ve bilgisayar
kontrollü soğutulmuş CCD kamera ile ortaya çıkan florasanı tespit edebilecek şekilde
modifiye edilmiş PCR aleti kullanılıyordu. Amplifikasyon olduğunda üretilen dsDNA
miktarı artıyor ve etidiyum bromid ile bağlanıyo, bu da floresan sinyalinde bir artışa
neden oluyordu. Floresan ışığının yayılma miktarına karşı döngü sayısı bir grafiğe
dökülerek sistem amplifikasyon grafikleri oluşturuluyordu. Belirli sayıdaki döngüden
Bölüm 10
7
sonra ürün birikimini ölçümlemektense PCR sürecinin bütünü böyelikle izlenmiş
oluyordu.
Eş zamanlı PCR (RT-PCR) ilkeleri
RT-PCR yönteminin hassasiyeti, amplifikasyon reaksiyonunu oluşturmak ve izlemek
için kullanılan kimyasal yöntemlere ve oluşan sinyali gözlemlemek için kullanılan
cihaza bağlıdır. Bu amaç için geliştirilmiş pek çok kimyasal vardır: İnter kalatör
boyalar (etidiyum bromid, SYBR Green I), hibridizasyon probları (TaqMan probları,
FRET probları, moleküler fenerler, scorpions vb.).
SYBR Green I boyasına dayalı RT-PCR sistemleri
Higuchi ve ark. (1992, 1993), etidiyum bromid yerine, daha az toksik, daha spesifik,
ve daha duyarlı (10’dan ve 25 kata kadar) florasan bir dsDNA inter kalatör ajanı olan
SYBR Green I boyasını kullanarak ilk RT-PCR amplifikasyonunu gerçekleştirdiler
(Haugland, 2002).
SYBR Green I boyası, dsDNA’nın ikincil oluğuna bağlanırken ssDNA’ya bağlanamaz.
Bu bağlanmanın sonucu olarak florasan yayımı (eksitasyon 254 ve 488 nm, emisyon
560 nm) ortalama 800 ile 1000 kat artar. PCR başladığında yeni sentezlenen DNA
miktarının artması, florasan sinyalinin de artmasına neden olur (Şekil 4). SYBR
Green I tabanlı sekans tespit sistemlerinin en önemli zorluğu, bu molekülün spesifik
olmayan DNA’yı da tanıma ihtimalidir. Bu sebeple aslında PCR reaksiyonlarında
bulunan bütün dsDNA moleküllerinin, ki buna spesifik olmayan PCR ürünleri ve
primer-dimerler de dahildir, miktarı ölçülür. Bu problemin üstesinden gelmek ve
spesifik olmayan PCR ürünlerinden dolayı oluşan bu miktar tayin bileşeneni
hesaplamadan çıkartmak için erime eğrisi (melting curve) analizi yapmak
mümkündür. PCR’ın en son aşamasından sonra ürünler düşük hızda eritilir ve açığ
açıkan florasan verileri toplanır. Her farklı dsDNA spesifik bir erime sıcaklığına sahip
olduğu için tek bir reaksiyon karışımındaki farklı erime sıcaklığına sahip olan
bileşenler ölçülebilir. Böylelikle spesifik olmayan girdilerin toplam ölçümden
çıkarılması mümkün olur.
Sekans özel prob tabanlı RT PCR yöntemleri
Bir PCR reaksiyonunda çoğaltılmnak istenen amplikonun floresan yöntemlerle
tespitini
özelleştirmek
için
PCR
primer
çiftlerinin
içinde
bulunan,
floresan
Bölüm 10
8
işaretleyiciler taşıyan, sekansa özel problar kullanılır. Prob hibridizasyon işlemi (ve
takip eden degradasyon) genellikle PCR ürününün logaritmik birikimini etkilemez.
Spesifik
RT-PCR
tabanlı
ölçüm
reaksiyonları
için
birkaç
farklı
prensip
kullanılmaktadır.
Floresan rezonans Enerji Transferi (FRET) probları
FRET probları verici florofordan, alıcı fluorofora enerji transferine dayalıdır (Şekil 4)
(Haugland, 2002). FRET için temel prensipler:

Verici ve alıcı moleküller yakın olmalıdır.

Alıcı absorbsiyon spekturumu, vericinin yayılım spekturumu ile örtüşmelidir.

Verici ve alıcı dipol geçişleri hemen hemen paralel olmalıdır.
Verici ve alıcı floroforlar birbirlerine yakın iseler, vericinin mavi ışıkla uyarılması enerji
transferi ile sonuçlanır. Alıcı böylelikle daha uzun dalga boylarında ışık yayacaktır.
PCR ürünlerinin oluşumu, PCR primerlerinin yanısıra, hibridizasyon probu olarak
adlandırılan, floresanla işaretlenmiş iki adet sekans spesifik olgonükleotid prob
kullanarak görüntülenir. Hibridizasyon probları çift olarak dizayn edilir ve çiftlerden biri
verici boya (3’-Floresein), diğeri ise alıcı boya (5’-Red-640 veya 5’-Red-705) ile
işaretlenir.
FRET, uzaklığın 6. kuvveti ile orantılı azaldığı için hibridizasyon probları, hedef
DNA’nın birbirine yakın bölgelerine hibridize olacak şekilde tasarlanır (genellikle iki
bağlanma bölgesinin arasında 1-5 nükleotidlik boşluk olur). Eğer iki prob da hibridize
olur ise, iki boya da birbirine yakınlaşır ve FRET alıcı boyası flourometre ile
ölçülebilen sinyale neden olur.
Degredasyon probları (TaqMan prensibi)
TaqMan ölçümü, PCR esnasında Taq polimerazın 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesini
degredasyon probunu kesmek için kullanır (Lie ve Petropoulos, 1998). Degredasyon
probu (ya da TaqMan probu) genellikle 20-30 baz uzunluğunda bir oligonükleotidtir.
Tm’leri genellikle primerlerin Tm’lerinden 10°C yüksektir. 5’ ucunda reporter( haberci)
floresan boya 3’ ucunda quencher (söndürücü) boya bulundurur (Şekil 4). 3’ ucu
bloke olduğu için prob primer gibi uzamaz. Hedef DNA’nın varlığında prob, PCR
reaksiyonu boyunca spesifik olarak sağ ve sol primer bölgeleri arasına bağlanır.
Bölüm 10
9
Prob sağlam durumda iken reporter boyanın quencher boyaya yakınlığı, özellikle
Forster tipi enerji transferi sebebiyle, haberci floresanın baskılanmasına neden olur
(Forster, 1948; Lakowicz, 1983). Reaksiyon esnasında Taq DNA polimerazın 5’-3’
ekzonükleaz aktivitesi, eğer hedef DNA ile hibridize olmuş durumda ise, haberci ve
söndürücü boyalar arasındaki probu degrede eder. Bu, amplifikasyon ilerledikçe
floresanın artmasına neden olur. PCR ürününün birikimi haberci boya florasanında
artış görüntülenmesine yol açar. Bu işlem, her döngüde tekrarlanır ve ürünün
eksponansiyel birikimini etkilemez. FRET problarından farklı olarak degredasyon
probları her bir döngüde, bir önceki yayıma yeni boya ekleyrek floresan salar. Sonuç
olarak florasan sinyali her bir döngüde artar. TaqMan ölçümü, evrensel termal döngü
parametreleri ve PCR reaksiyon şartları kullanır. Florejenik problar için özel
gereksinim 5’ ucunda G bazının olmamasıdır. Haberci boyaya bitişik G bazı
kesimden sonra bile haberci florasanı söndürür.
Şekil 4. Eş zamanlı PCR ilkeleri.
Bölüm 10
10
Moleküler Beacon ( ikaz ışığı, bıkın)
Moleküler Beacon molekülleri stem-loop yapısı içerecek şekilde taarlanmış DNA
problarıdır. Loop (halka) sekansı probun spesifik hedefine, stem (gövde) sekansı ise
kendi içinde tamamlayıcıdır (Şekil 5) (Tyagi ve Kramer, 1996). Probun 5’ ve 3’ uçları
fluorofor ( haberci) ve quencher (söndürücü) boyalara kovalent olarak bağlanmıştır.
Stem-loop yapısı kapandığında flourofor ve quencher yakınlaşır. Bu durumda
fluorofor tarafından yayılan bütün fotonlar, quencher tarafından emilir. Komplementer
sekansların varlığında prob açılır ve hedefe hibridize olur. Floruofor quencherdan
uzaklaşır ve prob florasan sinyali vermeye başlar.
Şekil 5. Molecular beacon ilkesi
Bölüm 10
11
Scorpions
Diğer bir gelişme, “Scorpions” olarak adlandırılan prob ailesidir. Bir Scorpion stemloop yapısı taşıyan spesifik prob sekanslarından oluşurlar (Şekil 6) (Thelwell ve ark.,
2000).
Probun 5’ ucuna bağlı sinyal üreten florofor, stem-loop konfigürasyonunda 3’ ucuna
bağlı bir molekül tarafından söndürülür. Bu stem-loop yapı, primerin 5’ ucuna
bağlanmıştır. Scorpion primerinin uzamasını takiben amplifikasyon sırasında spesifik
prob aynı DNA ipliği üzerinde kendi tamamlayıcı sekansına bağlanır. Bu bağlanma
sonucu saç tokası ilmeği (hairpin loop) çözülür. Böylelikle floresan söndürülemez ve
gözlenen sinyal değeri artar. Primer ile stem sekansı arasına yerleştirilien bir PCR
susturucu, saç tokası ilmeğinin baştan sona okunmasını ve bu da özel hedef sekans
yokluğunda saç tokası ilmeğinin açılmasını engeller. Tek molekül üzerinden
bağlanma özelliği, homojen prob sistemlerine kıyasla bazı avantajlar sağlar.
Moleküler Beacon, TaqMan ce FRET analizlerinin aksine, Scorpion ölçümleri
primerlerden başka ayrı bir prob gerektirmez.
Şekil 6. Scorpion probları ilkesi
Bölüm 10
12
TaqMan MGB ( Minor groove binder, ikincil oluk bağlayıcı) probları
MGB çift sarmal DNA’nın minor oluğuna tam olarak oturan, küçük, hilal biçimli bir
moleküldür (Kutyavin ve ark., 2000). TaqMan problarında MGB grubu quencher boya
ile birlikte 3’ uca bağlıdır (Şekil 7). TaqMan probu hibridize olduğunda, MGB, prob ve
hedef sekans arasında oluşan çift sarmal DNA’nın minor oluğunu kuşatarak
bağlanmayı dengeler. Çift sarmalda nükleotidler mükemmel bir şekilde eşlendiğinde
bu dengeleme çok daha etkilidir (örneğin, sekans hiç yanlış eşlenmediğinde).
Ayırıştırıcı gücünün yanında, arttırılmış stabilizasyon, genel prob tasarımı kurallarına
hala uyulurken, TaqMan MGB problarının TaqMan standart problarıyla (genellikle 1840 mer) karşılaştırıldığında çok kısa olması demektir (genellikle 13-20 mer). TaqMan
MGB probları özellikle multipleks ölçümler olmak üzere nicel PCR için çok
avantajlıdır. Geliştirilmiş spektral performans, farklı ölçümler için duyarlılığı ve
tutarlılığı mümkün kılarken, arttırılmış hibridizasyon özelliği hedef ayrıştırmayı
kolaylaştırır. Ayrıca, daha küçük problar, sekansa özel koruma veya sapma aralıkları
gibi daha kısa hedef bölgelere uygun problar geliştirilmesine alan sağlayarak ölçüm
yapılmasını kolaylaştırabilir. Amplikon boyutu iç-ölçüm tutarlılığını geliştirebilecek
daha da kısa MGB probları kullanılarak minimuma indirilebilir.
Şekil 7. MGB probları ilkesi
Bölüm 10
13
Eş zamanlı PCR kullanılarak yapılan nicel ölçüm kuralları
Göreceli (relatif) miktar ölçümü
Bir örneğin GDO içeriği, ürünün toplam miktarında genetik değişikliğe uğramış
materyalin miktarı ile ifade edilebilir. Bu değeri gerçek zamanlı PCR’ye dayalı bir
sistemde saptamak için endojen (iç) referans genin DNA sekans kopya sayısının ve
GDO spesifik hedef DNA sekans kopya sayısının ölçülmesi gerekir ( normalleştirme
için). Referans olarak seçilen gen bitki türüne özel, haploid genom başına tek bir
kopya, aynı türün farklı hatlarında değişmeden kalan ve analiz edilen
GDO gibi
amplifiye olabilecek özellikte (bu da çok iyi bir primer-prob dizaynına bağlıdır) şekilde
seçilmiş olması gerekmektedir .Göreceli ölçümde karşılaşılabilecek problemlerden
biri kurallarda belirtilmeyen bir GDO içeriğinin yüzde olarak ortaya çıkmasıdır. Bu
yüzden GDO içeriği (yüzde olarak) saf içeriğin toplam ağırlığı üzerinden modifiye
edilmiş içeriğin ağırlığı olarak düşünülebilir (örneğin, bir örnekte bulunan mısırın
toplam
ağırlığı
üzerinden
GDO
mısırın
ağırlığı).
Analitik
bakış
açısından
düşünüldüğünde GDO yüzdesini hedef sınıfa özel sekans başına hedef DNA sekansı
olarak ölçmek uygundur. Bu tanım GDO hatlarının bazı önemli özelliklerini dikkate
almaz ve bu yüzden sonuçların yorumlanmasında şu parametreler gözönünde
tutulmalıdır:
a. Vakanın ploitliği . GDO vakası doğal çeşitten farklı bir ploitliğe sahip olabilir
(örneğin, diploid yerine tetraploid)
b. Vakanın zigositesi. GD özelliği homozigot veya heterozigot olabilir.
c. Tek bir gen kasetinin haploid genom başına düşen insersiyon sayısı. Bir gen
kaseti haploid genom başına tek bir kopya veya daha fazla kopya olarak ilave
edilebilir.
Madde c, primer-prob sistemini, gen kasetinin genoma eklenme sınırlarının
kapsayacak biçimde tasarlayarak aşılabilir. Sınır sekansları özgün olduğu için sistem
hem vaka –spesifik olacak, hem de aynı gen kasetinin birden fazla kopyasının
genoma eklenmiş olduğu durumlarda bunun miktar tayininde fazladan ölçülmesinin
önüne geçilecektir. a ve b maddeleri örnek ile homejen olan referans materyallerin
kullanımıyla deneysel olarak aşılabilir (örneğin mısır unu referans materyalinin mısır
ununu ölçmek için kullanılması). Sertifikalı referans materyallerinden
farklı olan
miktar ölçümü standartları (örneğin klonlanmış DNA sekansları veya genomik DNA
karışımları), ölçümdeki moleküler farklılıkları düzeltmek için sertifikalı referans
materyallere karşı kontrol edilebilir. a ve b maddeleriyle ilgili problemleri çözmede
Bölüm 10
14
yaygın olarak kullanılan yöntem GDO yüzdesini haploid genomlar olarak ifade
etmektir.
Tespit limiti (LOD) ve ölçüm limiti (LOQ) parametreleri ölçülen kopyaların gerçek
sayısından etkilendiği için ölçümün bu özelliği her durumda bir metot geliştirilirken
dikkate alınmalıdır.
Bir eş zamanlı GDO Ölçüm Deneyinin Planı
Bir eş zamanlı PCR analizinin planı şunları içermelidir:

GDO-spesifik hedef DNA sekansını belirlemek için tasarlanan bir PCR
sistemi,

Türe özgü GD göreceli derişimlerinin hesaplanmasında “normalleştirici” olarak
da kullanılan endojen referans gen sekansını belirlemek için tasarlanmış ikinci
bir PCR sistemi,

Hem hedef hem de endojen referans sekansları için standart eğriler. Her
deney örneği için hedef ve endojen referansın miktarı uygun standart eğriler
ile belirlenir. Hedefin miktarı, endojen referansın miktarı ile normalleştirilerek
göreceli derişim elde edilir. İstatistiksel gereklilikleri karşılamak için standart
eğriler en az 4 farklı derişim noktası içermelidir. Standart eğrinin her noktası
ve örnek en az üç farklı kez yüklenmelidir.
Buna ek olarak her analiz hem referans gen, hem de GDO ölçümleri için negatif bir
kontrol (NTC-hedef içermeyen kontrol) içermelidir. Negatif
DNA hedef
kontrolü,
pozitif DNA hedef kontrolü de ayrıca yapılabilir.
Farklı deneyler arasındaki olası istatistiksel sapmaları önlemek için referans gen
ölçümü ve GDO spesifik sekans ölçümü farklı değil aynı PCR çalışmasında
(koamplifikasyon) gerçekleştirilmelidir.
Multipleks (Çok hedefli) eş zamanlı PCR reaksiyonları
Nicel ölçüm için kullanılan cihazlara ve kimyasal ayraçlara bağlı olarak referans gen
ve GDO sekanslarının nicel ölçümlerini ayrı ayrı farklı tüpler içinde ya da aynı tüpün
içinde çoklu reaksiyon olarak uygulamak olasıdır.
Her iki durumun da avantajları ve dezavantajları vardır. Çoklu reaksiyonlar zaman ve
ayıraç açısından tasarrufludur (iki kat fazla örneği tek bir deneyde analiz etmek
mümkündür). Bu reaksiyonlar aynı tüpte meydana geldikleri için referans gen ve
Bölüm 10
15
GDO hedef gen ölçümleri arasında deneysel kurulumdan kaynaklanabilecek (setup) hataları ortadan kaldırır.Diğer yandan çoklu reaksiyonlar, iki reaksiyonun birbirini
etkilemesi ve iki reaksiyonun ayıraç tüketim hızlarının farklı olması sebebyile LOQ
açısından daha duyarsızdır. Referans gen ve GDO hedef genini ölçmek için yapılan
ayrı reaksiyonlar LOQ açısından daha duyarlıdır; fakat iki kat daha fazla ayıraca ve
gerçek zamanlı PCR aparatı üzerinde iki kat daha fazla kuyuya gereksinim duyulur.
Ayrıca bu reaksiyonlarda bir örneği ölçerken pipetleme farklılığı gibi hatalara maruz
kalma riski daha fazladır.
TaqMan problar için farklı reporter boyaların elverişliliği aynı tüpte birden daha fazla
hedefin amplifikasyonunu olası kılar.Bir Reporter boya (FAM) farklı maksimum emilim
dalga boyuna sahip olduğu için bir diğerinden (VIC) ayırt edilebilir. Farklı emisyon
dalga boylarında değişik boyaların var olması (FAM, TET, VIC ve JOE), çoklu
TaqMan ölçümlerinin yapılmasını mümkün kılar. TAMRA boyası prob üzerinde
quencher olarak, ROX reaksiyon karışımında pasif referans olarak kullanılır. En iyi
sonuçlara ulaşmak için, maksimum emilimde en fazla farka sahip olduklarından
dolayı FAM (hedef) ve VIC (endojen kontrol) karışımı önerilir. Diğer yandan, JOE ve
VIC karıştırılmamalıdır. Çoklu TaqMan ölçümleri, farklı emilim dalga boylarını tespit
etme kapasitesine sahip oldukları için, ABI PRISM 7700, 7900, 7500, 7300 ve 7000
Sekans Tespit Sistemleri’nde uygulanabilir.
Eş zamanlı PCR verinin grafik analizi
Eş zamanlı PCR uygulanırken florasan veri (Rn biriminde), döngü sayısına (veya
zamana) karşı sinyal miktarını bulmak için bir grafikle toplanır. Genellikle bu grafik,
yarı-logaritmik bir ölçekte oluşturulur. Gerçek zamanlı PCR’da üç farklı aşama
görmek mümkündür: arka plandaki sinyalle ilgili hafif dalgalanmalarının olduğu ilk “
lag” aşaması; artan paralel verilerin bulunduğu ikinci logaritmik aşama (üstel faz) ve
verilerin platoya ulaştığı üçüncü aşama (Şekil 8).
Bölüm 10
16
Şekil 8. Bir gerçek zamanlı PCR grafiği. Gerçek zamanlı bir PCR’in tipik aşamaları
işaretlenmiştir.
Gerçek zamanlı PCR’in gücü, nicel ölçümün PCR reaksiyonunun son aşamasında
(plato) değil de amplifiye olmuş DNA miktarının (Rn degerinde) giderek artan (üstel
faz) gelişiminin arka plandaki sinyalden çok daha yüksek olduğu bir noktada miktar
ölçümünün gerçekleşmesidir. Bu ölçme yöntemi, örneğin başlangıçtaki miktarı ile
amplifikasyonun ilerlediği aşama arasında direkt bir ilişki olduğu için miktar
ölçümünün doğruluğunu arttırır. Gerçek zamanlı PCR’da eşik döngüsü (CT) deneysel
olarak florasan sinyalinin üçüncü ve onbeşinci döngüsü ile on standart sapma
arasında ölçülen florasan sinyallerinin ortalamasına ulaştığı döngü olarak tanımlanır.
Başlangıçtaki Genomik DNA miktarı ne kadar yüksek olursa PCR sürecinde biriken
ürün o kadar hızlı tespit edilir ve CT değeri o kadar düşük olur. Uygulamada CT
değerini belirleyen eşik çizgisinin seçimi genellikle teknisyene kalmış bir seçimdir ve
bu da gerçek zamanlı PCR’in kişisel öğelerinden biridir. Eşik çizgisi herhangi bir arka
plan aktivitesinin ilerisinde, üstel artış aşamasına dek gelen, logaritmik gösterimde
lineer görülen bir bölgede seçilmelidir. Her durumda eşik çizgisi tekrarlanan (3lü)
analizleri
temsil
eden
paralel
grafiklerinin
çakışmaya
başladığı
seviyelere
yerleştirilmelidir. Kimi zaman logaritmik aşamanın en başında kopyalar hafif sapma
gösterebilir, bu zamanla azalır veya reaksiyon devam ederken tamamen yok olur.
Bölüm 10
17
GDO içeriğinin hesaplanması
Eş zamanlı PCR çıktısı, Rn+ (tüm parçaları içeren florasan sinyali) ve Rn(reaksiyonun arka plandaki sinyali, başlangıç ya da bir NTC örneğinin sinyali)
arasındaki fark olarak hesaplanabilen ΔRn’dir.
Bir örneğin GDO içeriği iki farklı yolla belirlenebilir:
Farklı miktarlardaki DNA’ya dayalı iki standart eğri çizilir:
Referans genine özgü bir ölçüm sistemi içeren ilk eğri
GD hedefe özgü bir ölçüm sistemi içeren ikinci eğri
Her örnek için hedef ve referans gen miktarı, standart eğriyle ara değer bulunarak
(interpolasyon) belirlenir. Daha sonra GDO DNA içeriği (yüzde olarak), GD hedef
sekans miktarı ve referans gen sekans miktarının oranı olarak hesaplanır
(GD/referans x 100).
Analizdeki örneklerin iki standart eğrinin ara değerlerinin içine düşmesi gerektiğine
dikkat edilmelidir. Bunların dışına çıkan değerler, ölçüm hataları ihtimaline karşı hariç
tutulmalıdır.
2. Karşılaştırmalı CT yöntemi (ΔΔCT): Bu yöntemde bilinen miktarda standartlar
kullanılmaz; GDO hedef sekansının göreceli miktarı ile referans gen sekansı
karşılaştırılır. Standart eğri, bilinen farklı konsantrasyonlardaki GDO (örneğin
IRMM’den sertifikalı referans materyalleri) içeriğine sahip bir dizi örnek yüklenerek
elde edilir.
Sonuç ΔΔCT (ΔCT=CT referans gen - CT GDO gen) standart eğrisidir. GDO içeriğinin
değeri bir örnek için ΔCT değeri hesaplanıp sonucu standartlardan alınan değerlerle
karsılaştırarak elde edilir.
Bu yöntemin başarılı olabilmesi için hem hedefin, hem de referans PCR sistemlerinin
amplifikasyon verimleri benzer olmalıdır. Bunu kontrol edebilmek için kullanılan
hassas bir yöntem ΔCT’nin (aynı başlangıç miktarı için iki ayrı PCR’in CT değerleri
arasındaki fark) örnekler seyreltildiğinde nasıl değiştiğine bakmaktır. İki amplikonun
verimlilikleri eşit ise log girdi miktarının CT’ye karşı çizilen grafiği yatay bir çizgi
olacaktır (<0,10 eğimli). Bunun anlamı iki PCR’in da ilk örnek miktarı kadar bir alanda
eşit şekilde verimli olduklarıdır. Eğer eşit olmayan bir verim görülürse standart eğri
yöntemi GDO ölçümü için kullanılmalıdır. Dinamik alan, sonuçların doğru olduğu,
hedeflerin
minimum
ve
maksimum
konsantrasyonları
için
belirlenmelidir.
Konvansiyonel karşılaştırmalı RT-PCR’da dinamik alan hedef-rakip oranı yaklaşık
10:1-1:10 olarak sınırlandırılır (en doğru sonuç 1:1 oranında sağlanır). Eş zamanlı
PCR çok daha geniş bir dinamik alana ulaşabilmektedir.
Bölüm 10
18
Kaynaklar
Regulation (EC) 1829/2003 of the European Parliament and of the Council of 22
September 2003 on genetically modified food and feed. OJ L 268, 18.10.2003,
pp. 1-23.
Regulation (EC) 1830/2003 of the European Parliament and of the Council of 22
September 2003 concerning the traceability and labelling of genetically modified
organisms and the traceability of food and feed products produced from
genetically modified organisms and amending Directive 2001/18/EC. OJ L 268,
18.10.2003, pp 24-28.
Ahmed, F.E. (2002). Detection of genetically modified organisms in foods.
Trends in Biotechnology 5, 215-23.
Forster, T. (1948). Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann
Phys (Leipzig) 2, 55-75.
Giacca, M., Zentilin, L., Norio, P., Diviacco, S., Dimitrova, D., Contreas, G., Biamonti,
G., Perini, G., Weighardt, F., Riva, S. and Falaschi, A. (1994). Fine mapping of a
replication origin of human DNA. Proceedings of the National Academy of
Science USA 91, 7119-23.
Hardegger, M., Brodmann, P. and Hermann, A. (1999). Quantitative detection of the
35S promoter and the nos terminator using quantitative competitive PCR.
European Food Research Technology 209, 83–87.
Haugland, R.P. (2002). The Handbook of Fluorescent Probes and Research
Products,
Ninth
Edition.
Molecular
Probes,
Inc.
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-TheHandbook.html (accessed January 2010)
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. (1992). Simultaneous
amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10, 413–
417.
Bölüm 10
19
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. and Watson, R. (1993). Kinetic PCR: Real-time
monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11, 1026–1030.
Kutyavin, I.V., Afonina, I.A., Mills, A., Gorn, V.V., Lukhtanov, E.A., Belousov, E.S.,
Singer, M.J., Walburger, D.K., Lokhov, S.G., Gall, A.A., Dempcy, R., Reed, M.W.,
Meyer, R.B. and Hedgpeth, J. (2000). 3'-minor groove binder-DNA probes
increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids
Research 28, 655-61.
Lakowicz, J.R. (1983). Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New
York, chapter 2.
Lie, Y. S. and Petropoulos, C. J. (1998). Advances in quantitative PCR technology: 5'
nuclease assays. Current Opinion Biotechnol 9, 43-48.
Studer, E., Rhyner, C., Lüthy, J. and Hübner, P. (1998). Quantitative competitive
PCR for the detection of genetically modified soybean and maize. Zeitschrift für
Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207, 207–213.
Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. and Brown, T. (2000). Mode of
action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids
Research 28, 3752-3761.
Tyagi, S. and Kramer, F.R. (1996). Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon
hybridisation. Nature Biotechnology 14, 303-308.
Vaïtilingom, M., Pijnenburg, H., Gendre, F. and Brignon, P. (1999). Real-time
quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup
Ready soybean in some representative foods. Journal of Agricultural Food
Chemistry 47, 5261–5266.
Bölüm 10
Gıda Örneklerinde
Bölüm 11
Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real-Time)
PCR ile Nicel Saptanması
N. Foti
2 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması İçindekiler
Bölüm 11
Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real-Time) PCR ile Nicel
Saptanması
Deneysel
3
Giriş
3
ABI PRISM® 7700 kullanarak Eş Zamanlı (Real-Time) PCR
3
LightCycler (Roche) kullanılarak RT-PCR
8
Kaynaklar
14
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 3 Deneysel
Giriş
Aşağıdaki protokoller, özel bir GD soya (Roundup Ready® soya) vakası için ham ve
işlenmiş materyallerde miktar tayini için kullanılan eş zamanlı PCR yöntemleridir. Bu
eş zamanlı PCR ölçümleri amplikon üretimini florasan kullanarak eş zamanda tespit
eden iki farklı PCR termal döngü cihazı ile gerçekleştirilmiştir: ABI PRISM® 7700
SDS (Applied Biosystems) ve LightCycler® (Roche).
Eş zamanlı PCR, genetik değişikliğe uğramış soya varlığını gösteren bir DNA hedef
sekansına ek olarak bir de endojen referans DNA (soyaya özgü) sekansının amplifiye
edilmesinde kullanılır. Her iki ölçüm de her biri özel DNA primerleri ve boya-işaretli
problar içeren iki farklı PCR sisteminden oluşur. Bir PCR sistemi GDO’ya spesifik
DNA sekansını tespit ederken, diğeri GD ve GD olmayan soya tespit edilmesinde
miktarsal referans olarak görev yapmak üzere tasarlanmış bir endojen referans
sistemidir.
Not: Bu kitapçığın içerdiği protokoller eğitici amaçlarla seçilmişlerdir ve eş zamanlı
(real-time) PCR yöntemi kullanarak yapılan GDO miktar tayini çalışmalarının temel
örnekleri olarak düşünülmelidirler. En son geliştirilen ve onaylanan protokoller
hakkında bilgi edinmek için uygun kaynakların ve literatürün periyodik olarak gözden
geçirilmesini tavsiye ederiz. Bu protokollerin bizim laboratuvarımızda bulunan aletlere
göre seçilmiş olduğuna lütfen dikkat ediniz. JRC ve WHO, hiç bir şirketin ya da
markanın kullanılmasını özel olarak desteklememektedir.
ABI PRISM® 7700 kullanarak Eş Zamanlı (Real-Time) PCR
RR soyaya spesifik RT- PCR için protokol: çok hedefli (multiplex) PCR metodu
Bu metod, lektin referans geni ve RR soyaya eklenmiş olan gen kasetinin bir
bölümünün Multipleks PCR analizi ile amplifikasyonu ve nicel saptanmasından oluşur
(Foti ve ark., 2006). TaqMan lektin ve RR probları sırasıyla VIC ve FAM boyalarıyla
işaretlenmiştir, bu da aynı tüpte birden fazla hedefin amplifikasyonunu tespit etmeyi
mümkün kılar. Reporter boya FAM emisyonu, farklı maksimal yayılım dalga boyu
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 4 özelliği ile VIC’den ayrılabilir. ABI PRISM 7700 SDS emisyonu farklı dalga
boylarında olan birden fazla boyayı tespit etme özelliğine sahiptir.
RR soyaya karşılık gelen boya miktarı (FAM), her örnekte tespit edilen bitki
materyaline karşılık gelen boya (VIC) miktarı ile normalize edilir. Böylelikle tekrar
örnekleri için ortalaması alınan CT değerleri ortaya çıkar. Bu değerler bilinen RR
soya konsantrasyon standartlarından elde edilen kalibrasyon eğrisi ile hesaplanmış
olan CT değerleri ile karşılaştırılır ( karşılaştırmalı CT metodu veya CT ).
Bu prosedür çeşitli ham madde, katkı maddesi ve soya içeren gıdalarda (yoğurt, un,
lesitin, soya içeceği) başarıyla uygulanmıştır. Bu metodun analitik performansı birçok
yeterlilik testi sırasında başarıyla gözlemlenmiştir (FAPAS, GIPSA).
Alet ve malzemeler

ABI PRISM 7700 Sekans Tespit Sistemi (Applied Biosystems)

MicroAmp Optik 96-Kuyucuk Reaksiyon Plateleri (Cat No. N801-0560)

MicroAmp Optik kapaklar (Cat No. N801-0935)

TaqMan Universal PCR Master karışım (Cat No. 4304437) 2X içeriği: TaqMan
Tamponu 2X AmpliTaq Gold DNA Polimeraz (5U/µl), AmpErase UNG (1U/ml),
dNTP’ler 200 µM dUTP ile, Pasif Referans 1

Mikrosantrifüj

15 ml konik tüpler için soğutmalı santrifüj

Mikropipetler



1,5ml mikrosantrifüj tüpleri

15 ml polypropylene konik santrifüj tüpleri

Nükleaz ari su

Referans genine(lektin) özel primerler (Le-F ve Le-R) ve prob (Le-Probe)

Transgene özel primerler (RR-F ve RR-R) ve prob (RR-Probe)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 5 Referans geni primerleri ve probunun özellikleri
Le-F
TCC ACC CCC ATC CAC ATT T
19
5586.0
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
Le-R
GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA
24
7532
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
Le-Probe
5’-(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT
CG-(TAMRA)-3'
23
7019.0
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
Transgen primerleri ve probunun özellikleri
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
RR-F
GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT
23
7014
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
RR-R
GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C
25
7712
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
RR-Probe
5’-(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC
AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3'
33
10137
Master karışım hazırlanması

İşlem için gerekli ayraçları ihtiyaç duyulan miktarlarda çözüp, yavaşça karıştırın ve
santrifuj edin. Çözülmüş bileşenleri buz içinde tutun.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 6 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 
Buz içindeki tüpün içine, master karışım hazırlamak için gerekli bileşenleri aşağıda
belirtilen sırayla (DNA dışında) ekleyin. Ekstrakte edilen her DNA üç kere analiz
edilir. Solüsyonun akıcılığına bağlı pipetleme hatalarına karşı dört fazla reaksiyon
karışımı hazırlandığına dikkat edin.
Tablo 1. Çok hedefli (multiplex) PCR ölçümünün bir plate için master karışım hazırlanması
Son
Konsantrasyon
Steril, deiyonize su
TaqMan Universal
Master karışım 2X
Primer Le-F(20µM)
Primer Le-R(20µM)
Primer RR-F(20µM)
Primer RR-R(20µM)
Le-Prob(10µM)
RR-Prob (10µM)
DNA
Bir örnek
için µl
Bir örnek için
master karışım
(3 tekrar)
54,9
75
1X
18,3
25
40 nM
40 nM
100 nM
100 nM
100 nM
100 nM
50-250 ng
0,1
0,1
0,25
0,25
0,5
0,5
5
0,3
0,3
0,75
0,75
1,5
1,5
15
50
150
Toplam
Bir plate için
master karışım
(32+4 örnek)
1976,4
2700
10,8
10,8
27
27
54
54

Yavaşça karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.

Test edilecek her DNA örneği için bir tane 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü hazırlayın:
standart eğri örnekleri (CRM-RR soya % 0,1; 0,5; 1; 2; 5), bilinmeyen örnekler ve
kontrol örnekleri (%0 RR soya , RR soya DNA’sı ve hedef içermeyen kontrol).

Her mikrosantrifüj tüpüne 3 tekrar için gerekli master karışım miktarını ekleyin (135 µl
master karışım). Her tüpe 3 tekrar için uygun miktarda DNA ekleyin (15 µl DNA). Her
tüpü en az üç kere yaklaşık 10 sn vorteksleyin. Bu adım her örneğin 3 tekrarı
(replikalar) arasındaki farkı en aza indirmek için önemlidir.

Çok kısa santrifüjleyin. 96-well reaksiyon tepsisini yerleştirin ve yatay olarak soldan
sağa her kuyucuğa 50 µl ekleyin. Master karışımı dikey kuyu sütunlarından her birine
eklendikten sonra optik kapaklarla kapatın.

Not: optik kapağın üzerine yazmayınız ve kapağa dokunmayınız.

Yüklenen master karışım sıvısının kuyuların tabanında olduğuna, kapakta ve kuyu
kenarında damla ve baloncuk olmadığına emin olun.

Reaksiyon tepsisini ABI PRISM 7700 cihazına yerleştirin; her kuyu için örnek türünü
düzenlemek için erkandan yeni bir tepsi ayar penceresi açın: VIC boya için IPC, FAM
boya için UNKN örnek türü seçilir.

Tablo 2’de belirtildiği gibi cihazı başlatın.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 7 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Tablo 2. RR soya için ABI PRISM 7700 SDS’de çok hedefli (multiplex) program
Set: Eş zamanlı (real time) PCR modu
50µl reaksiyon hacmi
Aşama
1
2
3
4
Kademe
UNG
İlk denatürasyon
Amplifikasyon
Denatürasyon
Bağlanma ve
Uzama
TC
50C
95C
95C
60C
Zaman(sn)
120”
600”
15”
60”
Okuma
Yok
Yok
Yok
Ölçüm
Döngüler
1X
1X
45X
Veri analizleri ve sonuçların değerlendirilmesi
Çalışılan her örneğin reporter boyasının CT değerini hesaplamak için çalışmadan
sonra veriler ABI PRISM 7700 SDS bilgisayar programı ile analiz edilir.
Örneklerin SDS bilgisayar programının “Plate Setup” (tepsi ayarları) penceresinde
doğru bir şekilde numaralandırılması önemlidir. Her kuyu “Replicatea” (tekrarlar)
alanında özgün bir sayı ile numaralandırılmalıdır. Tekrarlarda örneklere aynı numara
verilmelidir. Amplifikasyon çizim penceresine otomatik olarak ulaşabilmek için analiz
menüsünden “Analyse” (analiz et) seçeneği işaretlenerek çalışılır. Eşik değer FAM
ve VIC seviyeleri için ayarlanır.
Çalışmayı analiz ettikten sonra elde edilen sonuçları excel dosyasına aktarılır.
Aktarılan dosyalar Microsoft  Excel programına açılı. Her kuyucuk için CT değeriyle
birlikte FAM ve VIC boya seviyelerine ilişkin veri iki bloklu bir tabloda toplanır.
CT (CT FAM - CT VIC)
değerini hesaplamak için her tekrar grubunun CT (FAM) ve
CT (VIC) ortalamaları hesaplanır.
Her örnek için, derişim standart ayarlarından elde edilen CT ve log (%GDO)
değerleri karşılaştırılıp, numunenin CT analizi sonucunda % GDO hesaplanır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 8 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması LightCycler (Roche) kullanılarak RT-PCR
RR-soya spesifik RT-PCR için protokol
Bu yöntem, iki bağımsız PCR reaksiyonunda, lektin referans geni ve RR soyaya
aktarılmış transgenik gen kasetinin bir bölümü için miktar ölçümünden oluşur (BgVV,
EU Tender Report, 2000). Bu iki PCR sistemi FAM’la işaretlenmiş problar kullanır.
Her örnek için GD soya ve referans gen (lektin geni) miktarı, transgen ve referans
gen için gereğine uygun olarak hazırlanmış standart eğrilerden saptanır. GD soya
içeriği, normalize edilmiş GD soya değerini belirlemek için referans gen miktarına
bölünür.
Cihaz ve Ayraçlar

Roche LightCycler sistemi

LightCycler örnek kapillerleri. Roche, Kat No 1909339

LightCycler kapiller adaptörü. Roche, Kat No 1909312

LightCycler FastStart DNA Master Hibridizasyon Probları. Roche, Kat No 3003248

İçeriği: FastStart Taq DNA Polimeraz, dNTP karışımı (dTTP yerine dUTP ile) ve
reaksiyon tampon solusyonu buffer, 10X kons.; PCR için uygun steril su

Bovine serum albumin (BSA), nükleaz içermeyen (DNAaz & RNAaz içermeyen) örn.
Promega Kat No. R9461 (1µg/µl)

Platinum Taq DNA Polimeraz 5U/µl (10X buffer ve 50 mM MgCl2 ile beraber).
Invitrogen- life technologies Kat No. 10966026

Mikrosantrifuj

Miropipetler



1,5 ml mirosantrifuj tüpleri

Nükleaz ari su

Referans gene sözel primerler (GM1-F ve GM1-R) ve prob (GM1-Probe)

Transgene özel primerler (GM2-F,GM2-R) ve prob (GM2-Probe)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 9 Referans geni için primer ve prob özellikleri
GM1-F
5'-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3'
Sekans
Sekans
GM1-R
5'-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3'
Sekans
GM1-Probe
5'-(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC -(TAMRA)-3'
Transgen için primer ve prob özellikleri
Sekans
GM2-F
5'-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3'
Sekans
GM2-R
5'-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3'
Sekans
GM2-Probe
5'-(FAM)-CAA GCT GAC TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3'
Standart eğriler
Her işlemde 5 farklı standart DNA seyreltmesi kullanıalrak iki standart eğri
oluşturulur. Her standart kalibrasyon DNA’sı için ın, her iki master karışımla birer
reaksiyon gerçekleştirilir.
Toplam soya ve GD materyali ölçümü için standart eğriler, %2 RR soya ile başlayıp,
0,1M, pH 8,0 TE tampon ile seyreltmek suretiyle azalan standart DNA solüsyonları ile
oluşturulur. Standart eğrilerin ilk noktası için yaklaşık 100 ng DNA kullanılır. Tüm
seyreltmeler ve derişimler Tablo 3’te özetlenmiştir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 10 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Tablo 3. DNA miktarları ve standart eğri seyreltmeleri
STD1
STD2
STD3
STD4
STD5
DNA miktarı
Soya DNA % GD DNA % Seyreltme Faktörü
(ng)/reaksiyon
100
100
2
50
50
1
1:2
25
25
0,5
1:4
12,5
12,5
0,25
1:8
6,25
6,25
0,125
1:16
Master karışım hazırlanması

İşlem için gerekli ayraçları ihtiyaç duyulan miktarlarda çözüp, yavaşça karıştırın
ve santrifuj edin. Çözünmüş bileşenleri buz içinde tutun.

Her sistem için master karışım hazırlamak üzere buz içindeki 1,5 ml mikrosantrifuj
tüpünün içine, master karışım hazırlamak için bileşenleri aşağıda belirtilen sırayla
(DNA dışında) ekleyin. Solüsyonun akıcılığına bağlı pipetleme hatalarına karşı iki
fazla reaksiyon karışımı eklendiğine dikkat edin.
Tablo 4. GM1 sistemi için master karışım hazırlanması
Bileşenler
Platinum Taq pol.buffer 10X
MgCl2 (50mM)
dATP,dGTP,dCTP,dTTP(4mM)
GM1-F primer (20µM)
GM1-R primer (20µM)
GM1-prob (10µM)
BSA nükleaz free(1µg/µl)
Platinum Taq pol.(5U/µl)
Nükleaz ari su
DNA
Toplam hacim:
Son
konsantrasyon
1X
4mM
0,8mM
500mM
500mM
200mM
0,1 mg/ml
0,8 U
#
µl/reaksiyon
2
1,6
4
0,5
0,5
0,4
2
0,16
6,85
2
18µl+2µl
DNA
Toplam µl
(18 reaksiyon için)
36
28,8
72
9
9
7,2
36
2,9
123,5
324,2µl (DNA
hariç)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Tablo 5. GM2 sistemi için master karışım hazırlanması
Bileşenler
Platinum Taq pol.buffer 10X
MgCl2 (50mM)
dATP,dGTP,dCTP,dTTP(4mM)
GM2-F primer (20µM)
GM2-R primer (20µM)
GM2-probe (10µM)
BSA nükleaz ari (1µg/µl)
Platinum Taq pol.(5U/µl)
Nükleaz ari su
DNA
Toplam hacim:
Son
konsantrasyon
1X
4mM
0,8mM
500mM
500mM
200mM
0,1 mg/ml
0,8 U
#
µl/reaksiyon
2
1,6
4
0,5
0,5
0,4
2
0,16
6,85
2
18µl+2µl
DNA
Toplam µl
(18 reaksiyon için)
36
28,8
72
9
9
7,2
36
2,9
123,5
324,2µl (DNA hariç)

Yavaşça karıştırın ve çok kısa santrifüjleyin.

Test edilecek her DNA (standart eğri örnekleri ve bilinmeyen örnekler) örneği için iki
(bir tane GM1 sistemi için ve bir tane GM2 sistemi için) 0,5 ml reaksiyon tüpü
hazırlayın.

Her reaksiyon tüpüne 2 tekrar için gerekli master karışım miktarını ekleyin (36 µl
masterkarışım). Her tüpe 2 tekrar için uygun miktarda DNA ekleyin (4 µl DNA). Her
tüpü en az üç kere yaklaşık 10 sn vorteksleyin. Bu adım bir örnek için tekrarlar
arasındaki farkı en aza indirmek için önemlidir.

Kapillerleri önceden soğutulmuş santrifuj adaptörüne yerleştirin.

Şemada belirtilene göre her kapillere 20µl master karışım pipetleyin (Tablo 6 Tepsi
kurulumu- yükleme sırası).

Düşük hızda mikrosantrifujde çevirin (700 rpm). Bu adım reaksiyon karışım hacminin
tamamının kapillerlerin ucunda konsantre olmasını sağlar.

Kapillerleri LightCycler® (Roche) carousel içine transfer edin.

Tablo 7’de belirtildiği gibi cihazı başlatın.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 12 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Tablo 6. LightCycler® carousel yükleme sırası: 1’den 16’ya GM1 sistemi, 17’den 32’ye GM2
sistemi. Rferans gen ve transgen (GDO) sistemi için her örnek çift çalışılmış.
Pozisyon
Örnek(%)
Pozisyon
Örnek(%)
Pozisyon
Örnek(%)
1
STD (100)
13
U2
25
STD (0.125)
2
STD (100)
14
U2
26
STD (0.125)
3
STD (50)
15
NTC
27
U1
4
STD (50)
16
NTC
28
U1
5
STD (25)
17
STD (2)
29
U2
6
STD (25)
18
STD (2)
30
U2
7
STD (12.5)
19
STD (1)
31
NTC
8
STD (12.5)
20
STD (1)
32
NTC
9
STD (6.25)
21
STD (0.5)
10
STD (6.25)
22
STD (0.5)
11
U1
23
STD (0.25)
12
U1
24
STD (0.25)
Tablo 7. LightCycler® programı
Her adım için eğimi 20C/s oalarak ayarlayın
Fluoresen gösterim modu F1/1
Denatürasyon:
Cycles:
1
Type:
None
Segment
Number
Temp.
1
96 °C
Fluorescence Display Mode:
Time
Slope
120 sec 20 °C/sec
F1/1
2° Target
Temp.
Step
Size
Step Delay
(Cycles)
Acquisition
Mode
0 °C
0 °C
0
None
Döngü:
Cycles:
45
Type:
Quantification
Segment Temp.
Number
F1/1
Time
Slope
2° Target
Temp.
Step
Size
Step Delay
(Cycles)
Acquisition
Mode
5 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
None
1
95 °C
2
60 °C
15 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
Single
3
72 °C
15 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
None
Soğutma:
Cycles:
1
Type:
None
Segment Temp.
Number
1
40 °C
F1/1
Time
Slope
2° Target
Temp.
Step
Size
Step Delay
(Cycles)
Acquisition
Mode
30 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
None
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 13 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Çalışma sırasında EDIT SAMPLE düğmesini tıklayarak, yükleme ekranında örnek adlarını
girin. Tüm pozisyonları (kalibrator DNA da dahil) “ Unknown” (Bilinmeyen)olarak belirtin.
Data analizleri ve sonuçların değerlendirilmesi

Data analizi için data analizi ön penceresinde Fluorescence F1/F2’yi seçin.

Ölçüm için “quantification” düğmesine tıklayın.

LightCycler® bilgisayar programı ölçüm için iki farklı metod önerir: “Second derivative
Maximum” metodu ve “Fit Points” metodu. RR soya DNA tespit kiti ile miktar tayini
için tercihen “Fit Points” metodu kullanılır. Belirtilen ayarları kullanınız: baseline
adjustment = “Proportional”; number of points = 2.

Standart eğriyi diğer tüm ilgili bilinmeyen reaksiyonlarla beraber gösterin.

“Step 2: Noise Band” dosyasını açın.

Noise band pozisyonunu 0,1’e getirin (aşağıdaki nota bakınız). Noise band elle veya
“Chance Graph Settings” düğmesinin altındaki tuşa basarak hareket ettirilebilir. Bu
tuş ile “Manual Cursor Adjustment” penceresi açılır ve cursor değeri 0,1 olarak
ayarlanır.

“Step 3: Analysis” dosyasını açın.

Step 3: Analysis’de çakışma noktaları, kalibrasyon standartlarının ve bilinmeyen DNA
hedeflerinin ilgili konsantrasyonları hesaplanır.

Standart eğrinin r-değerini kontrol edin. r–0,98 değeleri kabul edilebilir; r= –1 değeri
optimaldir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 14 Kaynaklar
EU Tender Report. (2000). Development of qualitative as well as quantitative
detection methods to identify a genetic modification in soybean and maize
products. Report of the EU Tender n. XXIV/98/A3/001.
LightCycler Operator’s Manual, version 3.0 (Roche Molecular Biochemicals).
User Bulletin #2. Relative quantitation of gene expression. ABI PRISM 7700
Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1997.
User Bulletin
#5. Multiplex PCR with TaqM VIC probes. ABI PRISM 7700
Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1998.
Foti, N., Onori, R., Donnarumma, E., De Sanctis, B., and Miraglia, M. (2006). RealTime PCR multiplex method for the quantification of Roundup Ready soybean in
raw material and processed food. European Food Research and Technology
Journal 222, 209-216.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Gıda Örneklerinde
Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel
Saptanması
F. Eyquem
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı
2
İçindekiler
Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanması
Giriş
3 ELISA Tekniği
7 Deneysel
11 Kaynaklar
Bölüm 12
3
Giriş
Transformasyon sonrasında aktarılan gen tarafından sentezlenen yeni proteinin özel
immunolojik tayini, genetik olarak değiştirilmiş bitkilerin belirlenmesi için alternatif bir
yaklaşımdır.
Ancak
genetik
modifikasyonun
her
zaman
yeni
bir
proteinin
sentezlenmesini yönlendirmediği ve protein ifade seviyelerinin analiz metodları için
her zaman yeterli olmayacağı bilinmelidir. Buna ek olarak bazı proteinler bitkinin
sadece özel bölgelerinde (özel amaçlar için genellikle dokuya özel (doku hedefli)
promotörler kullanılır) ya da fizyolojik gelişimin farklı fazlarında veya belli bölgelerde
farklı seviyelerde ifade edilebilir.
En kuvvetli konstitütif promotörler kullanıldığında bile, transgenik ürünlerin ifade
seviyelerinin bitkilerde toplam çözünen proteinin yüzde 0 ile 2 arasında olduğu
belirtilmiştir (Longstaff, 1995). Birçok durumda, ifade seviyeleri (örneğin onaylanmış
GD tahıllar) üst sınır yüzde ikiden daha azdır (Hemmer 1997).
İmmunoanalizler, antikorları test maddesi olarak kullanan analitik ölçüm sistemleridir.
Antikorlar hayvanların serumundan izole edilen ve spesifik üretimlerine yol açan
(antijen) maddeye fiziksel olarak tutunan özel proteinlerdir. Antikorlar, tespiti gereken
maddeyi (örneğin CP4 EPSPS, herbisit Roundup®’a direnç sağlayan protein) fare,
tavşan gibi deney hayvanlarına enjekte ederek vücut hücrelerinin yabancı olarak
tanımladıkları bu proteine karşı antikor üretmesi ile elde edilir. Antikorlar saflaştırılır,
tespit edilebilir bir şaretleyici ile imlenir ve ilgi duyulan maddenin tayininde kullanılır.
İmmunolojik yöntemlerin geliştirilmesi için ilk koşul, tanımlanacak yeni protein için
yüksek hassasiyette antikorların bulunmasıdır. Buna ek olarak, numune ya da ilgi
duyulan proteinlerin önemli derecede parçalanmamış olması tayin için önemlidir.
Antikorlar bileşik karışımlardaki antijenlerin belirlenmesi ve nicel tespitinde biyologlar
için yüksek hassasiyetli araçlardır. Bütün immunoanalizler antikorun antijene özel
olarak bağlanması esasına dayanır.
Antikor-Antijen Etkileşimi
İmmunologlar antikorları çoklukla solüsyondaki antijenleri çöktürme özelliğine sahip
olan proteinler olarak tanımlasalar da bazı otoimmun hastalıklar hariç in vivo
Bölüm 12
4
koşullarda antikorlar antijenleri nadiren çöktürür. Antijenlerin belirlenmesi ve
izolasyonunda da ”çöktürme” artık nadiren kullanılmaktadır.
Antikor çöktürme reaksiyonlarının bilgilendirici değeri, Şekil 1’de gösterildiği gibi, bu
reaksiyonun
antikor moleküllerinin temel ve evrensel özelliklerinin bir çoğunu
muntazam bir şekilde, bir bütün halinde ortaya koymasıdır.
Bu teknikle gösterilen bazı özellikler;

-serum IgG antikorları antijenle reaksiyonlarında bivalenttir ve farklı antijenlerle
çapraz bağlanma yapabilirler,

-antijenler antikorlarla olan reaksiyonlarında çok değerliklidir ( multivalent)

-serum antikorları doğada poliklonaldir

-antikorlar antijenleri moleküler düzeyde tanıyabilmek için çok özelleşmişlerdir.
Şekil 1. Bir antijen ve ona ait antikorun çökme grafiği
Çöken antikorun miktarının antijen derişimine karşı grafiği çizildiğinde üç bölge
görülür.
Yüksek antikor (Fazla antikor) bölgesi: çökelme önlenir ve fazla antikor
supernatantda tespit edilebilir.
Bölüm 12
5
Denge (Eşitlik) bölgesi: en fazla çökelmenin görüldüğü, antijen ve antikorun büyük
erimez yapılar (mavi ile gölgelendirilmiş) oluşturduğu ve ne antijen ne de antikorun
supernatantda tespit edilemediği bölgedir.
Yüksek Antijen bölgesi: çökelti engellenir ve fazla antijen supernatant içinde tespit
edilebilir.
Çökelme reaksiyonu poliklonal antikorlar ile çok değerlikli antijenler arasındaki
etkileşim karakterize etmek için uygundur.Antijenler aynı epitopu çoğul biçimde
taşımadıkları sürece
(örneğin polisakkaritlerde bulunan tekrarlayan karbonhidrat
yapıları), monoklonal antikorlar ve antijenler arasındaki etkileşimi tanımlamak için
çökelme reaksiyonu pek yararlı değildir.Sadece bu koşullarda tek özellikli monoklonal
antikorlar bağlanarak antijeni çökertebilir. Monoklonal antikorlar, antikor-antijen
etkileşimi hakkında daha detaylı bilgi sağlayabilmek için denge sabiti, kinetik hız gibi
daha hassas ölçüm yöntemleri ile tanımlanırlar.
Yıllar boyunca geliştirilen çok hassas antikor uygulamaları göz önünde tutulduğunda,
antikorların antijenlerin izolasyonu ve belirlenmesi için ne denli yararlı bir yöntem
olduğu daha kolay analaşılır. Antikorların kullanımları antijenlere bağlanma
kapasitelerini
etkilemeden,
çeşitli
kimyasal
modifikasyon
reaksiyonlarında
dayanıklılıkları ve yapısal dengelerini koruyabilme özellikle ile de yaygınlaşmıştır.
Çeşitli deneysel koşullar altında antikorlar, antijen tanımlaması ve izolasyonunu
artırmak amacı ile,
kimyasal modifikasyon yöntemleri ile floresan, magnetik,
radyoaktif vb. işaretliyiciler ile antjiene bağlanma hassasiyetleri hiç etkilenmeden
imlenmiş ve kullanılmıştır.
Monoklonal antikorlar nasıl hazırlanır?
Vücuda yabancı olan maddeler örneğin hastalık yapan bakteriler, virüsler, ve diğer
enfeksiyon ajanları vücut bağışıklık sistemi tarafında istilacı olarak tanımlanır. Bu
yabancı ajanlara karşı doğal savunmamız, antijenleri tanımaya ve yok etmeye
yarayan antikorlardır.
Antikorlar iki yararlı özelliğe sahiptirler. Birinci olarak çok özelleşmişlerdir. Her antikor
özel olarak bir antijene bağlanır ve ona saldırır. İkinci olarak bazı antikorlar bir
hastalık sonucu aktive olduktan sonra bu hastalığa karşı direncin devamını sağlar.
Antikorların ikinci özelliği aşıların geliştirilmesine olanak sağlar. Aşı zayıflatılmış ya
da öldürülmüş bakteri ya da virüslerdir, vücuda verildiği zaman aşının içerdiği
antijenlere karşı antikorların üretilmesini tetikler.
Bölüm 12
6
Antikorların özelliği olan kendine özgülük monoklonal antikor teknolojisini değerli
yapar. Antikorlar yanlızca tedavi amaçlı hastalıktan korunmak için değil çeşitli
hastalıkların tanısına, viral ve bakteri ürünlerinin ve kandaki anormal maddelerin
teşhisine de yardımcı olur.
Hastalıklara karşı savaşan maddeler olarak çeşitli kullanımları, antikorların saf
miktarlarda üretimini bilimsel incelemelerin odağı yapmıştır. Geleneksel yöntem, bir
laboratuvar hayvanına antijen enjekte edilmesi ve antikorların oluşmasını takiben bu
antikorları kan serumundan toplamak şeklindedir (antikor içeren seruma anti-serum
adı verilir). Bu yöntem ile ilgili iki problem vardır: antiserum istenmeyen maddeleri de
içerir ve elde edilen kullanılabilir antikor miktarı çok azdır.
Monoklonal antikor teknolojisi, hücrelerden doğal olarak antikor eldesi yolu ile yüksek
miktarlarda saf antikor ve hücre kültüründe sürekli büyüyebilen hücrelerin üretimine
olanak verir. Hücre ölümsüzlüğü ve istenilen maddenin üretimini birleştiren bir hibrid
oluşturulduğunda zamana karşı antikor üreten bir fabrika sahibi olunur.
Monoklonal antikor teknolojisinde, sonsuz çoğalabilen tümor hücreleri, antikor
üretebilen memeli hücreleri birleştirilir. Bu hücre füzyonunun sonucu ”hibridoma”
oluşur ve sürekli olarak antikor üretebilir. Bu antikorlar monoklonal olarak adlandırılır
çünkü tek tip bir hibridoma hücresinden gelir. Diğer yandan geleneksel yöntemlerle
üretilen antikorlar birçok hücre tipinin bulunduğu ortamlardan üretildiği için poliklonal
olarak adlandırılır. Monoklonal antikorların nasıl oluştuğu aşağıda örneklenmiştir.
Monoklonal antikor üretimi
Myeloma, hücre kültüründe sürekli olarak büyümeye adapte edilebilen bir kemik iliği
tümörüdür.
Myeloma
hücreleri
antikor-üreten
memeli
dalak
hücreleri
ile
birleştirildiğinde, oluşan hibrid hücrelerin veya hibridomaların, çok sayıda monoklonal
antikor ürettiği gözlenmiştir. Bu hücre füzyon ürünü iki farklı hücre tipinin istenilen tüm
özelliklerini birleştirir; sürekli olarak büyüme ve yüksek miktarlarda saf antikor üretimi.
Seçilen hibrid hücreler tek bir antikor ürettikleri için, geleneksel yöntemlerle üretilen
poliklonal antikorlardan daha saftır. Hastalıklarla savaşta geleneksel ilaçlardan daha
etkilidir. Çünkü ilaçlar yalnızca yabancı maddeye değil vücut hücrelerine de saldırırlar
ve bazen alerji gibi istenmeyen yan etkilere de neden olur. Monoklonal antikorlar ise
çok az ya da hiç bir yan etki olmadan sadece hedef moleküle saldırır.
Bölüm 12
7
ELISA Tekniği
Enzim Bağlı İmmunosorbent Analizi: Bir immunosorbent (katı bir desteğe bağlı
antijen veya antikor) ve enzim bağlı bir immunoreaktant (tepki veren) kullanılan bir
enzim immuno analizidir. Çeşitli yöntemler (örn işaretlenmemiş bilinmeyen ile işaretli
reaktant arasındaki yarışçı bağlanma) bilinmeyen derişimleri ölçmek için kullanılır.
ELISA (Clark ve Adams 1977) yönteminde
antijen ve antikorlar arasındaki özel
etkileşim esastır. ELISA’daki anahtar ayraç moleküller, antijen adı verilen yabancı
maddelere karşı vücut bağışıklık sistemi tarafından üretilen anitkor adı verilen
çözünür proteinlerdir. GDO’ların belirlenmesi durumunda bu antijen, genetik
modifikasyon sonucu sentezlenen yeni protein olabilir.
Bölüm 12
8
ELISA deneysel safhada yeni aktarılan gen tarafından sentezlenen protein ifade
seviyesinin belirlenmesinde kullanılır. Bu nedenle, özel antikorların üretimi ve
kullanımı ile ilgili bilgiler transgenik bitkilerin geliştirilmesi ile ilgili pek çok makale de
bulunabilir (Mohapatra ve ark. 1999).
Onaylanan genetiği değiştirilmiş tahıllarda kullanılan transgenlerin ürünleri olan
proteinlere karşı kullanılabilecek özgün antikorlardan sadece bir kaçı ticari olarak
mevcuttur. Buna örnek olarak nptII gen ürününe (npt II ve APH(3’)II) ve gus gen
ürününe karşı olan antikorlar örnek verilebilir.
ELISA testi 3 farklı yöntemle gerçekleştirilebilir:
Roundup Ready® soya için özel bir belirleme yöntemi olarak ELISA’ya bağlı yeni bir
teknik geliştirilmiş, test edilmiş ve onaylanmıştır (Lipp ve ark. 2000).
Yöntem, Roundup Ready® soyada herbisite karşı direnci sağlayan protein CP4
EPSPS enzimine (5-enolşikimat-3-fosfat sentaz) (Agrobacterium sp. Suş CP4) karşı
özel antikorların kullanımına dayanır (Padgette ve ark. 1995). İlk sonuçlarda bu
yöntem (ticari ELISA kiti ile) kullanılarak ham soyada (işlenmemiş) GDO varlığı %0,3
ve %0,5 arasındaki derişimlerde belirlenebilmiştir.
Bölüm 12
9
Prensip
CP4 EPSPS proteinin belirlenmesi için direkt sandviç enzime-bağlı immunosorbent
analizi (ELISA) aşağıda gösterilen şekilde kullanılmıştır.
Bir mikrotitre plağının yüzeyi özel monoklonal antikor ile kaplanmıştır.
İlgilenilen numune uygulandığında, yüzeye tutunmuş olan antikor özel antijenine
bağlanır. Bağlanmayan moleküller yıkama ile ortamdan uzaklaştırılır.
Yıkamadan sonra, CP4 EPSPS proteinin ikinci bir antijenik bölgesine özelleşmiş olan
ve yaban turbu peroksidaz enzimini (HRP) kovalent bağlanmış olarak taşıyan
poliklonal antikor eklenir.
Bölüm 12
10
İkinci yıkamadan sonra, peroksidaz enzim aktivitesi için tetrametilbenzidin (TM)
kromojeni eklenir. Yaban turpu peroksidaz, antijen derişimiyle doğru orantılı olan bir
renk sinyali üretir. Renk sinyalini durdurmak için durdurma sıvısı eklenir. Elde edilen
renk 450 nm dalga boyunda ölçülür.
Bölüm 12
11
Deneysel
(GDO Gıda içeriği testi, soya kit kullanıcı rehberi (1999) Strategic Diagnostics Inc.,
Rev. 052099, vers, 1.8) 11
Giriş
Aşağıdaki protokol soya unu veya soya protein izolatları ve ham (işlenmemiş)
tarımsal ürünlerde bulunan Roundup Ready® soyada ifade edilen CP4 EPSPS
proteinin belirlenmesi için kullanılan ELISA yöntemini açıklamaktadır.
Yöntem hiç işlenmemiş ya da çok az işlemden geçmiş CP4 EPSPS proteinin
bozulmadığı örneklerde çalışılabilir. Örneğin gıdaların işlendiği çok yüksek sıcaklıklar
yöntemin protein tayini becersini etkileyebilir. Elde edilen veriler, güvenilir protein
tespiti için işlem sıcaklıklarının 65°C’den yüksek ve sürelerinin 60 dakikadan fazla
olmaması gerektiğini belirtmektedir.
Bu yöntem, CP4 EPSPS proteinin tayini için onaylanmıştır ve özel referans materyali
kullanılarak numune içinde %0,3 – 0,5 aralığı içinde bulunan proteinlerin miktarının
(derişimlerinin) belirlenmesinde kullanılabilir. Değiştirilmiş bir protokol kullanılarak
%0,05’den %0,3’e kadar olan daha düşük seviyelerde de kullanılabilir.
Malzemeler

15ml polipropilen konikal santrfüj tüpleri

12x75 mm cam test tüpleri

Sera film veya aliminyum folyo

Plastik band (manuel yıkama için) ya da otomatik plak yıkayıcı

Yıkama şişeleri, örn. 500 ml

20µl- 500 µl aralığında hassas pipetler


Ağırlık dengeleri

Spatulalar

0,01 g hassasiyette terazi

5000- 10000 rpm aralığına sahip santrifuj
1 Bu bölümde bahsi geçen kit, kurs düzenlediğinde ve bu kitap hazırlandığında ticari olarak
erişilebilen bir kittir. JRC ve WHO herhangi bir ticari marka kiti tavsiye etmemektedir.
Bölüm 12

12
450 nm dalga boyunda absorbans okuma kapasitesine sahip mikrotitre plak
okuyucu

37°C de sabitlenebilen inkubatör

450µm aralıklı filtre veya eşdeğeri

150µm aralıklı(100 meş) filtre veya eşdeğeri

Çok kanallı pipet, örneğin 50µl ile 300µl aralığında (opsiyonel)

Çok kanallı dağıtım için sıvı reservuarları (opsiyonel)

Otomatik plak yıkayıcı (opsiyonel)

Tüp taşıyıcı raf (15 ml santrifüj tüpleri için) (opsiyonel)
Kimyasallar
Genel
Analiz esnasında aksi belirtilmedikçe, deiyonize veya saf su ve tanımlanmış analitik
derecedeki kimyasallar kullanılmalıdır.
Belirlenmiş
performans
ölçütlerinden
sapmalar
kimyasalların
stabilitesindeki
eksiklikten kaynaklanabilir. Eğer substrat içeriği şeffaftan maviye dönüştüyse, bu
kimyasal atılmalıdır. Bulanık tampon solüsyonları kullanılmamalıdır.
Bütün kit maddeleri 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır. Kit içindeki maddelerin
kullanım süreleri “son kullanma tarihi” biçiminde belirtilmiştir. Hızlandırılmış stabilite
testleri 2°C ile 8°C arasında test kitinin kullanım süresi 9 ay olarak belirlemiştir.
Antikor konjugatı ”soya konjugat” stok solüsyonu ve antikor konjugat çalışma
solüsyonu kitin kullanım süresinin sonuna kadar 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır.
Seyreltilmiş çalışma yıkama tamponu yaklaşık 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır. Kit
son kullanım tarihinden sonra kullanılmamalıdır.
Test kitinde bulunan kimyasallar

Soya ekstrasyon tamponu, sodyum borat tamponu, pH 7.5

Soya Analiz Tamponu, PBS, Tween 20, Bovin Serum Albumin, pH:7.4

Kaplanmış şerit kuyucukları (12 şerit, her biri monoklonal antikorlarla kaplanmış 8
kuyucuğa sahip ve bir şerit tutucu)

Soya konjugatı, tavşan anti-CP4 EPSPS protein, liyofilize olmuş

Seyreltilmiş soya konjugat, %10 ısıyla inaktif olmuş fare serumu
Bölüm 12

Kromojenik madde, K-Blue
13
TM
, tetrametilbenzidin (TMB), hidrojen peroksit, temel
çözücü olarak %5 dimetilformamid

Durdurma solüsyonu, %0.5 sulfirik asit

10 kez konsantre yıkama tamponu, PBS, Tween 20, pH: 7.1

Negatif ve pozitif referans standartları
Deney
Prosedürün kısıtlamaları
Bu ELISA GDO testinin hassasiyeti CP4 EPSPS protein ifadesinin, kullanılan
referans standart içinde bulunan GDO materyalinin seviyesi ile ilişkili olduğu
numunelerle sınırlıdır.
ELISA test kiti 15°C ile 30°C arasındaki ortam sıcaklıklarında optimum performansı
vermek üzere tasarlanmıştır. En yüksek referans standartın absorbansı 0,8’den
büyük olmalı ve spektrofotometrenin lineer aralığı dışında olmamalıdır (üst sınır
spektrofotometre modeline göre değişebilir). OD değerlerinin 30°C den daha yüksek
sıcaklıklarda daha hızlı arttığını göz önünde bulundurmak gerekmektedir. Bu
nedenle, eğer sıcaklık yüksek ise substrat inkubasyon zamanını azaltmak
gerekmektedir. Düşük sıcaklıklarda (15°C’nin altında) substrat inkubasyon zamanı
arttırılmalıdır.
Numune hazırlama esnasında kontaminasyondan kaçınmak için alınması gereken
önlemler
Genel. ELISA GDO test sistemi çok düşük miktarlarda GDO kontaminasyonu
saptama kapasitesine sahip çok hassas bir tekniktir. Bu sebeple, numune serilerinin
değişimi sırasında soya numunelerini işlemek için kullanılan bütün ekipmanın
temizlenmesi zorunludur. Bu işlemlerde ilk basamak kalan materyal parçalarının
fiziksel temizlenmesidir. İkinci basamak ise alette kalabilecek GDO proteinin inaktif
hale getirmek için numuneyi alkol ile yıkamaktır.
Öğütücü temizliği. Yumuşak kıllı bir fırça ile fırçalayın. Periyodik olarak fırçayı
yıkayın ve alkol solüsyonuna batırın. Kullanmadan önce fırçayı kurulayın. Yumuşak
bir havlu ile silin. Alkolü üzerine püskürterek ya da alkol içinde bekleterek yıkayın. İki
yıkama ya da püskürtme yeterlidir. Ardından su ile yıkayın. Direk olarak kurumaya
bırakabilirsiniz ya da acil kullanmanız gerekiyorsa saç kurutucusu ile kurutun.
Bölüm 12
14
Filtre temizliği. Filtreler soya unu ile kalıplaşma eğilimi gösterirler. Kalıplaşan
materyali temizlemek için filtreyi hızlı bir şekilde sert bir yüzeye vurun. Temiz
yumuşak kıllı bir fırçayla fırçalayın. Düzenli olarak fırçayı yıkayın ve en az 1 dakika
alkol solüsyonunda bekletin. Kullanımdan önce fırçayı kurulayın. Yumuşak bir bez ile
silin.
5 dakika alkole batırın ve su ile yıkayın. Direk olarak kurumaya bırakabilirsiniz ya da
acil kullanmanız gerekiyorsa saç kurutucusu ile kurutun.
Alternatif bir yöntem olarak ultrasonik banyo ve takiben kurumaya bırakmak
kullanılabilir.
Çalışma alanının temizliği. Çalışma alanının temizliği çok önemlidir. Analiz çok
hassas olduğu için çok az miktarlarda bir GDO pozitif toz kontaminasyonu bile yanlış
pozitif
sonuç
verebilir.
Çalışma
alanında
soya
toz
kontaminasyonundan
kaçınılmalıdır. Bir önceki işlemde kullanılan soya tozunun aleti kontamine ederek bir
sonraki işlemi etkilemesine izin vermeyiniz. Numunenin ezilip hazırlandığı odanın,
analizin yapıldığı oda ile aynı olmaması optimum performans için gereklidir.
Numune hazırlanması
Laboratuar örneğinden homojen artan bir alt örnek alınmalıdır. Eğer örnek
işlenmemiş soya ise en az 500 g uygun bir öğütücüde yaklaşık 3 dakika ya da
filtreden geçecek kadar ufak olana kadar ezin. Nicel analiz için 150 µm daha küçük
partikül boyutu, nitel analiz için 450 µm’den daha az partikül boyutu elde etmek
gerekir. Kontaminasyondan kaçınmak için filtreleme basamağına dikkat edilmelidir.
Buna ek olarak, fazla ısıtmaktan da kaçınılmalıdır. Blender (parçalayıcı), örneği hem
karıştıracak hem de parçalayacaktır. Ana materyalden yaklaşık 100 gr’lık bir örnek
alınıp 450 µm’lık filtreden geçirilmelidir. Bu örneğin en az %90’ı 450 µm’lik filtreden
geçirilmelidir. Nitel analiz için bu materyal direkt olarak kullanılabilir, nicel analiz için
filtrelenen materyal tekrar 150 µm’lik filtreden geçirilmelidir. 450 µm’lik filtreden geçen
materyalin homojen olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle, 150 µm’lik filtreden yalnızca
son örneği sağlayacak kadar materyali geçirmek gereklidir. Son örnek için, prosedür
için gerekli olacak miktarda materyali filtrelemek yeterlidir.
Diğer tipteki örnekler daha küçük numune miktarları kullanılsa bile aynı biçimde işlem
görmelidir.
Bölüm 12
15
Analiz işlemi
Kullanımdan önce bütün sıvıları oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Kaplanmış şerit
ve şerit tutucuları folyo kutusundan çıkarın. Uygun sayıda şeriti çıkardıktan sonra
folyo kutusunu mutlaka kapatın. Referans standartları ve analiz körleri için 10
kuyucuk gereklidir. Her plak kendi standart ve kontrollerine sahip olmalıdır. Normal
yıkama kullanılıyorsa yıkama basamaklarında bütün şeritleri kenarlarından tutturmak
gereklidir.
Antikor konjugatın hazırlanması
Antikor konjugat stok solüsyonu: 1ml soya konjugat çözücü, soya konjugat
viyolünee alınır. Karıştırmak için 10 sn vortekslenir.
Antikor konjugat çalışma solüsyonu: Yeniden oluşturulmuş soya konjugatından
240 µl soya konjugat çözücü şişesine geri aktarılır ve tarih atılır. 20 kez çevirerek
karıştırılır.
Yıkama tamponunun hazırlanması
10x yıkama tamponunu oda sıcaklığına getiriniz.
Çalışma yıkama tamponu hazırlamak için bu tamponu deiyonize su ile seyreltin (örn
50 ml 10x yıkama tamponu 450 ml deiyonize su içine)
Yıkama şişesine koyun (ya da otomatik yıkayıcı)
Örnek ve referans standartlarının ekstrasyonu
Örnekler, pozitif ve negatif referans standartları, aynı koşullar altında, duplike olarak
aşağıda belirtildiği gibi esktrakte edilir.
Örnekleri tartarken, her referans standartı ve örnekler artan derişimlerde sıralanır.
Her referans standartı ve örnekden 0,5±0,01 g. tartarak polipropilen santrifuj tüplerine
koyun. Kontaminasyonu önlemek için her tartıda spatulayı temizleyin. 0,5 g numune
içeren her tüpe 4,5 ml soya ekstrasyon tamponu ekleyip 10 sn vorteksleyin.
Karışımları 5000 rpm de 15 dakika santrifüjleyin. Transfer pipeti kullanılarak çökeltiye
zarar vermeden supernatantı ayırınız. Supernatantı işaretlenmiş 15 ml lik temiz yeni
bir santrifuj tüpüne alınız. Analize başlamadan önce numuneler ve referans standart
ekstraktları soya tamponu ile Tablo 1’e göre seyreltilir. Protein ekstraktları bir çalışma
gününden uzun olmamak şartı ile 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır.
Tablo 1. Matrikse göre seyreltme oranları
Bölüm 12
16
Matriks
Seyreltme
Soya fasülyesi
1:300
Soya unu
1:300
Yağı alınmış soya unu
1:300
Protein izolatı
1:10
Örnek ekstraktlarının seyreltilmesi
Ekstraksiyon yapılan negatif kontrol, ekstraksiyon yapılan pozitif referans ve her
örnek için seyreltme işlemi yapmak üzere iki adet 12x75 mm boyutlarında test tüpü
gereklidir.
280 µl soya analiz tamponunu bu tüplerden bir tanesine pipetleyin
380 µl soya analiz tamponunu diğer tüpe pipetleyin.
280 µl olan tüpü 1:15, 380 µl olan tüpü 1:300 olarak etiketleyin
Her örnekten 20 µl 1:15 olarak etiketlenmiş tüpe ekleyin ve vorteksleyin
Karıştırma sonrası 1:15 etiketli tüpten 20 µl alarak 1:300 etiketli tüpe ekleyerek
vorteksleyin
Bu basamakları her negatif kontrol, pozitif referans ve örnek ekstraktları için tekrar
edin
ELISA İmmunoanaliz prosedürü
Genel
ELISA analiz kiti 8 kuyucuklu şeritlerden herhangi biri kullanılarak çeşitli formatlarda
yürütülebilir. Rastgele yükleme şeması izlenmesi tavsiye edilmektedir.
Bütün reaksiyon kuyucukları eşli olarak yürütülmelidir. Her kuyucuk için ortalama
absorbans değerleri hesaplanmalıdır. Her yürütme tampon körü, negatif kontrol ve
pozitif referans standartlarının analizinden oluşur.
Analiz başlatıldığı zaman diğer basamaklar da ara vermeden tamamlanmalıdır.
Bölüm 12
17
Numune Eklenmesi
Seyreltilmiş ekstraktlar ve analiz tamponundan 100µl uygun kuyucuklara eklenir.
Kontaminasyonu önlemek için her pipetleme basamağında ayrı kullanılıp atılan pipet
uçları kullanılmalıdır.
Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için kuyucukların üstü sera film veya
aliminyum folyo ile kapatılır.
Örnek inkubasyonu
Mikrotitre plağı 37°C de 1 saat bekletilir.
Yıkama
300 µl yıkama tamponu ile 3 kere yıkanır.
Elle yapılan yıkama: Kuyucuklar ters çevrilerek uygun bir atık kutusuna boşaltılır.
Yıkama solüsyonu ile dolu 500ml yıkama şişesi kullanılarak her kuyucuk tepesine
kadar doldurulur. 60 sn bekletilir, daha sonra ters çevrilerek boşaltılır. Yıkama adımı
3 kez tekrar edilir. Kalan sıvıyı ve hava kabarcıkları birkaç kağıt havlu üzerine ters
yüz ederek alınır. Uygun bir bant ile şeritlerin düşmesi engellenir.
Otomatik yıkama: İnkubasyon safhasının ardından bütün kuyucukların içi mikro
kuyucuk yıkayıcısı ile aspire edilerek boşaltılır. Ardından bütün kuyucuklar yıkama
tamponu ile doldurulur. Aspirasyon ve doldurma safhaları toplam 3 kez tekrar edilir.
Son olarak mikro kuyucuk yıkayıcı bütün kuyucuklardaki sıvının buharlaşması için
kullanılır. Kalan yıkama tamponu veya hava kabarcıkları birkaç kat kağıt havlu
üzerine ters yüze ederk alınır.
Kuyucukların tamamen kurumasına izin vermeyiniz. Bu analiz performansını
etkileyebilir.
Yetersiz yıkama hatalı sonuç verebilir. Her iki yıkama yönteminde de kuyucukların
eşit miktarlarda sıvı ile yıkanması gerekmektedir.
Antikor konjugatın eklenmesi
Her kuyucuğa 100µl antikor konjugat çalışma solüsyonundan eklenir.
Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için plak örtülür.
İnkubasyon
Mikrotitre plak 37°C de 1 saat inkube edilir.
Bölüm 12
18
Yıkama
İnkubasyon safhasının sonunda tüm yıkama safhaları yukarıda belirtildiği gibi tekrar
edilir
Substrat eklenmesi
Her kuyucuğa 100 µl renk solüsyonu eklenir.
Plak yavaşca karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir.
Kromojenik substratın eklenmesi hemen yapılmalıdır.
Pipetleme safhasında aynı sıra ve zaman aralığı korunmalıdır.
Mikrotitre plak renk yoğunluğunun etkilenmemesi için güneş ışığından korunur.
Stop solusyonu eklenmesi
İnkubasyon safhasının sonunda her kuyucuğa 100 µl stop solüsyonu eklenir.
Plak yavaşca karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir. Pipetleme
safhasında Kromojenik substratın eklenmesi ile aynı sıra ve zaman aralığı korunmalı,
ara verilmeden tamanlanmalıdır. Mikrotitre plak renk yoğunluğunun etkilenmemesi
için güneş ışığından korunur.
Absorbans okunması
450 nm’de ölçüm yapabilmek için uygun filtre takılmış mikroplak okuyabilen
spektrofotometre ile her analiz kuyucuğunun absorbansını ölçünüz.
Bütün ölçümler durdurma solüsyonu ekledikten sonra 30 dakika içinde yapılmalıdır.
Elde edilen sonuçlar kaydedilir ve ortalama absorbans değerleri hesaplanır ya da
bilgisayar programı kullanılır.
Değerlendirme
Standart eğrinin çizilebilmesi için standart değerler kullanılır. Körün değeri bütün
numune ve referans standartlarından çıkarılmalıdır. Her çiftli referans noktasından
ortalama değerler standart eğri çizmek için kullanılır. Her çiftli numuneden elde edilen
ortalama veri bu grafikten derişim hesabı için kullanılır.
Kabul/Red Kriterleri
Geçerli olabilmesi için her yürütmenin prosedürdeki kabul/red kriterlerine uyması
gereklidir. Yürütme aşağıdakilerden oluşur; analiz körü, her GDO pozitif referans
standart ekstraktı, negatif kontrol ve her bilinmeyen numune. Bütün protein
Bölüm 12
19
ekstraktları ve analiz körü çiftli olarak yürütülür. Eğer yürütme analiz kabul ölçütlerine
uymazsa bütün yürütme tekrarlanır.
Yürütme
Ölçüt
Analiz Tampon kör
A450<0,30
%0 GDO standart
A450<0,30
%2,5 Referans
A450>0,8
Bütün pozitif standartlar
Çiftlerin CVsi≤%15
Test edilen numuneler
Çiftlerin CVsi≤%20
Bölüm 12
20
AKIŞ ŞEMASI
Örnek ve referans ekstrasyonu için akış şeması
İşlem
Hacim/Ağırlık
Tanım
Tartım
0,5 g
Örnekler, analiz körü ve referans standartları tartılır.
Ekleme
4,5 ml
Ekstrasyon tamponu eklenir.
Karıştırma
Homojen olana kadar örnek ekstrasyon tamponu ile
karıştırılır.
Santrifüj
5000 rpm
Örnek
5000
rpm’de
15
dakika
santrifüj
edilir
Supernatant temiz bir tüpe alınır.
Seyreltme
1:300 veya 1:10
Örnek veya referans standartları seyreltilir.
incelenen materyale göre
ELISA Immunoanaliz için Akış Şeması
İşlem
Hacim
Tanım
Ekleme
100 µl
Örnek, referans standart ve analiz tampon körü uygun analiz
kuyucuğuna pipetle konulur.
Inkubasyon
1 saat 37°C de inkubasyon yapılır.
Yıkama
3 kez yıkama tamponu ile yıkanır.
Ekleme
100 µl
Antikor konjugatı her analiz kuyucuğuna dağıtılır.
Inkubasyon
1 saat 37 °C de inkubasyon yapılır.
Yıkama
3 kez yıkama tamponu ile yıkanır.
Ekleme
100 µl
İnkubasyon
Ekleme
Absorbans Ölçümü
Her kuyucuğa renk solüsyonu eklenir.
Ortam sıcaklığında 10 dakika bekletilir.
100 µl
Her kuyucuğa durdurma reaksiyonu eklenir.
Plak okuyucuda her kuyucuğun absorbansı 450 nm de
ölçülür.
Bölüm 12
21
Kaynaklar
Clark, M.F. and Adams, A.N. (1977). Characteristics of the microplate method of
enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of
General Virology 34, 475-483.
Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and
Detection Methods. Biosafety Research and Assesment of Tehnology Impacts of
the
Swiss
Priority
Program
Biotechnology-
Report
2/97,
61
pages.
http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php (accessed January
2010).
Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for
detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food
fractions usig reference materials. Journal of AOAC International 83, 919-927.
Longstaff, M., Edmonds, H.S. and Newell, C.A. (1995). An improved method for he
detection and quantification of recombinant protein in transgenic plants. Plant
Molecular Biology Reporter 13, 363-368.
Mohapatra, U., Mccabe, M.S., Power, J.B., Schepers, F Vanderrarend, A., and
Davey, M.R. (1999). Expression of the bar gene confers herbicide resistance in
transgenic lettuce. Transgenic Research 8, 33-44.
Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Deannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,
Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Peschke, V.M., Nida, D.L.,
Taylor, N.B. and Kishore, G.M. (1995). Development, identification, and
characterzation of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Science 35, 14511161.
Bölüm 12
22
Ek Kaynaklar
Brett, G.M., Chambers, S.J., Huang, L. and Morgan, M.R.A. (1999). Design and
development of immunoassays for detection of proteins. Food Control 10,
401-406.
Commision Directive 79/700/EEC of 24 July 1979 establishing Community methods
of sampling for the official control of pesticide residues in and on fruit and
vegetables. OJ L 239, 22.9.1979, p.24.
Rogan, G.J. Dudin, Y.A., Lee, T.C., Magin, K.M., Astwood, J.D., Bhakta, N.S., Leach,
J.N., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1999). Immunodiagnostic methods for
detection of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase in Roundup
Ready® soybeans. Food Control 10, 407-414.
Stave, J.W. (1999). Detection of new modified proteins in novel foods derived from
GMO-future needs. Food Control 10, 367-374.
Van der Hoeven, C., Dietz, A. and Landsmann, J. (1994). Variability of organ-specific
gene expression in transgenic tobacco plants. Transgenic Research 3, 159165.
Bölüm 12
Gıda Örneklerinde
Ek
(Bir Haftalık Kurs)
M. Querci
2
1. GÜN – PAZARTESİ
9:00
Kurs, organizatörler ve katılımcıların tanıtımı
9:30
Teori: GDO saptamada kullanılan genel yöntemler ve kurs içeriğine giriş
ÖRNEKLERİN HAZIRLANMASI: DNA EKSTRAKSİYONU
10:00
Deney: CTAB metodu ile DNA ekstraksiyonu (1. kısım)
10:30
Kahve arası
11:00
Teori: Nükleik asit analizleri için jel elektroforezi
Deney: Agaroz jel hazırlama
12:00
13:00
Öğle arası
14:00
15:15
Deney: Agaroz jele örnek yükleme
16:00
Kahve arası
16:20
Teori: PCR lab düzeni, sorun giderme v.b. üzerine genel değerlendirmeler
17:20
Deney: Agaroz jel sonuçlarının değerlendirilmesi
Ek
3
2. GÜN – SALI
NİTEL PCR
9:00
Teori: Polimeraz Zincir Reaksiyona (PCR) giriş ve transgenik mısır ve
soyanın saptanmasında PCR kullanımı
9:30
Deney: Transgenik MON810 mısır ve Roundup Ready® soya için PCR

Bitki özel: zein ve lectin genlerinin saptanması
10:15
Kahve arası
10:40
Agaroz jel hazırlama
11:00
Seminer: Örnekleme ve doğrulama: temel kavramlar
12:30
Öğle arası
14:00
Agaroz jele örnek yükleme
14:30
Teori: MON810 mısır ve Roundup Ready® soyanın özellikleri ve GDO için
nested PCR’ye giriş
15:15
Agaroz jel sonuçlarının değerlendirilmesi (zein ve lectin için PCR)
16:00
Kahve arası
16:15
Deney: Transgenik MON810 mısır ve Roundup Ready® soya için PCR

17:00
GDO özel: 35S promotör and nos terminatörünün saptanması.
Seminer: GDO’lar ile ilgili AB kanunlarına giriş
Ek
4
3. GÜN – ÇARŞAMBA
NİTEL PCR
9:00
Deney: MON810 mısır ve Roundup Ready® soyanın nested PCR ile spesifik
saptanması (1. PCR reaksiyonu)
10:00
Agaroz jel hazırlama
10:30
Kahve arası
11:00
Seminer: GDO taraması ve analitik kalite güvencesi
12:00
Agaroz jele örnek yükleme (35S promotör ve nos terminatör için PCR)
12:30
Öğle arası
13:30
Deney: MON810 mısır ve Roundup Ready® soyanın nested PCR ile spesifik
saptanması (2. PCR reaksiyonu)
14:00
Agaroz jel sonuçlarının değerlendirilmesi (35S promotör ve nos terminatör için
PCR)
15:00
Deney: Agaroz jel hazırlama
15:30
Kahve arası
15:45
Deney: Agaroz jele örnek yükleme (nested PCR)
16:00
Teori: GDO saptama ve miktar tayini için eş zamanlı (real-time) PCR (RTPCR)’ye giriş
17:30
Deney: Agaroz jel sonuçlarının değerlendirilmesi (MON810 mısır ve Roundup
Ready® soya için nested PCR)
Ek
5
4. GÜN – PERŞEMBE
NİCEL EŞ ZAMANLI (REAL-TIME) PCR (RT-PCR)
9:00
Deney: DNA miktar tayini ve eş zamanlı (real-time) PCR (RT-PCR) için örnek
hazırlama
9:30
Deney: Transgenik Roundup Ready® soyanın saptanması için eş zamanlı
PCR (RT-PCR)

LightCycler (Roche) kullanarak (Grup 1)

ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) kullanarak (Grup 2)
Kahve arası
13:00
Öğle arası
14:00
PCR (RT-PCR)

LightCycler (Roche) kullanarak (Grup 2)

ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) kullanarak (Grup 1)
15:30
Teori: Veri analizi: Bazı istatistiksel terimlere giriş
16:30
Kahve arası
17:00
PCR (RT-PCR)
Ek
6
5. GÜN – CUMA
ROUNDUP READY® SOYANIN ELISA İLE NİCEL SAPTANMASI
9:00
Teori: GDO saptama için serolojik yaklaşım
9:20
Deney: ELISA 1. kısım
10:00
Kahve arası
10:30
Seminer: GDO saptama için serolojik yaklaşım
11:30
12:00
Öğle arası
13:00
14:00
Sonuçların değerlendirilmesi
15:00
Seminer: Genetiği Değiştirilmiş Organizmaların güvenli kullanımı üzerine
uluslararası uzlaşmalar
16:00
Genel tartışma ve kapanış
Ek
JRC Misyonu
LB-X1-06-051-TR-C
JRC’nin misyonu AB politikalarının doğru kavranması, geliştirilmesi, uygulanması ve
izlenebiliriliği için tüketici haklarını gözeten bir biçimde bilimsel ve teknik destek
sağlamaktır. Avrupa Komisyounca sağlanan bir servis olarak JRC, AB için bir bilim ve
teknoloji referans merkezi olarak hizmet vermektedir. Politika geliştirme süreçlerine aktif
olarak katkıda bulunan JRC, birlik üye ülkelerinin ortak çıkarlarını gözetirken her türlü
ulusal ya da özel amaç yahut menfaatten bağımsız hareket eder.

Kurs Elkitabi FULL - EU-RL GMFF

Transkript

Benzer belgeler

Bolum 11 Roundup Ready? Soya`nin Es Zamanli - EU

toplumun genetiği değiştirilmiş ürünlerle ilgili bilgi düzeyi ve bu

laurence jenkell

MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRMEDE YENİ TEKNOLOJİLER

insandaki genetik hastalıklar

Adli Bilimler Etkinliği kitapçığı için lütfen tıklayınız

Trends in Allergies and Intolerances in Nutrition and Food Service

dalebrook 2011 kataloğu yayında

Uluslararası Broşürü

Arby`s Guinness Rekorlar Kitabı`na Adını Yazdırdı