Myasthenia gravis

Myasthenia gravis’de B hücrelerinin
in vitro sitokin aktivitesi
Vuslat Yılmaz, Piraye Oflazer, Fikret Aysal, Yeşim Parman, Haner
Direskeneli, Feza Deymeer, Güher Saruhan Direskeneli
İstanbul Tıp Fakültesi Fizyoloji ve Nöroloji AD,
Bakırköy Ruh ve Sinir Hastalıkları Hastanesi Nöroloji Kliniği,
Marmara Tıp Fakültesi, Romatoloji Bilim Dalı
Myasthenia gravis = MG
myo, muscle; asthenia, weakness; gravis, severe
Prototipik otoimmün hastalık
Antijen; asetilkolin reseptörü: AChR
kasa özgü kinaz (muscle specific kinase):MuSK
Otoantikor = anti-AChR veya anti-MuSK
Otoantijen ile immunizasyon sonucu MG hayvan modeli oluşturulabilir (EAMG)
Hastalık Özellikleri
•
Kadın hasta oranı 3:1 - 4:1
•
Prevalans :
•
•
1997 yılında 85-125/1.000.000
1987 yılında 0.5-5/100.000
Hastalık başlangıcı 2 döneme yoğunlaşmıştır:
20 yaş - 40 yaş
Erken / 60 yaş - 80 yaş Geç
•
Hastalık ağırlıkla jeneralize ,kısmen de oküler seyretmektedir.
•
Tedavide kortikosteroid ve timektomi uygulanmaktadır.
MG Patogenezi
•
ACh
Sinir-kas bileşkesinde AChR özgü antikor ve
kompleman komponentleri birikir:
ACh
 Reseptör blokajı
 Kompleman bağımlı postsinaptik hasar
ACh
asetilkolinesteraz
ACh
ACh
 Antikor bağımlı reseptör harabiyeti
asetilkolinesteraz
•
 Reseptör internalizasyonu
Reseptör sayısı azalır ve sinir-kas iletisi
zayıflar.
Nöromüsküler Bileşkedeki (NMB) Yapılar
MuSK: Muscle Specific Kinase
Agrin: nerve derived protein
MASC: myotube-associated-specifity component
Rapsyn: synapse spesific cytoplasmic protein
MG Alt Tipleri
1- anti-AChR pozitif (AP)
2- anti-AChR negatif
seronegatif(SN)
3- anti-MuSK pozitif (MP)
•
% 85-90
•
IgG1 veya IgG3 tipi
•
Jeneralize MG
•
%10-15
•
Anti-MuSK antikoru (-) grup
•
Antikor ???
•
% 4-6
•
IgG4 veya IgG1 tipi
Dolaşan B hücreleri
hasarlı hücrelerden
salınan öz antijenleri
bağlar.
B hücresi öz peptit için
spesifik bir T hücresi
tarafından aktif olur.
B hücreleri, plazma
hücresine farklılaşır
ve öz antijene spesifik
antikor salgılar
Öze spesifik antikorlar,
inflamatuar cevabı
başlatır ve daha fazla
hücrenin hasarına
sebep olur.
Daha fazla B hücresi
öz antijenleri bağlar,
doku hasarı döngüsü
genişler.
B hücre-T hücre etkileşimi ve antikor
sınıfının değişimi
Amaç
• Bu çalışmada MG hastalarında ve farklı izotipte antikor yapımında
rolü olabilecek B hücrelerinin sitokin üretimini araştırmayı ve
romatoid artrit (RA) grubu ile karşılaştırmayı hedefledik.
Çalışma Grubu
Toplam
(n)
Cinsiyet
Kadın/Erkek
Ortalama
yaş
İlaç kullanan
(Kortikosteroid)
Timektomi
Anti-AChR +
(AP)
33
20 K / 13 E
40,3±18,5
9
6
Anti-MuSK +
(MP)
19
14 K / 5 E
36,2±11,1
15
6
Seronegatif
(SN)
20
16 K / 4 E
44±14,7
9
11
Romatoid
Artrit
20
17 K / 3 E
50±13,4
11
Sağlıklı
kontrol
30
15 K / 15 E
39±11
Yöntem
1.
Periferik kan mononükleer
hücrelerinin (PKMH) gradyan
yöntemi ile izolasyonu
2.
Manyetik boncuk yöntemi (MACS)
ile CD19+B hücrelerinin eldesi
(saflık >%95)
3.
CD40L transfekte fare fibroblastları
üzerinde kültür yapılması
Yöntem
• Hücre kültüründeki uyaranlar:
• Torpedo californica AChR (t-AChR) (P. Christados sağlamıştır.)
• insan rekombinan MuSK (r-MuSK) (M.I. Leite sağlamıştır)
• poliklonal immünoglobulin (poli-Ig)
• CpG / kontrol-CpG
• 48 saat inkübasyon
• Hücre kültürü üst sıvılarında çoklu boncuk sistemi (Luminex) ile
ölçülen sitokinler:
• İL-10, İL-6, İL-12p40, TNF alfa ve TNF beta
150
150
BAZAL YANIT
120
p:0,04
SPONTAN IL-10
p:0,03
100
90
p:0,04
İL-10
50
60
30
0
N=
72
20
27
MG
RA
KON
0
N =
33
20
19
20
27
AP
SN
MP
RA
KON
30000
30000
p:0,03
p:0,04
İL-6
20000
IL-6
20000
10000
10000
0
N=
0
72
20
30
MG
RA
KON
N =
33
20
19
20
30
AP
SN
MP
RA
KON
4000
4000
p:0,05
p:0,04
SPONTAN TNF-beta
2000
1000
TNF-beta
2000
1000
0
N=
p:0,02
3000
3000
0
72
20
30
MG
RA
KON
N =
33
20
19
20
30
AP
SN
MP
RA
KON
4000
4000
İL-12 p40
3000
SPONTAN IL-12p40
3000
2000
2000
1000
1000
0
N=
0
72
20
30
MG
RA
KON
N=
33
20
19
20
30
AP
SN
MP
RA
KON
800
800
TNF-alfa
600
SPONTAN TNF-Alfa
600
400
200
200
0
N =
400
0
72
20
30
MG
RA
KON
N=
33
20
19
20
30
AP
SN
MP
RA
KON
IL-10 Salgısı
150
1000
p:0,03
100
800
50
p:0,02
IL-10
600
0
N=
63
17
24
MG
RA
KON
400
120
NEG
200
Poly Ig
80
IL-10
0
CpG
N = 33 33 33
AP
40
NEG
AChR
0
MuSK
N = 25 25 25
AP
20 20 20
16 16 16
17 17 17
18 18 18
SN
MP
RA
KON
20 20 20
19 19 19
20 20 20
27 27 27
SN
MP
RA
KON
IL-6 Salgısı
30000
p:0,02
30000
p:0,02
20000
10000
IL-6
20000
0
N=
63
17
26
MG
RA
KON
10000
25000
NEG
20000
Poly Ig
15000
IL-6
0
CpG
N = 33 33 33
AP
10000
NEG
5000
AChR
0
MuSK
N = 25 25 25
AP
20 20 20
16 16 16
17 17 17
20 20 20
SN
MP
RA
KON
20 20 20
19 19 19
20 20 20
30 30 30
SN
MP
RA
KON
TNF alfa Salgısı
3000
500
2500
p:0,03
p:0,03
400
p:0,02
2000
TNF alfa
300
1500
200
1000
NEG
100
NEG
500
Poly Ig
AChR
0
MuSK
N = 25 25 25
AP
20 20 20
16 16 16
17 17 17
20 20 20
SN
MP
RA
KON
0
CpG
N = 33 33 33
AP
20 20 20
19 19 19
20 20 20
30 30 30
SN
MP
RA
KON
TNF beta Salgısı
4000
p:0,03
12000
p:0,02
p:0,04
3000
TNF beta
8000
2000
4000
1000
0
NEG
NEG
AChR
Poly Ig
MuSK
N = 25 25 25
AP
20 20 20
16 16 16
17 17 17
20 20 20
SN
MP
RA
KON
0
CpG
N = 33 33 33
AP
20 20 20
19 19 19
20 20 20
30 30 30
SN
MP
RA
KON
Sonuç
•
Bazal ve özgül olmayan uyarana yanıt olarak salgılanan İL-10, İL-6 ve TNFbeta nın hem MG hem de RA’da düşük düzeyde oluşu antikor üretiminde
ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.
•
MG altgruplarında hastalığa özgül uyaranlara karşı sitokin yanıtlarında
belirgin bir fark gözlenmemiştir.
•
Özgül olmayan B hücre uyaranları ise özellikle MuSK MG’de (MP) aynı
sitokinlerin daha düşük uyarıldığına işaret etmektedir.
•
Çalışmanın devamında B hücresi ile ilişkide olan T hücresinin rolü
incelenecektir.
TEŞEKKÜRLER