HEMOSTAZ TESTLERİNİ ETKİLEYEN PRE

HEMOSTAZ TESTLERİNİ
ETKİLEYEN PRE-ANALİTİK
FAKTÖRLER
Doç.Dr.Z.Günnur Dikmen
HÜTF Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı
Merkez ve Acil Laboratuvarları
19-20 Mayıs, Pre-Analitik Evre Sempozyumu, Adana
Koagülasyon ve Hemostaz Laboratuvar Testleri
Primer Hemostaz Testleri:
Kanama zamanı
Trombosit fonksiyon testleri
Sekonder Hemostaz Testleri:
Prothrombin Time (PT)
Aktive Parsiyel Thromboplastin Time (aPTT)
Trombin zamanı
Faktör düzeyleri (Faktör I-XIII)
Tromboz paneli
(Protein S, Protein C, AT III)
Kan vermeden 24 saat önce
ağır egzersizden
kaçınılmalıdır.
•Akut ağır egzersiz, prokoagülan bir durum yaratır;
-platelet hiperreaktivitesine,
-pıhtılaşma faktörlerinin aktivitesinde artışa,
-trombin üretiminde artışa yol açar.
•Tüm bu etkiler geri dönüşümlü olup, 24 saat içinde
normale döner.
Favaloro EJ. Lab Medicine 2012
İlaç kullanımı
• Heparin, vitamin K antagonistleri gibi anti-koagülan ilaç
veya veya anti-platelet ilaç kullanan hastalar hakkında
laboratuvara bilgi verilmelidir.
• Heparin tedavisi alanlarda yanlış lupus anticoagulant veya
düşük faktör seviyesi saptanabilir.
• Oral antikoagülan kullanımına bağlı Protein C ve protein S
düzeyinde yanlış düşüklük saptanabilir.
• Kalıtsal trombofililer için tarama, aktif bir trombotik
epizoddan sonra istenmemelidir. (ATIII, Protein C, Protein S,
APC rezistansı)
Sigara ve Diyet
• Sigara içimi platelet aggregasyonunu artırdığı
için kan vermeden önce sigara içilmemelidir.
• Kan örneği, 8-10 saatlik açlık sonrası alınmalıdır.
• Yağlı yemekler FVII aktivitesini artırırken, bazı
faktörlerin aktivitesini (FII, FIX, FX, FVII, FXII) azaltmaktadır.
• Şilomikronlar platelet aggregasyonunda interferans yaratır.
Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565–575
Sirkadiyen Ritm
• Sabaha karşı yükselen kan basıncı, kortizol artışı,
geçici bir vazokonstrüktif ve protrombotik etki
yaratır.
- Akut arteriel tromboz (Angina, AMI, ani ölüm)
- Venöz tromboembolizm (VTE)
- Serebral hemorajiler sabah saatlerinde pik yapar.
• Koagülasyon ve fibrinolizis testleri için kan alımı,
günün hep aynı saatinde tercihan sabah saatlerinde
yapılmalıdır.
Semin Thromb Hemost 2009; 35(3). Circadian Variation within Hemostasis
Kan Alımı
1) Turnike süresi <1 dk olmalı
• Turnike süresinde uzama, ekstravazasyon
sonucu damar içinde hemokonsantrasyona neden olur:
-Fibrinojen ve diğer faktörlerde artışa,
-APTT and PT’de kısalmaya yol açar.
2) Orta boy iğneler (19 - 21 gauge)
3)Primer vakumlu tüpler
4) Kan alımını takiben 3-6 kez alt üst etme
Yetersiz karıştırma → Pıhtılı örnek
Fazla sert çalkalama → Hemoliz, faktör aktivasyonu sonucu PT/aPTT’de kısalma
Koagülasyon testleri için tüp
Trisodyum sitrat içeren mavi kapaklı tüpler
(108 mM%3.2 veya 129 mM  %3.8)
• Sonuçların standardizasyonu için hep aynı sitrat
konsantrasyonuna sahip tüplerle çalışılmalıdır.
• Tüpler çizgi seviyesine kadar doldurulmalıdır.
• İdeal antikoagülan/kan oranı (1/10): 9 birim kan,
1 birim antikoagülan
Bu oranın tutturulamaması nedeniyle enjektörle kan alımı tavsiye
edilmez, zorunluluk nedeniyle alınmışsa 30sn içinde sitratlı tüpe
aktarılması gerekir.
Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565–575
Hemostaz testleri ve TFT için fizyolojik pH’nın
sağlanması kritik öneme sahiptir.
• Trisodyum sitrat örnek pH’sını 7.30-7.45 arasında tutar.
• Kapağı 30dk.dan fazla açık tutulan örneklerde
plazmadan çevre atmosfere CO2 difüze olur ve pH
yükselir.
• pH artışı özellikle PT ve aPTT testlerinde uzamaya
neden olur.
(0.8 ünitlik pH artışı → aPTT’de 20sn uzama)
• Plazması ayrılmış örneklerde, Hb tamponlama
kapasitesi kaybolur, bu nedenle tam kan örneklerine
göre pH değişikliklerine daha hassatır.
Yanlış tüp
• Koagülasyon testleri K-EDTA, Li-heparin içeren tüpler kullanılamaz.
• Cam tüpler kullanılmaz. Negatif yükü olan cam yüzey ile temas eden
koagülasyon faktörleri aktive olabilir.Bu nedenle hemostaz
testlerinde polipropilen plastik tüpler tercih edilir.
• Alikotlamada kullanılacak sekonder tüpler polipropilen olmalı
• Polistren sekonder tüpler koagülasyon testleri için uygun değildir,
platelet aktivasyonu tetikler!
• Alikotlama yapıldıktan sonra, sekonder tüplerin identifikasyonu
yapılmalı ve pH değişikliğini önlemek amacıyla ağzı kapatılmalıdır.
• Alikotlanmış fakat identifikasyonu yapılmamış sekonder tüplerdeki
plazma örneklerinin karışma riski vardır!
• aPTT testinde pıhtı tespit edilemiyorsa muhtemelen örnek serumdur
veya lityum heparinli tüpe alınmış plazma örneğidir.
Hastada bilinen sistemik bir hastalık var mı?
Tiroid hastalıklarında hemostaz bozuklukları sıktır.
Franchini M et al. Seminars in Thrombosis & Hemostasis 2009
Yüksek Htc düzeyleri sorun mudur?
• Yüksek Htc değerlerinde eritrosit sayısındaki artış,
kan/antikoagülan oranını bozacaktır, bu nedenle
düzenleme yapılması gereklidir:
• Htc>%55 ise CLSI kılavuzuna göre önerilen
hematokrit-bağımlı düzenleme:
• Sitrat Konsantrasyonu: [1.85x103]x[100-hematokrit]x
[kan hacmi]
• Hematokrit değeri %55-65 arasında ise 0.1 mL sitrat
tüpten çıkarılabilir.
Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565–575
Örneklerin
Transportu
*Transport dik pozisyonda ve oda ısısında yapılmalı
*Pnömotik sistemin yol açtığı fiziksel travma; platelet
aktivasyonuna ve eritrositlerden ADP salınımına yol açar.
*Bu nedenle TFT için pnömotik sistem tercih edilmez!
*Plazmanın kullanıldığı diğer koagülasyon testleri için
pmömotik sistem kullanılabilir.
*Örneklerin santrifüjden sonra transportu gerekirse ve
alikotlama yapılmamışsa, analizden önce mutlaka yeniden
santrifüj edilmelidir!
Örnek Kabulünde
Red Nedenleri
Pıhtılı örnek
%38.4
Uygunsuz örnek hacmi
%33.2
Hatalı klinik istem
%7.3
Hatalı kimlik tanımlama
%6.5
Hemoliz
%6
Yanlış tüp
%3.8
Gecikmiş transport
%1.5
Z.G. Dikmen, A .Pınar, F. Akbıyık. Specimen rejection in laboratory medicine: Necessary for patient safety?
Biochemia Medica 2015;25(3):377–85
Tüp Dolum Oranının Sonuçlara Etkisi
•
•
Tüplerin %90’dan az dolu olması red nedenidir.
Yetersiz hacim
-PT sonucunu fazla etkilememektedir.
-aPTT sonucunda belirgin uzamaya,
-Fibrinojen ve FVIII düzeylerinde düşüklüğe neden olmaktadır.
Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565–575
Tüp dolum oranının test sonuçlarına etkisi
Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565–575
Pıhtı Varlığı
• Pıhtı varlığı, boyutundan bağımsız olarak red
nedenidir.
• Örnekte mikropıhtı olması koagülasyon kaskadının
ve plateletlerin analizden önce aktive olduğunu
gösterir.
Seminars in Thrombosis & Hemostasis 2012
Hemoliz
• Eritrositlerin parçalanmasıyla hücre dışına çıkan serbest
hemoglobin, spektrofotometrik ölçümlerde interferans
yaratabilir.
• Membranların parçalanmasıyla açığa çıkan membran
fosfolipileri, hücre içi enzimler ve ADP → platelet
aktivasyonuna neden olarak primer ve sekonder hemostazı
etkiler.
• Hemolizli örneklerde fibrinojen düşer, D-dimer düzeyi yükselir.
Santrifüj ve Plazma Eldesi
• Santrifüj oda sıcaklığında 1500g, 10-15dk
• Daha düşük derecelerde yapılan santrifüj, platelet ve
pıhtılaşma faktörlerinin aktivasyonuna neden olur.
• Plazma ideal olarak 1 st içinde veya en geç 4st içinde santrifüj
edilerek ayrılmalı
• Tra
Transport süresindeki uzama nedeniyle Protein S, Faktör V ve VIII’de aktivite kaybı olur!
Seminars in Thrombosis & Hemostasis Vol. 2012
Plazma Örneklerinin Saklanması
• Soğukta saklama (+40C):Trombositlerin granüler şekil almasına,
kontrakte olup mikrotübüler sistemlerini kaybetmelerine yol
açar. Spontan platelet aggregasyonuna neden olur.
• Soğukta vWF ve Faktör VIII aktivitesi azalır, Faktör VII aktive olur!
• 2 hafta içinde çalışılacak testler için -20oC yeterlidir.
• 2 haftadan daha geç çalışılacak aylık testler için -70oC gereklidir.
• Plazma başka bir merkeze gönderilecekse kuru buz üzerinde
transfer edilmelidir.
Örneklerin Çözdürülmesi
• Dondurulmuş örnekler 370C’lik su banyosunda
5-10 dk bekletilerek çözülmeli, tamamen
çözüldükten sonra iyice karıştırılmalıdır.
• 370C’de uzun süre kalması veya daha yüksek
sıcaklıklara maruz kalması faktör inaktivasyonuna
ve güvenilir olmayan test sonuçlarına neden olur.
• Çözdürülmüş örnekler tekrar dondurulmamalıdır!
Seminars in Thrombosis & Hemostasis Vol. 2012
Dondurup-Çözdürme
• FII, FVII, FX, FIX, FXI, Antithrombin III, Protein C,
VWF ve plasminogen aktiviteleri birkaç kez
dondurup-çözdürmeden etkilenmez.
• FVIII, tek bir çözdürmeden sonra bile aktivitesini
kaybedebilir.
• FXI aktivitesi artabilir.
• Özellikle FV and FVIII, Proetin S aktivitesi , birkaç
kez dondurup-çözdürmeden sonra azalır.
Seminars in Thrombosis & Hemostasis Vol. 2012
Trombosit Fonksiyon Testleri (TFT)
• Agregometri → gold standart test
• Plateletleri aktive eden agonistler (ADP, epinefrin,
kollagen, ristosetin) PRP’ye eklenerek platelet
agregasyonu 37oC’de monitörize edilir.
KOLLAGEN İLE UYARILAN AGREGASYON
0
YÜZDE
Agregasyon
Trombositlerde
şekil değişikliği
c
Reaktif ekleme
Baseline
100
a
b
ZAMAN (Dak:sn)
a
b
c
Örnek Kabulü ve Plazma Eldesi
• Hastanın kullandığı ilaçlar (aspirin, NSAI, antibiyotik, anti-depresan,
anti-koagulan vs) 10-14 gün önce kesilmelidir.
• Kan vermeden 1-2 gün önce soğan, sarımsak, zencefil, ginseng,
balık yağı, vitamin C, vitamin E, alkol ve kafein alınmamalıdır.
• Örnekler oda ısısında elde transport edilmelidir.
• TFT için hastanın trombosit sayısı >50x103
•PRP (TROMBOSİTTEN ZENGİN PLAZMA)
1000g’de 7dk santrifüj edilerek elde edilir.
•PPP (TROMBOSİTTEN FAKİR PLAZMA): Kör olarak kullanılır.
2500 g’de 7dk santrifüj ile elde edilir.
TFT, santrifüjden 30dk sonra-4 st içinde
yapılmalıdır!
• Santrifüj sırasında eritrosit ve
plateletlerden salınanan ADP
nedeniyle santrifüjü takiben
30 dk süresinde plateletlerde
cevapsızlık görülebilir.
• 4 saatten sonra örneklerdeki
pH artışı ve enerji
rezervlerinin tükenmesi
nedeniyle nedeniyle TFT’de
düzgün yanıt alınmaz.
Yanlış negatif sonuç
sayısı
2. saat
4. saat
8. saat
1
6
13
(%5)
(%30)
(%65)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Agonistler
ADP (2 µM)
ADP (6 µM)
Epinefrin
Kollajen
Ristosetin (0,5 mg/ml)
Ristosetin (1,25 mg/ml)
4
(%20)
1
(%5)