Genetiği modifiye edilmiş bakteriyosinler Genetically modified

Genetiği modifiye edilmiş bakteriyosinler Genetically modified

Journal of Cell and Molecular Biology 11(1&2):1-11, 2013
Haliç University, Printed in Turkey.
http://jcmb.halic.edu.tr
Review Article 1
Genetiği modifiye edilmiş bakteriyosinler
Genetically modified bacteriocins
Fadime KIRAN, Harun ÖNLÜ, Özlem OSMANAĞAOĞLU*
Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Tandoğan 06100, ANKARA
(*author for correspondence; [email protected])
Received: 06 February 2013; Accepted: 25 November 2013
Abstract
The use of bacteriocins as new generation antibiotics in clinical, food and agricultural applications has
been the subject of numerous studies. Nowadays, various information are available about mode of
action, structure and functions of bacteriocins. However, genetic modifications are very important in
order to develop the basic understandings of structure-function relationships, stability and activity of
bacteriocins. New approaches resulting in the formation of mutant and hybrid may permit the
discovery of novel potent bacteriocins against different strains of pathogen bacteria and thus,
development of a simplified drug. Particularly, genetically modified bacteriocins resulting with
increasing of stability may promise to improve the quality and safety of foods in the future. In this
review, information about the genetic modifications used for improving the stability, potential and
activity spectrum of bacteriocins are summarized.
Keywords: Bacteriocin, genetic modification, hybrid, fusion
Özet
Bakteriyosinlerin klinik, gıda ve tarımsal uygulamalarda yeni nesil antibiyotikler olarak
kullanılabilirliği birçok çalışmaya konu olmuştur. Günümüzde, bakteriyosinlerin etki mekanizmaları,
yapı ve fonksiyonları ile ilgili birçok bilgi mevcuttur. Bununla beraber genetik modifikasyonlar,
bakteriyosinlerin yapı-fonksiyon ilişkileri, kararlılıkları ve aktiviteleri ile ilgili temel anlayışları
geliştirmek amacıyla oldukça önemlidir. Mutant ve hibrit oluşumu ile sonuçlanan yeni yaklaşımlar
özellikle patojen bakterilerin farklı suşlarına yönelik uyarlanmış yeni ve kuvvetli bakteriyosinlerin
keşfine ve dolayısıyla sadeleştirilmiş ilaç geliştirilmesine izin verebilmektedir. Özellikle kararlılığın
artışı ile sonuçlanan genetiği modifiye bakteriyosinler ise gelecekte gıdaların güvenliğini ve kalitesini
artırmak adına umut vaat etmektedir. Bu derleme çalışmasında, özgül olarak bakteriyosinlerin
kararlılıklarını, potansiyellerini ve aktivite spektrumlarını artırmak amacıyla gerçekleştirilen genetik
modifikasyonlar hakkında bilgi verilmiştir.
Anahtar sözcükler: Bakteriyosin, genetik modifikasyon, hibrit, füzyon
Giriş
Bakteriler tarafından üretilen ve dar antimikrobiyal
etki alanına sahip protein yapısında ribozomal
sentez ürünleri olarak tanımlanan bakteriyosinler,
mikrobiyal
dünyada
bakterilerin
savunma
sisteminin önemli bir parçasını oluşturmaktadır
(Tagg ve ark., 1976). Moleküler büyüklük, fiziksel
özellik, kimyasal yapı ve etki mekanizması gibi
özellikler
esas
alınarak
gerçekleştirilen
sınıflandırma sisteminde, lantibiyotikler,
labirintopeptinler ve saktibiyotikler gibi
translasyon sonrası modifikasyona uğramış
tüm bakteriyosinler Grup I bakteriyosinler
başlığı altında toplanmaktadır. Grup II
bakteriyosinler ise dört alt gruptan
oluşmaktadır. Grup IIa; pediyosin benzeri
güçlü antilisterial (pediyosin PA-1 gibi)
bakteriyosinleri, Grup IIb; iki peptit
bakteriyosinleri (plantarisin EF gibi), Grup
2 Fadime KIRAN et al.
IIc; halkasal bakteriyosinleri (laktokoksin A gibi),
Grup IId ise diğer gruplara dahil olmayan
bakteriyosinleri içermektedir. Isı dayanıklılığı
olmayan büyük moleküler ağırlıklı antimikrobiyal
proteinler
ise
Grup
III
bakteriyosinler
(bakteriyolizinler) olarak sınıflandırılmaktadır (Rea
ve ark., 2011). Günümüz teknolojisinde bu
sınıflandırma modelleri bakteriyosinlerin aminoasit
dizileri ve konsensus motifleri gibi özellikleri
dikkate alınarak revize edilmiş ve yapı-temelli
parmak izi dizi tanımlaması tekniği kullanılarak 12
grup altında değerlendirilmiştir (Kiran ve
Osmanagaoglu 2012; Zouhir ve ark., 2010).
Zararlı
bakterilere
karşı
kullanılan
antibiyotiklere
karşı
dirençlilik
özelliğinin
oluşabilme riski, bakteriyosinlerin özellikle gıda ve
sağlık alanlarında antibiyotiklere karşı alternatif
doğal koruyucular olarak kullanılma fikrini ortaya
koymuştur.
Ancak,
gıda
sistemlerinde
antimikrobiyallerin yeni uygulamaları göz önüne
alındığında 3 önemli kriterin sağlanması
gerekmektedir:
güvenilirlik,
kalite
ve
beslenme/sağlık. Bakteriyosinler mikrobiyal kalite
ve güvenlik anlamında değerlendirildiğinde bu 3
kriterin tüm yönlerini taşıyacak potansiyele
sahiptirler (Mills ve ark., 2011). Bununla beraber,
endüstride kullanımları henüz tam olarak beklenen
başarıya ulaşamamıştır. Özellikle Gram-negatif
patojen mikroorganizmaların gıdalar için büyük
risk teşkil ettiği düşünüldüğünde sadece
bakteriyosin kullanımıyla gıdaların güvenliğinin
sağlanamayacağı nettir. İlaveten düşük üretim,
kararlı olmayan ürün eldesi, gıda içerisindeki bazı
uygun
olmayan
koşullara
dayanıksızlık
bakteriyosinlerin gıdalarda kullanımını kısıtlayan
başlıca etmenlerdir. Bu sebeple, bakteriyosinlerin
genetik mühendisliği gibi ilave yaklaşımlarla
geliştirilmesi gündeme gelmiştir. Bu yaklaşım;
bakteriyosin geninin düzenlemelerini, peptit üretimi
için gerekli olan biyosentetik enzimlerin in vitro
çalışmalarını ya da antimikrobiyal maddenin bir
kısmının ya da tamamının kimyasal sentezini
içerebilmektedir.
Genetiği modifiye edilmiş bakteriyosinler gıda
güvenliğinde önemli bir gelecek vaat etmektedir.
Bu derleme çalışmasında, bakteriyosinlerin
kararlılıklarını,
potansiyellerini
ve
aktivite
spektrumlarını artırmak amacıyla gerçekleştirilen
genetik modifikasyonlar hakkında bilgi verilmiştir.
Bakteriyosinlerde
kullanılan
mühendisliği yaklaşımları
genetik
Bakteriyosin biyomühendisliği, bakteriyosin
çözünürlüğünü ve kararlılığını geliştirmek,
antimikrobiyal aktivitesini ve spektrumunu
artırmak amacıyla kullanılmaktadır (Cotter,
2012). Doğal bakteriyosini kodalayan gen,
biyomühendislik yaklaşımları için ideal bir
adaydır.
Antimikrobiyal
maddenin
ribozomal doğası ise bakteriyosinlerin klasik
antibiyotiklere göre genetik mühendisliği
çalışmalarına daha toleranslı olduğunu
göstermektedir.
Bununla
beraber,
bakteriyosinlerin genetik organizasyonu ve
biyosentetik yolları ile ilgili artan sayıdaki
bilgi, bakteriyosinlerin analizlerini ve
genetik modifikasyonlarını kolaylaştırmakta
ve antimikrobiyal ajan olarak kullanımlarını
kuvvetlendirmektedir (Pag ve Sahl, 2002;
Rodriguez ve ark., 2003). Genetiği modifiye
bakteriyosinlerin başarılı sentezi; hücre
büyümesi, gen ifade seviyesi, son
rekombinant ürünün yerleşimi, translasyon
sonrası modifikasyonlar ve düzenlemeler
gibi birçok faktöre bağlıdır (Makrides,
1996). İlaveten, konuk hücrenin seçimi ve
genetik elementleri bu hücre tarafından
kodlanması istenilen genin başarılı gen
ifadesi için oldukça önemlidir (Rodriguez ve
ark., 2003).
Bilim adamları bakteriyosinleri içeren
biyomühendislik çalışmalarının altın çağına
girdiğini öne sürmektedir (DuPont ve
DuPont, 2011). Kapsamlı biyomühendislik
temelli yaklaşımlar bakteriyosin kodlayan
gende herhangi bir mutasyonu ya da farklı
bakteri türlerinden farklı genlerin füzyonunu
içermektedir (Gillor ve ark., 2005). Özellikle
Grup
IIa
bakteriyosinlerinde
bazı
aminoasitlerin başka bir aminoasitle yer
değiştirilmesi
sonucunda
mutantların
oluşturulması
sıklıkla
kullanılan bir
yöntemdir. Ancak, elde edilen mutantların
çoğunda bakteriyosin aktivitesinde azalma
gözlemlenmiştir. Aktivitede artışa neden
olma umuduyla kullanılan diğer bir genetik
modifikasyon yaklaşımı ise; rastgele
mutantların oluşturulduğu hata eğilimli
Polimeraz
Zincir
Reaksiyon
(PCR)
tekniğidir (Lohans ve Vederas, 2012). Bu
tarz
çalışmaları
daha
sonrasında
GM bakteriyosinler 3
yönlendirilmiş mutajenez (site-directed) gibi daha
hedefli biyomühendislik çalışmaları izlemiştir.
Bölgeye yönlendirilmiş mutajenez yaklaşımı ilk
kez 1990’ların başında Oscar Kuipers, Norm
Hansen ve Mike Gasson isimli araştırıcılar
tarafından
lantibiyotiklerin
kullanıldığı
uygulamalarla bakteriyosin araştırmalarına dahil
edilmiştir (Dodd ve ark., 1995; Kuipers ve ark.,
1992; Liu ve Hansen, 1992). Daha sonrasında,
Kuipers ve ekibi antimikrobiyal etki mekanizması
ile ilgili çeşitli nisin varyantlarının oluşturulduğu
kritik çalışmalara imza atmışlardır (Breukink ve
ark., 1999; Wiedemann ve ark., 2001). Genetik
mühendisliği tabanlı bu yaklaşımlar, ebeveyne ait
soyun bir kodonunda ya da bazı durumlarda bir
nükleotitinde yapılan değişiklikler sonucunda
lantibiyotik üreten varyantların oluşturulmasını
kolaylaştırdığı için oldukça ilgi çekici bulunmuş,
yeni ve paralel araştırmaların gelişmesine neden
olmuştur (Cotter, 2012). Bu yaklaşıma ilaveten,
ilişkili bakteriyosinler çok sayıda rastgele mutant
oluşturmak için NNK tarama gibi yaklaşımlarla da
değerlendirilmektedir. NNK tarama peptitteki her
bir rezidünün görevinin sistematik araştırmasına
izin veren bir yaklaşımdır. Doğal kodon NNK üçlü
oligonükleotitleri ile tek tek yer değiştirmekte ve
böylece 20 proteojenik amino asitin herhangi biri
bu kodon tarafından kodlanan aminoasit yerine
geçmektedir. Bu yaklaşım ayrı ayrı her bir mutantın
eldesi için fazla zaman harcamadan, çok fazla
sayıda varyantın oluşmasına izin vermekte ve
mutant elde etme olasılığını artırmaktadır. NNK
tarama antibakteriyel aktiviteden sorumlu her
rezidünün öneminin anlaşılabilmesi amacıyla
pediyosin PA-1’e uygulanmış ve çalışma aktivite
artışının gözlendiği başarılı mutantların eldesiyle
sonuçlanmıştır (Tominaga ve Hatakeyama, 2006).
Biyomühendislik temelli yaklaşımların temel
amacı, bakteriyosinlerin mümkün olduğunca etkin
bir şekilde geliştirilmesidir. Genellikle bir
aminoasitin değiştirilmesi ise başarılı varyantların
oluşturulması için yeterli olamamaktadır. Bu
durum, çoklu aminoasit dizilerinin değiştirilmesi
sonucunda hibrit bakteriyosinlerin oluşturulmasını
içeren farklı yaklaşımların geliştirilmesine neden
olmuştur. Bu yaklaşım kapsamında pediyosin PA1’in belirli bölgelerinin aynı gruba ait diğer 10
bakteriyosinle karıştırılması neticesinde farklı
hibritleri içeren DNA-karma kütüphaneleri
oluşturulmuştur. Bu hibritlerin bazıları doğal tip
bakteriyosine
göre daha
yüksek aktivite
sergilemiştir (Tominaga ve Hatakeyama,
2007).
Yeni
analog
bakteriyosinler
oluşturmanın bir başka yöntemi de bir
bakteriyosinin N sonlanma bölgesinin diğer
bir bakteriyosinin C sonlanma bölgesi ile
birleştirilerek kimeraların oluşturulmasıdır.
Pediyosin PA-1’ın diğer Grup IIa
bakteriyosinleri ile oluşturdukları bazı
kimeralar
doğal
bakteriyosinler
ile
karşılaştırıldığında, indikatör suşlara karşı
aktivitelerinin arttığı tespit edilmiştir
(Johnsen ve ark., 2005). Bakteriyosin
genlerinin farklı bir mikroorganizmaya
aktarılması ve bakteriyosin ile ilişkili
modifiye proteinlerin kullanılması ise
bakteriyosin
biyomühendisliği
için
uygulanabilir başka bir seçenektir. Bu
yaklaşım bakteriyosinlerin saflaştırılmasını
kolaylaştıran ve üretim kapasitesini arttıran
füzyon proteinlerinin üretimine izin
vermektedir. Bununla beraber, analogların
biyolojik üretimi aminoasit kütüphanelerinin
kısıtlamalarına
uğramaktadır.
Bu
olumsuzlukları ortadan kaldırmak amacıyla,
kimyasal peptit sentezi kullanılabilmektedir.
Ancak, kimyasal olarak sentezlenen bir
bakteriyosinin tedavi edici bir ajan olarak
kullanılabilmesi için, doğal olarak üretilen
her hangi bir bakteriyosine göre daha üstün
olması beklenmektedir.
Mutant ve hibrit oluşumu ile sonuçlanan
farklı
yaklaşımlar,
özellikle
patojen
bakterilerin
farklı
suşlarına
yönelik
uyarlanmış
yeni
ve
kuvvetli
bakteriyosinlerin keşfine ve dolayısıyla
sadeleştirilmiş ilaç geliştirilmesine izin
verebilmektedir.
Genetiği modifiye edilmiş bakteriyosinler
Genetik
mühendisliği
tekniklerinin
kullanımıyla artan aktivitede, kararlılıkta ve
spektrumda çeşitli bakteriyosin varyantları
elde
edilebilmektedir.
Son
yıllarda
gerçekleştirilen birçok biyomühendislik
temelli çalışmanın odağı olan nisin, Avrupa
birliğinde
gıda
koruyucusu
olarak
kullanımına izin verilen tek doğal
antibakteriyel madde olup, ilk kez 1953
yılında İngiltere’de pazarlanmıştır. 1983’de
Avrupa gıda katkı maddeleri listesine E234
koduyla kaydedilmiş ve kullanımı 50’yi
4 Fadime KIRAN et al.
aşkın ülkede onaylanmıştır (Delves-Broughton ve
ark., 1996). Günümüze kadar gerçekleştirilen
çalışmalar nisinin çeşitli özelliklerinin genetik
mühendisliği yaklaşımları ile geliştirilebileceğini
göstermektedir (Rink ve ark., 2007). Rastgele
mutajenez çalışmaları ile özellikle Gram-pozitif
bakterilere karşı daha etkili gelişmiş varyantlar elde
edilebilmiştir. Bununla beraber Gram-negatif
bakterilere
etki
edebilen
varyantları
da
tanımlanmıştır (Yuan ve ark., 2004). Bölgeye
yönlendirilmiş mutajenez kullanılarak elde edilen
mutantlarda
Listeria
monocytogenes
ve
Staphylococcus aureus suşlarına karşı yüksek
aktivite tespit edilmiştir (Field ve ark., 2008).
Nisinin klinik amaçlı kullanımlarında, en büyük
problem fizyolojik pH’da düşük çözünürlüğe sahip
olmasıdır. Bununla beraber, nisin Z’de 27.
pozisyonda bulunan asparajin ve 31. pozisyonda
bulunan
histidin
aminoasitinin
bölgeye
yönlendirilmiş mutajenezle lizin rezidülerine
dönüştürülmesi neticesinde, bakteriyosinin nötral
pH’da çözünürlüğünün belirgin bir şekilde arttığı
ve asit katalizli kimyasal bozulmalara daha dirençli
olduğu tespit edilmiştir (Rollema ve ark., 1995).
Tiopeptitlerle
gerçekleştirilen
çalışmalar
neticesinde oluşturulan yarı sentetik türevlerinde
ise su çözünürlüğünün arttığı belirlenmiştir (Citron
ve ark., 2012). Elde edilen bu sonuçlar, nisinin
klinik uygulamalarda da kullanılmasına olanak
sağlamaktadır.
Lantibiyotiklere
dahil
olan
diğer
bakteriyosinlerin genetiği modifiye türevleri in
vitro çalışmalarla oluşturulmuştur (Levengood ve
ark., 2009). Laktisin 3147 bakteriyosini ile
gerçekleştirilen rastgele mutajenez çalışmalarında
8000’e yakın varyant elde edilmiştir. N terminalin
reseptör bağlanma bölgesi ve C terminalin por
oluşturma bölgesi arasında yer alan 22.
pozisyondaki
lizin
aminoasitinin
treoninle
değiştirilmesi neticesinde oluşturulan varyantın,
Gram-pozitif bir patojen olan Streptococcus
agalactiae ATCC 13813 suşuna karşı daha fazla
inhibisyon sergilediği tespit edilmiştir. İlave
mutasyonların ise Gram-negatif bakterilere karşı
etkili varyantların oluşumuna neden olduğu
belirlenmiştir (Field ve ark., 2008). Laktosin S ile
gerçekleştirilen başka bir çalışmada ise mutant
formun doğal olana göre daha kararlı olduğu rapor
edilmiştir (Ross ve ark., 2012).
Grup IIa bakteriyosinleri genetik modifikasyon
çalışmalarında kullanılan diğer önemli bir gruptur.
Bu gruba dahil olan bakteriyosinlerin yapıfonksiyon
ilişkilerini
anlamak,
kararlılıklarını ve spektrumlarını artırmak
amacıyla
çeşitli
araştırmalar
gerçekleştirilmiştir. Birincil yapıları temel
alındığında,
pediyosin
benzeri
bakteriyosinlerin peptit zincirleri kabaca; N
terminalde yüksek derecede korunmuş
hidrofilik ve katyonik bölge ile C terminalde
daha az korunmuş, hidrofobik veya amfifilik
bölgeden meydana gelmektedir (Fimland ve
ark.,
1996).
NMR
çalışmaları,
N
terminaldeki antiparalel
beta tabaka
yapılarının disülfit köprüleri ve amfifilik
alfa heliks döngüsüyle korunduğunu, C
terminalin ise nispeten yapılandırılmadığını
göstermektedir (Wang ve ark., 1999).
Bakteriyosin üç boyutlu düzenlenmelerinde
önemli etkiye sahip olan ilave disülfit
köprülerinin bakteriyosin aktivitesini ciddi
bir şekilde arttırdığı bilinmektedir. Sakasin
P’nin C terminaline disülfit köprülerinin
eklenmesini içeren bölgeye yönlendirilmiş
mutajenez
çalışmaları,
bakteriyosin
aktivitesini düşük sıcaklığa bağlı hale
getirmiştir (Fimland ve ark., 2000). Bu
sonuç, iyi korunmuş katyonik N terminal
bölgenin pediyosin benzeri bakteriyosinlerin
hedef hücrelere elektrostatik etkileşimlerle
bağlanmasına aracılık ettiğini ve disülfit
köprülerinin
aktivite
üzerinde
etkili
olduğunu, C terminalin ise hedef hücre
zarının hidrofobik bölgesine girdiğini
göstermektedir (Miller ve ark., 1998).
Gerçekleştirilen diğer bazı çalışmalarda,
lökosin A ve mezenterisin Y105’de bulunan
9. ve 14. sistein aminoasitleri serin ile yer
değiştirilmiş ve bakteriyosin aktivitesinde
azalma gözlemlenmiştir (Derksen ve ark.,
2006; Fleury ve ark., 1996). İlaveten
alliglisin,
norvalin,
fenilalanin
gibi
hidrofobik rezidülerin yer değiştirilmesi ise
lökosin A aktivitesinde önemli derecede
artışa neden olmuştur (Derksen ve ark.,
2008). Disülfüt köprülerinin karboksil
grupları ile yer değiştirilmesi sonucunda ise
peptitin biyolojik aktivitesinde düşüş
gözlemlenmiştir (Derksen ve ark., 2006).
Grup
IIa
bakteriyosinlerin
etki
mekanizmalarının değerlendirilmesi, artan
potansiyelde
yeni
mutantların
GM bakteriyosinler 5
oluşturulmasına izin vermektedir. Bakteriyosinlerin
net pozitif yükünün arttırılması hedef hücrenin zarı
ile elektrostatik etkileşimi teşvik etmekte ve
aktivitede artışa neden olmaktadır. Örneğin, C
sonlanma bölgesine eklenen ilave lizin ile
oluşturulan 44K ve Y20K sakasin P mutantlarında
hücreye bağlanma potansiyelinin doğal tip
bakteriyosine oranla arttığı tespit edilmiştir
(Kazazic ve ark., 2002).
Bakteriyosinlerin gıda katkı maddesi olarak
kullanılabilmeleri için gıdanın farklı çevresel
koşullarında kararlı kalabilmeleri gerekmektedir.
Pediyosin benzeri birçok bakteriyosinde metiyonin
rezidüleri bulunmaktadır. Bu rezidüler sülfür
atomlarını okside ederek bakteriyosinin kararsız
hale gelmesine neden olmaktadır. Johnsen ve
arkadaşları (2005) pediyosin PA-1’deki Met13
rezidüsünü alanin, lösin, izolösin ve asparajin ile
değiştirerek çeşitli varyantlarını oluşturmuşlar ve
Met13’ün
belirtilen
bu
aminoasitler
ile
değiştirilmesi sonucunda oluşan varyantların peptiti
oksidasyondan koruduğunu belirtmişlerdir. Bu
genetik modifikasyon antimikobiyal aktivitede
etkili bir değişikliğe neden olmamıştır. Met13’ün
asparajin ile değiştirilmesi sonucunda ise
antimikrobiyal aktivitede önemli bir düşüş tespit
edilmiştir. Sonuç olarak; pediyosin PA-1’de
bulunan metiyonin aminoasitinin hidrofobik diğer
rezidülerle değiştirilmesi bu bakteriyosinin gıdalara
eklenmesine olanak sağlayan önemli bir basamak
olarak rapor edilmiştir. Benzer kararlılık
yaklaşımları diğer birçok bakteriyosin için de
değerlendirilmiştir.
Kompozisyonları
gereği,
bakteriyosinlerin mide-bağırsak yolunda proteolitik
kesimi, mide-bağırsak enfeksiyonlarının kontrolü
amacıyla kullanılacak bakteriyosin yaklaşımlarında
önemli bir engel teşkil etmektedir. Bundan dolayı
salivarisin P gibi bakteriyosinlerde tripsin tanıma
bölgeleri genetik modifikasyon uygulamaları
neticesinde
değiştirilmiştir.
Gerçekleştirilen
modifikasyonlar aktivite üzerinde herhangi bir
değişikliğe neden olmamıştır (O’Sea ve ark., 2010).
Bununla beraber d aminoasitler, kimyasal olarak
sentezlenen peptitlerin proteolitik kesimlere daha
az duyarlı hale gelmelerini sağlamaktadır. Farklı bir
yaklaşım olarak Grup IIb bakteriyosinlerine dahil
olan laktokoksin G’nin N ve C terminal bölge
rezidülerinin d aminoasitleri ile yer değiştirmesi
aktivitede herhangi bir değişikliğe neden
olmaksızın ekzopeptidazlara karşı olan duyarlılığı
önemli ölçüde azaltmıştır (Oppegard ve ark., 2010).
Ancak, d aminoasitlerin kullanımının bazı
sınırlamaları
bulunmaktadır.
Örneğin,
lökosin A’nın d aminoasitleri içeren
enantiyomeri
sentezlettirilmiş
fakat
aktivitede tamamen kayıp gözlenmiştir (Yan
ve
ark.,
2000).
Bu
sonucun
mannozfosfotransferaz ile bakteriyosin
arasındaki
etkileşimden
kaynaklanmış
olabileceği belirtilmiştir.
Hibrit bakteriyosinler
Hedef bölgelere yönelik yeni antibiyotik
buluşlarını içeren çalışmalar geçmişten
bugüne birçok araştırmacının amacı
olmuştur. Özellikle patojenik ajanlara karşı
kullanılan antibiyotiklere karşı dirençlilik
özelliğinin
oluşabilme
riski,
hibrit
antibiyotiklerin
geliştirilme
fikrinin
oluşmasına neden olmuştur (Acuna ve ark.,
2011). Aynı molekül içerisinde iki farklı etki
mekanizmasının birleştirilmesi neticesinde
oluşturulabilecek hibrit antibiyotikler ile,
sorun yaratan patojen mikroorganizmanın
gelişiminin engellenebileceği düşünülmüştür
(Arnusch ve ark., 2008; Hamiltone-Miller,
1994). Bu temelden yola çıkılarak,
günümüzde
ribozomal
sentezli
antimikrobiyal peptitlerin birleştirilmesi
neticesinde hibrit antimikrobiyal maddeler
oluşturulabilmektedir. Hibrit yaklaşımı,
bakteriyosinlerin hedef patojen türlere karşı
aktivite spektrumunu genişletmek amacıyla
kullanılan başarılı bir modifikasyon tekniği
olmuştur (Makrides, 1996). Pediyosin PA-1,
sakasin P, kurvasin A ve lökosin A gibi
pediyosin benzeri bakteriyosinler benzer
birincil yapılarına rağmen, çeşitli bakterilere
karşı
farklı
antimikrobiyal
etki
sergilemektedirler (Fimland ve ark., 1996).
Hibrit yaklaşım kullanılarak, peptit sentezi
neticesinde biyolojik olarak aktif 4 yeni
hibrit
bakteriyosin
oluşturulmuş
ve
tamamında
antimikrobiyal
aktivite
gözlemlenebilmiştir. C terminal bölgesinin
alındığı hibrit bakteriyosinler farklı bakteri
suşlarına
karşı
benzer
duyarlılık
sergilemişlerdir. N terminal bölgesinin
alındığı hibrit bakteriyosinlerde ise aktivite
spektrumu tamamen farklı bulunmuştur.
Gerçekleştirilen bu çalışma pediyosin
benzeri bakteriyosinlerin N terminal
6 Fadime KIRAN et al.
bölgesinin hedef hücre özgüllüğünde oldukça
önemli olduğunu göstermiştir. Pediyosin PA-1’in
geliştirilmiş bir hibrit çeşidi ise, pediyosinin C
terminal bölgesinin bir kısmının enterosin A’nın N
terminal bölgesinin yarısı ile füzyonu sonucunda
oluşturulmuştur. Elde edilen bu varyantın aktivitesi
özellikle gıdalarda bozulmalara neden olan
Leuconostoc lactis suşuna karşı oldukça artmıştır
(Tominaga ve Hatakeyama, 2007). Bununla beraber
pediyosin PA-1’in N terminal bölgesinde 4 özgül
bölgenin Grup IIa’ya dahil diğer 10 bakteriyosin
dizisi ile karıştırılması sonucunda oluşturulan
hibritleri içeren DNA-karma kütüphaneleri, doğal
molekülden daha yüksek aktiviteye sahip
mutantların elde edilmesine neden olmuştur. Bazı
hibrit bakteriyosinlerin özellikle süt ürünlerinde
bozulmalara neden olan bakterilerin gelişimini
engellediği tespit edilmiştir (Tominaga ve
Hatakeyama, 2007).
İlerleyen çalışmalar, bakteriyosinlerin aktivite
spektrumlarına Gram-negatif bakterileri dahil
edebilmek üzerine odaklanmıştır. Bakteriyosinlerin
çoğu sadece Gram-pozitif bakterilere karşı etki
göstermekte, gıdalarda önemli patojenlerden olan
Salmonella spp. ve E. coli suşlarına karşı etki
gösterememektedir. Bakteriyosinlerin bu dar
spektrumlu antimikrobiyal etkileri gerek gıdalarda
koruyucu olarak kullanılabilmeleri, gerekse klinik
alanda ilaç uygulamalarına dahil edilebilmeleri için
önemli bir engel oluşturmaktadır. Hibrit
çalışmalarının temeli ise; belirtilen dar aktivite
spektrumu genişleterek bakteriyosinlerin Gramnegatif bakteriler üzerine de etki göstermelerini
sağlamaktır. Escherichia coli tarafından üretilen
mikrosin V, Gram-negatif bakteriler üzerinde etkili
olabilen antimikrobiyal bir peptittir. Gram-negatif
bakteriler üzerinde etkili olması hedef bölgede
özgül reseptörlerin bulunması ile açıklanmıştır.
Mikrosinin
yapısal
özelliklerini
ve
etki
mekanizmasını bilmek geniş antimikrobiyal
aktiviteye sahip hibrit bakteriyosinlerin elde
edilmesini mümkün kılmaktadır (Acuna ve ark.,
2011). Gram-negatif bakteriler üzerinde etkili olan
mikrosin ile Gram-pozitif bakteriler üzerinde etkili
olan Grup IIa bakteriyosinlerinin füzyonu
neticesinde tasarlanan hibrit bakteriyosinler, geniş
antimikrobiyal spektruma sahip yüksek özgüllükte
yeni bakteriyosinlerin elde edilmesini mümkün
kılabilmektedir. Özellikle pediyosin benzeri
bakteriyosinlerde peptitin C sonlanma bölgesinin
Gram-pozitif bakterilere karşı etkinliği belirlediği
bildirilmiştir (Johnsen ve ark., 2005).
Merkezden C sonlanma bölgesine uzanan
15-merlik peptitin ise biyolojik aktiviteyi
engellediği tespit edilmiştir. Bu 15’merlik
bölgenin enterosin CRL35’den çıkarılması
antimikrobiyal aktivitede bir artış meydana
getirmiştir (Saavedra ve ark., 2004; Salvucci
ve ark., 2007). Bu bilgiler ışığında,
pediyosin benzeri enterosin CRL35 ile
mikrosin V kullanılarak Ent35-MccV isimli
yeni bir rekombinant hibrit peptit
tasarlanmış ve gen ifadesi başarıyla
sağlanmıştır.
Oluşturulan
bu
hibrit
bakteriyosin özellikle E. coli O157:H7
klinik izolatları üzerinde antimikrobiyal
aktivite sergilemiştir. Başarıyla sonuçlanan
bu hibrit bakteriyosin çalışmasının en
önemli yanı ise, bakteriyosinlerin füzyonunu
takiben her ikisinin de sorumlu olduğu
antimikrobiyal aktiviteyi koruyabilmesi ve
sahip oldukları bağışıklık geninden dolayı
birbirlerinden etkilenmemeleridir (Acuna ve
ark., 2011). Klinik odaklı farklı bir çalışma
ise türe özgü bir antibiyotik geliştirmek
yerine, E. coli’nin üretmiş olduğu kolisin Ia
ve dirençliliği kodlayan gen kümelerinin, S.
aureus’un feromon (agrD) kodlayan genleri
ile füzyonunu içermektedir (Mayville ve
ark., 1999, Ji ve ark., 1995). Elde edilen
feromonisin S. aureus membran reseptörü
üzerinde özgül aktivite göstermiş ve
kolisinin fonksiyonu gereği hedef bölgede
por oluşumuna neden olmuştur. Fare
denemelerinde, füzyon neticesinde elde
edilen modifiye feromonisin’in patojen S.
aureus
inhibisyonunda
penisilin
antibiyotiğine göre daha etkili olduğu
belirlenmiştir (Qui ve ark., 2003). Rapor
edilen bu başarılı sonuçlar, tasarlanan hibrit
bakteriyosinin
özellikle
farmasötik
endüstrisinde önemli uygulamalara dahil
edilebileceğini göstermektedir (Acuna ve
ark., 2012).
Hibrit yaklaşımı, bakteriyosinlerin geniş
çevresel koşullarda kararlılıklarını artırmak
amacıyla da kullanılmıştır. Xanthomonas
campestris tarafından üretilen glisinisin A
özellikle narenciyelerde yaprak leke
hastalıklara neden olan Xanthomonas
türlerine karşı etkili bir bakteriyosindir (Heu
ve ark., 2001). Glisinisin alt ünitelerini
GM bakteriyosinler 7
kodlayan iki genin füzyonu sonucunda oluşturulan
hibrit protein doğal suşun aktivitesini korumuş,
yüksek ve düşük pH ve sıcaklıklarda kararlılık
artışına neden olmuştur (Kim ve ark., 2001).
Tartışma ve Sonuç
Bakteriyosinlerin biyolojik koruyucu olarak
kullanılabilirliğini içeren araştırma sonuçları her ne
kadar dikkat çekici ve umut vaat edici olsa da ticari
bakteriyosin
preparatlarının
hazırlanmasında
gerekli olan finansal destek endüstriyel yaklaşımda
önemli derecede yer alamamaktadır. Bunun en
önemli nedenleri ise düşük üretim, kararlı olmayan
ürün eldesi, pahalı aşamalara bağlı maliyet artışı ve
mevzuattan/yasalardan
kaynaklanabilen
sorunlardır. Bununla beraber kararsız ürün eldesi ve
maliyetle ilgili sorunların, genetik mühendisliği
yaklaşımlarının kullanımı neticesinde uygun
biyolojik aşamaların tasarlanması ile aşılabileceği
düşünülmüştür. Günümüze kadar gerçekleştirilen
genetik modifikasyon çalışmaları bakteriyosinlerin
aktivitelerinin ve kararlılıklarının artırılması
üzerine odaklanmıştır. Buna ilave çalışmalar ise
Gram-negatif bakteriler üzerine olan antimikrobiyal
spektrumu genişletmeyi amaçlamaktadır.
Biyomühendislik
temelli
yaklaşımlar
günümüzde yeni antimikrobiyal maddelerin
oluşturulması amacıyla geliştirilmektedir. Ancak bu
durum pazarlama açısından değerlendirildiğinde,
özellikle yeni ürünlerin genetik mühendisliği ile
yapılıyor olması tüketici endişesi yaratabilmekte ve
olumsuz sonuçlara neden olabilmektedir. Genetiği
modifiye bakteriyosinlerin gıda koruyucusu olarak
kullanımları özellikle Avrupa Birliği üyesi
ülkelerde önemli bir engel teşkil etmektedir. Bu
noktada, GRAS (genel olarak güvenilir-zararsız
kabul edilen) olarak kabul edilen bakteriyosin
üreticisi suşlarda gerçekleştirilecek her hangi bir
modifikasyonun, genetiği modifiye edilmiş
organizma
(GMO)
başlığı
altında
kabul
edilemeyeceğini savunan bir grup vardır. Özellikle
Sybesma ve arkadaşları (2006) patojen olmayan bir
mikroorganizmadaki
bireysel
klonlamanın
organizma tarafından muhafaza edildiği sürece
GMO olarak kabul edilemeyeceğini bildirmişlerdir
(Yönerge; 90/219/EC). 98/81/EC yönergesine göre,
“bireysel klonlama” organizmadan ya da hücreden
nükleik asitin uzaklaştırılması, ardından bu nükleik
asitin tamamının ya da bir kısmının enzimatik,
kimyasal ya da mekanik aşamalar kullanılarak
filogenetik olarak yakın ilişkili bir suşa veya benzer
bir hücre tipine ya da hattına yeniden
eklenerek genetik materyalinin doğal olarak
değiştirilmesi işlemidir. Bundan dolayı
bakteriyosinlerde gerçekleştirilen genetik
modifikasyonlar henüz GMO olarak
düzenlenmiş değildir (Cotter, 2012).
Genetik mühendisliği teknolojileri doğal
gıda koruyucularının kaynağını oluşturmak
için önemli bir potansiyele sahip olsalar da,
tüketicilerin bu teknolojilere karşı gelmesi
ve kısıtlayıcı mevzuatlar gelecekte genetik
mühendisliği yaklaşımlarının geliştirilmesini
ve
uygulanmasını
şüphesiz
ki
sınırlayacaktır.
Bakteriyosinlerin antibiyotiklere karşı
alternatif
doğal
koruyucular
olarak
kullanılma fikrini sınırlayan bir diğer önemli
faktör ise hassas suşların zamanla
bakteriyosinlere
karşı
dirençlilik
kazanabilme olasılığıdır. Bakteriyosinlere
karşı bakteriyel direnç oluşumu doğada
yaygın olarak gözlemlenmemektedir (Katla
ve ark., 2003). Ancak laboratuvar
koşullarında
yüksek
frekansa
sahip
olabileceği rapor edilmiştir (Casaus ve ark.,
1993; Rekhif ve ark., 1994). Bakteriyosin
dirençliliğine birden fazla etken neden
olabilmektedir. Özellikle Grup IIa’ya dahil
olan bakteriyosinler için hedef mannoz
fosfotransferaz sistemidir. Bakteriyosine
özel bu hedefi içermeyen mutantlar mpt
operonunun gen ifadesinin azaltılması
neticesinde oluşturulduğunda, bakteriyosine
karşı
dirençli
fenotip
sergiledikleri
belirlenmiştir (Diep ve ark., 2007; Gravesen
ve ark., 2002). Hücre zarında ve yağ asit
kompozisyonundaki değişiklikler ile bazı
metabolik düzenlemeler de bakteriyosinlere
dirençlilik kazandıran nedenler arasında
gösterilmektedir (Naghmouchi ve ark.,
2007;
Vadyvaloo
ve
ark.,
2002).
Dirençliliğin oluşabilme riski, bakteriyosin
uygulamalarının
kullanışlı
olarak
değerlendirilebilmesi
için
oldukça
önemlidir. Ancak bu konu ile ilgili kesin
bilgiler bulunmamakla beraber araştırmalar
halen devam etmektedir.
Tüm
bu
sınırlamalara
rağmen,
gerçekleştirilen son çalışmalar bakterilerin
güçlü
antimikrobiyal
etkiye
sahip
bakteriyosinler
ürettiklerini
ve
bu
8 Fadime KIRAN et al.
moleküllerin özellikle klinik, gıda ve tarımsal
içerikli uygulamalarda yeni nesil antibiyotikler
olarak kullanılabileceğini ortaya koymaktadır.
Genetiği modifiye edilmiş bakteriyosinleri içeren
araştırmaların gıda güvenliğini ve kalitesini
artırmak amacıyla artan bir ivme kazanacağı
tartışmasız bir gerçektir. Gıda endüstrisinde,
özellikle genetik modifikasyon yaklaşımları
neticesinde oluşturulan çeşitli nisin varyantlarının
hızlı bir şekilde kabul göreceği ve diğer
bakteriyosinler için önemli bir örnek teşkil edeceği
düşünülmektedir.
Kaynaklar
Acuna L, Morero RD and Bellomio O.
Development
of
wide-spectrum
hybrid
bacteriocins for food biopreservation. Food
Bioprocess Techno. 4: 1029-1049, 2011.
Acuna L, Picariello G, Sesma F, Morero RD and
Bellomio O. A new hybrid bacteriocin, Ent35–
MccV, displays antimicrobial activity against
pathogenic Gram-positive and Gram-negative
bacteria. FEBS Open Bio. 2: 12-19, 2012.
Arnusch CJ, Bonvin AMJJ, Verel AM, Jansen
WTM, Liskamp RMJ, de Kruijff B, et al. The
vancomycinnisin(1-12) hybrid restores activity
against vancomycin resistant Enterococci.
Biochemistry. 47: 12661-12663, 2008.
Breukink E and de Kruijff B. The lantibiotic nisin,
a special case or not? Biochim Biophys Acta.
1462: 223-234, 1999.
Casaus P, Nilsen T, Cintas LM, Nes IF, Hernandez
PE and Holo H. Enterocin B, a new bacteriocin
from Enterococcus faecium T136 which can act
synergistically with enterocin A. Microbiology.
143(7): 2287-2294, 1997.
Citron DM, Tyrrell KL, Merriam CV and Goldstein
EJ. Comparative in vitro activities of LFF571
against Clostridium difficile and 630 other
intestinal strains of aerobic and anaerobic
bacteria. Antimicrob Agents Chemother. 56:
2493-2503, 2012.
Cotter PD. Bioengineering: A bacteriocin
perspective. Bioengineered. 3 (6): 313-319,
2012.
Delves-Broughton J, Blackburn P, Evans RJ and
Hugenholtz J. Applications of the bacteriocin,
nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69:
193-202, 1996.
Derksen DJ, Stymiest JL and Vederas JC.
Antimicrobial leucocin analogues with a
disulfide bridge replaced by a carbocycle
or by noncovalent interactions of allyl
glycine residues. J Am Chem Soc. 128
(44): 14252-14253, 2006.
Derksen DJ, Boudreau MA and Vederas JC.
Hydrophobic interactions as substitutes
for a conserved disulfide linkage in the
type IIa bacteriocins, leucocin A and
pediocin PA-1. Chem Bio Chem. 9 (12):
1898-1901, 2008.
Diep DB, Skaugen M, Salehian Z, Holo H
and Nes IF. Common mechanisms of
target cell recognition and immunity for
class II bacteriocins. Proc Natl Acad Sci.
104(7): 2384-2389, 2007.
Dodd HM, Horn N and Gasson MJ. A
cassette vector for protein engineering
the lantibiotic nisin. Gene. 162:163-164,
1995.
DuPont AW and DuPont HL. The intestinal
microbiota and chronic disorders of the
gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8:
523-531, 2011.
Field D, Connor PM, Cotter PD, Hill C and
Ross RP. The generation of nisin
variants with enhanced activity against
specific gram-positive pathogens. Mol
Microbiol. 69: 218-230, 2008.
Fimland G, Blingsmo OR, Sletten K, Jung
G, Nes IF and Nissen-Meyer J. New
biologically active hybrid bacteriocins
constructed by combining regions from
various pediocin-like bacteriocins: the Cterminal region is important for
determining specicity. Appl Environ
Microbiol. 62: 3313-3318, 1996.
Fimland G, Johnsen L, Axelsson L, et al. A
C-terminal disulfide bridge in pediocinlike bacteriocins renders bacteriocin
activity less temperature dependent and
is a major determinant of the
antimicrobial spectrum. J Bacteriol. 182
(9): 2643-2648, 2000.
GM bakteriyosinler 9
Fleury Y, Dayem MA, Montagne JJ, et al. Covalent
structure, synthesis, and structure-function
studies of mesentericin Y 105(37), a defensive
peptide
from
gram-positive
bacteria
Leuconostoc mesenteroides. J Biol Chem. 271
(24): 14421-14429, 1996.
Gillor O, Nigro LM and Riley MA. Genetically
engineered bacteriocins and their potential as
the next generation of antimicrobials. Curr
Pharm Des. 11: 1067-1075, 2005.
Gravesen A, Ramnath M, Rechinger KB, Andersen
N, Jansch L, Hechard Y, Hastings JW and
Knochel S. High-level resistance to class IIa
bacteriocins is associated with one general
mechanism
in
Listeria
monocytogenes.
Microbiology. 148: 2361-2369, 2002.
Hamilton-Miller JM. Dual-action antibiotic
hybrids. J Antimicrob Chemother. 33: 197-200,
1994.
Heu S, Oh J, Kang Y, Ryu S, Cho SK, Cho Y and
Cho M. Gly gene cloning and expression and
purification of glycinecin A, a bacteriocin
produced by Xanthomonas campestris pv.
glycines. Appl Environ Microbiol. 67: 41054110, 2001.
Kim Y, Cho SK and Cho M. Improvement
in the stability of glycinecin A through
protein fusion of the two structural
components. J Microbiol. 39: 177-180,
2001.
Kiran F and Osmanagaoglu O. General
characteristics and current classification
of Gram-positive bacteriocins. Academic
Food J. 10 (4): 91-101, 2012.
Kuipers OP, Rollema HS, Yap WM, Boot
HJ, Siezen RJ and de Vos WM.
Engineering dehydrated amino acid
residues in the antimicrobial peptide
nisin. J Biol Chem. 267: 24340-24346,
1992.
Levengood MR, Knerr PJ, Oman T J and
van der Donk WA. In vitro
mutasynthesis of lantibiotic analogues
containing nonproteinogenic amino
acids. J Am Chem Soc. 131: 1202412025, 2009.
Liu W and Hansen JN. Enhancement of the
chemical and antimicrobial properties of
subtilin by sitedirected mutagenesis. J
Biol Chem. 267: 25078-25085, 1992.
Ji G, Beavis RC and Novick RP. Cell density
control of staphylococcal virulence mediated by
an octapeptide pheromone. Proc Natl Acad Sci.
92: 12055-12059, 1995.
Lohans CT and Vederas JC. Development of
class IIa bacteriocins as therapeutic
Agents.
Int
J
Microbiol.
doi:10.1155/2012/386410, 2012.
Johnsen L, Fimland G and Nissen-Meyer J. The Cterminal domain of pediocin-like antimicrobial
peptides (class IIa bacteriocins) is involved in
specific recognition of the C-terminal part of
cognate immunity proteins andin determining
the antimicrobial spectrum. J Biol Chem. 280:
9243-9250, 2005.
Makrides SC. Strategies for achieving highlevel expression of genes in Escherichia
coli. Microbiol Rev. 60: 512-538, 1996.
Katla T, Naterstad K, Vancanneyt M, Swings J and
Axelsson L. Differences in susceptibility of
Listeria monocytogenes strains to Sakacin P,
Sakacin A, Pediocin PA-1, and Nisin. Appl
Environ Microbiol. 69(8): 4431-4437, 2003.
Kazazic M, Nissen-Meyer J and Fimland G.
Mutational analysis of the role of charged
residues in target-cell binding, potency and
specificity of the pediocin-like bacteriocin
sakacin P. Microbiology. 148 (7): 2019-2027,
2002.
Mayville PGJ, Beavis R, Yang H, Goger M,
Novick RP and Muir TW. Structureactivity
analysis
of
synthetic
autoinducing thiolactone peptides from
Staphylococcus aureus responsible for
virulence. Proc Natl Acad Sci. 96: 12181223, 1999.
Miller KW, Schamber R, Chen Y and Ray
B. Production of active chimeric
pediocin AcH in Escherichia coli in the
absence of processing and secretion
genes from the Pediococcus pap operon.
Appl Environ Microbiol. 64: 14-20,
1998.
10 Fadime KIRAN et al.
Mills S, Stanton C, Hill C and Ross RP. New
developments and applications of bacteriocins
and peptides in foods. Annu Rev Food Sci
Technol. 2: 299-329, 2011.
Naghmouchi K, Kheadr E, Lacroix C and Fliss I.
Class I/Class IIa bacteriocin cross-resistance
phenomenon in Listeria monocytogenes. Food
Microbiol. 24(7-8):718-727, 2007.
O’Shea EF, O’Connor PM, Cotter PD, Ross R and
Hill C. Synthesis of trypsin-resistant variants of
the bacteriocin salivaricin P. App Environ
Microbiol. 76 (16): 5356-5362, 2010.
Oppegard C, Rogne P, Kristiansen PE and NissenMeyer J. Structure analysis of the two-peptide
bacteriocin lactococcin G by introducing Damino acid residues. Microbiology, 156 (6):
1883-1889, 2010.
Pag U and Sahl HG. Multiple activities in
lantibiotics-models for the design of novel
antibiotics? Curr Pharm Des. 8: 815-833, 2002.
Qiu XQ, Wang H, Lu XF, Zhang J, Li SF, Cheng
G, et al. An engineered multidomain
bactericidal peptide as a model for targeted
antibiotics against specific bacteria. Nat
Biotechnol. 21: 1480-1485, 2003.
Rea MC, Ross RP, Cotter PD and Hill C.
Classification of bacteriocins from Grampositive bacteria. In Prokaryotic antimicrobial
peptides from genes to applications, Edited by
D. Drider, S. Rebuffat, Springer, USA, 29-53,
2011.
Rekhif N, Atrih A and Lefebvre G. Selection and
properties of spontaneous mutants of Listeria
monocytogenes ATCC-15313 resistant to
different bacteriocin produced by lactic acid
bacteria strains. Curr Microbiol. 28(4): 237241, 1994.
Rink R, Wierenga J, Kuipers A, Kluskens LD,
Driessen AJ, et al. Dissection and modulation of
the four distinct activities of nisin by
mutagenesis of rings A and B and by C-terminal
truncation. Appl Environ Microbiol. 73: 58095816, 2007.
Rodriguez JM, Martinez MI, Horn N and Dodd
HM. Heterologous production of bacteriocins
by lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol.
80: 101-116, 2003.
Rollema HS, Kuipers OP, Both P, de Vos
WM and Siezen RJ. Improvement of
solubility
and
stability
of
the
antimicrobial peptide nisin by protein
engineering. Appl Environ Microbiol.
61: 2873-2878, 1995.
Ross AC, McKinnie SM and Vederas JC.
The synthesis of active and stable
diaminopimelate analogues of the
lantibiotic peptide lactocin S. J Am
Chem Soc. 134: 2008-2011, 2012.
Saavedra L, Minahk C, de Ruiz Holgado AP
and Sesma F. Enhancement of the
enterocin CRL35 activity by a synthetic
peptide derived from the NH2-terminal
sequence.
Antimicrob
Agents
Chemother. 48: 2778-2781, 2004.
Salvucci E, Saavedra L and Sesma F. Short
peptides derived from the NH2-terminus
of subclass IIa bacteriocin enterocin
CRL35 show antimicrobial activity. J
Antimicrob Chemother. 59: 1102-1108,
2007.
Sybesma W, Hugenholtz J, de Vos WM and
Smid EJ. Safe use of genetically
modified lactic acid bacteria in food.
Bridging the gap between consumers,
gren groups, and industry. Electron J
Biotechnol. 9: 1-25, 2006.
Tagg JR, Dajani AS and Wannamaker LW.
Bacteriocins of Gram-positive bacteria.
Bacteriol Rev. 40: 722-756, 1976.
Tominaga T and Hatakeyama Y.
Determination of essential and variable
residues in pediocin PA-1 by NNK
scanning. Appl Environ Microbiol. 72
(2): 1141-1147, 2006.
Tominaga T and Hatakeyama Y.
Development of innovative pediocin PA1 by DNA shuffling among class IIa
bacteriocins. Appl Environ Microbiol. 73
(16): 5292-5299, 2007.
Vadyvaloo V, Hastings JW, van der Merwe
MJ and Rautenbach M. Membranes of
class IIa bacteriocin-resistant Listeria
monocytogenes cells contain increased
levels of desaturated and short-acyl-
GM bakteriyosinler 11
chain phosphatidylglycerols. Appl
Microbiol. 68(11): 5223-5230, 2002.
Environ
Wang Y, Henz ME, Fregeau Gallagher NL, Chai S,
Gibbs AC, Yan LZ, Stiles ME, Wishart DS and
Vederas
JC.
Solution
structure
of
carnobacteriocin B2 and implications for
structure-activity relationships among type IIa
bacteriocins from lactic acid bacteria.
Biochemistry. 38: 15438-15447, 1999.
Wiedemann I, Breukink E, van Kraaij C, Kuipers
OP, Bierbaum G, de Kruijff B, et al. Specific
binding of nisin to the peptidoglycan precursor
lipid II combines pore formation and inhibition
of cell wall biosynthesis for potent antibiotic
activity. J Biol Chem. 276: 1772-1792, 2001.
Yan LZ, Gibbs AC, Stiles ME, Wishart DS and
Vederas JC. Analogues of bacteriocins:
antimicrobial specificity and interactions
of leucocin a with its enantiomer,
carnobacteriocin B2, and truncated
derivatives. J Med Chem. 43 (24): 45794581, 2000.
Yuan J, Zhang ZZ, Chen XZ, Yang W and
Huan LD. Sitedirected mutagenesis of
the hinge region of nisin Z and
properties of nisin Z mutants. Appl
Microbiol Biotechnol. 64: 806-815,
2004.
Zouhir A, Hammami R, Fliss I and Hamida
JB. A new structure-based classification
of Grampositive bacteriocins. Protein
Journal. 29: 432-439, 2010.