Parazitolojik Tanıda Antijen Testleri

Parazitolojik Tanıda Antijen Testleri
(E. hystolitica, Giardia, Cryptosporidium)
(Uz. Dr. Yavuz UYAR)
Parazit hastalıklarının etkenleri direkt olarak görülemediği veya görülmesi zor olduğu
durumlarda bu hastalıkların tanısının yapılabilmesi için daha çok serolojik tanı yöntemlerine ihtiyaç
duyulmaktadır. İnsan barsak protozoonlarının tanısında gaita, duodenal sıvı veya barsak biyopsi
örneklerinin mikroskobik incelemesi kullanılmaktadır. Mikroskobik inceleme deneyimli mikroskopist ve
yoğun laboratuar çalışması gerektirmektedir. Alternatif olarak direkt floresan antikor (DFA), enzim
immunassay (EIA) ve hızlı, tanı benzeri testleri gibi
“antijen tarama testleri” geliştirilmiş ve
kullanılmaktadır. Antijen saptama yöntemleri hızlı sonuç verebilir ve deneyimli ve yetenekli bir
mikrobiyoloji uzmanına gereksinim duyulmaz. Halen barsak parazitlerinden Cryptosporidium spp.,
Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis ve Trichomonas vaginalis’i saptayabilen antijen tarama
testlerinin reagenleri ticari olarak sağlanabilmektedir. Ayrıca Plasmodium ve Wuchereria bancrofti için
kan ve serum örnekleri kullanılarak antijen saptama testleri de bulunmaktadır (1,2,3).
Gaitada parazit antijeni tarama için kullanılan uygun hasta örnekleri
Taze veya prezerve gaita örnekleri birçok kit için antijen saptamada uygun örneklerdir. Fakat
her özgün kit kendine ait kit içeriğinde örnek toplama prosedürünü tavsiye etmektedir.
Amebiasis, Cryptosporoidosis ve Giardiasis epidemiyoloji ve bulaşma yolları ile ve bu
parazitlerin tanısında kullanılan antijen tanı testleri ilgili bilgiler başlıklar altında aşağıda verilmiştir.
I. AMEBIASIS
Dünyada her yıl 50 milyon insanın amebiasis’e yakalanmakta, bunların sadece %10’u
semptomatik seyretmekte ve 100 bin kadarı ölmektedir (4,5). Amebiasis gelişmekte olan ülkeler için
halen önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. İnsanlar, Entamoeba’nın amibik kolit ve
karaciğer absesine neden olan infektif E.histolytica ve nonpatojen E.dispar olmak üzere morfolojik
olarak ayırt edilemeyen iki türü tarafından enfekte olmaktadır. Ne yazık ki E. histolytica ve E.dispar
ayırımının yapılması dışkının mikroskobik incelenmesi ile mümkün olamamaktadır (6).
E. histolytica; ortalama 25 mikron büyüklüğünde trofozoid ve ortalama 12 mikron büyüklüğünde
kist formu bulunan bir protozoondur. Trofozoid şekli hareketlidir ve psödopotlar çıkartarak yer
değiştirir. E. histolytica ile infekte olan kişiler kist ve trofozoidleri dışkıları ile etrafa yayarlar.
Trofozoidler dış ortamda 15-20 dk içinde ölürler fakat kistler haftalarca canlı kalırlar ve oral yoldan
diğer insanlara bulaşarak infeksiyonu devam ettirirler. Özellikle infekte sular ve bu sularla yıkanmış
olan sebze ve meyvelerin çiğ olarak yenmesiyle bulaşmalar gerçekleşir. Trofozoidler hiçbir şekilde
bulaştırıcı değillerdir. Kistler oral yoldan alındıktan sonra ince barsakta açılırlar ve “metakistler” ortaya
çıkar. Metakistlerin bölünmesiyle “metakistik trofozoidler” oluşur. Bunların gelişmesiyle de “trofozoidler”
oluşur. Trofozoidler anüse yaklaştıkça kistler oluşur ve kistler dışkı ile atılırlar. İnfekte olan kişilerin
%90’ında tablo asemptomatik seyreder. Bu kişiler asemptomatik olarak aylarca dışkı ile kist
çıkardıklarından, infeksiyonun yayılmasında çok önemli rol oynarlar (5,7).
E.histolytica ve E.dispar için en güvenli ayırt edici tanı spesifik antijenlerin değişik yöntemlerle
gösterilmesidir. Günümüzde ayrım için dışkıda spesifik antijen arama yöntemleri spesifite ve sensitivite
yönünden oldukça kabul görmektedir. Mikroskobik inceleme, E.dispar ve E.histolytica ayırımı
yapmadığı gibi fekal lökosit, makrofaj ve diğer amiplerle ayırımının zor olması nedeniyle yanlış pozitif
sonuçların verilmesine yol açmaktadır. WHO, 1997 yılında E.histolytica ve E.dispar’ın morfolojik olarak
benzer olduğu ve bu nedenle ışık mikroskobu ile ayırımının imkânsız olduğunu bildirmiştir. Bunların
E.histolytica/E.dispar olarak rapor edilmeleri ve asemptomatik vakaların tedavi edilmemeleri ve ancak
kesin E.histolytica tanısı konulan vakaların tedavi edilmeleri gerektiğini bildirmiştir (4,5,7,8).
Günümüzde antijen bazlı spesifik E.histolytica EIA kitleri iki adettir. E.histolytica’nın Gal/Gal-NAc
spesifik bölgesine karşı monoklonal antikorlar kullanan (E.histolytica II; TechLab, Blacksburg, Va.) ve
E.histolytica’nın serin bağlayan antijenine karşı monoklonal antikorlar kullanan (Optimum S kit; Merlin
Diagnostika, Bornheim-Hersel, Germany) kitlerdir. (5). Diğer antijen tarama testlerinde non-patojen
olan E.dispar’a karşı çapraz reaksiyon görülebilmektedir. Bu gerçekten problemdir, çünkü E.dispar
enfeksiyonunun E.histolytica’dan 3-10 kez daha yaygın olduğu bilinmektedir (7).
E.histolytica’nın dışkıda tespiti için izoenzim analizi, antijen aranması, spesifik DNA probu ile
hibridizasyon ve PCR gibi spesifik testler mevcuttur (8).
İntestinal amebiazis’in tanısı için gaita antijenlerinin saptanması için ticari olarak elde edilebilir
EIA kitleri mevcuttur. Patojenik E.histolytica ve nonpatojenik Entomoeba dispar organizmalarının her
ikisi morfolojik olarak idantiktir. Bu yöntemler, patojenik E.histolytica’daki “galaktoz-adhesin” proteinini
saptayabilen monoklonal antikorlar ile saptanabilir. Bu saptama yönteminde birincil engel, taze ve
prezerve olmayan gaita örneğine ihtiyaç duyulmasıdır. Dünyada E. histolytica/E.dispar group’un
antijen saptama testleri yaygındır (1,5).
a. EIA (Enzim İmmunassay): Özellikle barsak dışı amebiazisin tanısında IFAT gibi tanı değeri
yüksektir. Çok iyi bir şekilde saflaştırılmış bir antijen kullanıldığında serumda EIA ile araştırılan antikor
seviyesinin IFAT sonuçlarına yakın benzer sonuçlar verdiği bildirilmektedir. Gaitada E.histolytica
antijenini tespit etmek için uygulanan EIA’nın duyarlılığı %87, özgüllüğü %100, invaziv amipli dizanteri
vakasında gaitada antijenin tespiti için EIA uygulandığında %100 duyarlılık bulunduğu bildirilmektedir
(2).
E. histolytica EIA testi, gaita örneklerinde E. histolytica adezininin tespiti amacı ile kullanılır.
Kullanılan ELISA tekniğinde gaita örneği, örnek sulandırım sıvısı ile emulsifiye edilir. Bu muameleden
geçirilmiş gaita örneği sulandırımı ve adezin spesifik monoklonal antikor içeren konjugat,
mikropleytlerin E. histolytica adezinine bağlanan poliklonal antikorlar yapıştırılmış kuyucuklarına
aktarılır. Şayet hasta örneğinde adezin varsa, inkübasyon sırasında kuyucuklardaki poliklonal
antikorlara ve konjugatta bulunan adezin spesifik monoklonal antikorlara bağlanır. Oluşan spesifik
olmayan bağlanmalar yıkama sırasında ortamdan uzaklaştırılır. Substratın ilavesi ile, adezin varlığında
oluşan enzim-antikor-antijen kompleksine bağlı renk oluşumu tespit edilir.
b.E.histolytica tanısı için kullanılan antijen testleri ile ilgili çalışmalar:
Zeyrek ve ark (9) 1600 gaita örneğinden 583’ünde nativ-lugol ve çoklaştırma yöntemi ile
mikroskobide bir veya daha fazla parazit saptamışlardır. Nativ-lugolde şüpheli bulunan 87 gaita örneği
E.histolytica/E.dispar için EIA (Ridascreen Entamoeba, R-Biopharm AG, Germany) yöntemi ile
incelenmiş ve 19 (%21.7)’unda spesifik antijen saptanmıştır. Bu sonuçların ışığında objektif
değerlendirmeyi sağlayan, ucuz, basit, herhangi bir donanım ve deneyim gerektirmeyen antijen
saptama temeline dayalı EIA testinin rutin mikroskopi ile birlikte kullanılmasının doğru olacağını
belirtişlerdir.
Schunk ve ark (10) referans olarak alınan konvansiyonel mikroskopi ile değerlendirilmiş 276
gaita örneğini EIA (Ridascreen, Giardia and Entamoeba, R-Biopharm,Germany) ile E.histolytica ve
G.intestinalis yönünden incelemişleridir. Giardia için duyarlılığı %100, özgüllüğü %99.6, E.histolytica
için duyarlılığı % 81.8 ve özgüllüğü %99.2 saptamışlardır.EIA yönteminin mikroskopik incelemenin
yerini alabilecek kapasitede olduğunu vurgulamışladır.
Garcia ve ark (11) altın standart olarak trikrom ve asit fast boyamanın kullanıldığı mikroskopi
ile pozitif ve negatif olduklarını bildikleri 444 gaita örneğinde, kalitatif sonuç veren Triage parazit paneli
(Biosite Diagnostics, Calif) nin sonuçlarını değerlendirmişlerdir. E.histolytica/E.dispar için duyarlılık
%96.0 ve özgüllük % 99.1 saptanmıştır. Duyarlılık ve özgüllük sırasıyla G.intestinalis için; %95.9 ve
%97.4, C.parvum için; %98.3 ve %99.7’dir. Triage parazit paneli kullanımı kolaydır, deneyim
gerektirmez ve tek gaita örneği ile çalışma imkanı sağlamaktadır.
II. CRYPTOSPOROIDOSIS
Cryptosporidium 4-6 μm çapında, zorunlu hücre içi paraziti bir protozoadır. Dünya nüfusunun
% 0,6-4,3 oranında Cryptosporidium ile infekte olduğu tahmin edilmektedir. Cryptosporidium’un neden
olduğu enfeksiyonun uzun yıllar bir zoonoz hastalık olduğu kabul edilmiş, ancak daha sonra yapılan
çalışmalarla bu enfeksiyona neden olan mikroorganizmanın gıdalar ve içme suları aracılığıyla
insanlara bulaştığı saptanmıştır. Ookistler nemli ortamda aylarca canlı kalabilirler. Doğada vahşi ve
evcil hayvanlar konak olabilmektedirler. Cryptosporoidosis AIDS’li hastalarda ve cinsel yolla bulaşan
potansiyel olarak ciddi fırsatçı enfeksiyon etkenidir. Diyare, karın ağrısı, bulantı, kusma ve kilo kaybı
oluşturabilir. İmmün sistemi nomal olan bireylerde hastalık kendisini sınırlar ve kısa sürer (12,13).
Cryptosporoidosis tanısı için ticari olarak elde edilebilen ürünler (DFA, IFA, EIA ve hızlı testler)
mevcuttur.
a.DFA (Direkt İmmünfloresans Tekniği) : Gaita örneklerindeki organizmaların yüzeyindeki
antijenlerin immünolojik olarak saptanmasında kullanılan monoklonal antikor temeline dayalı DFA
yöntemi Cryptosporoidosis’in tanısında günümüzde seçkin bir yöntemdir ve modifiye asit-fast boyama
tekniğine göre daha yüksek duyarlılığa sahiptir. Bu yöntemde şüpheli materyaldeki antijenler lam
üzerine yayılarak fikse edilir ve antijenin üzerine özel işaretli antikorlar konulur. Şüpheli antijenlerin
işaretli özel antikorların oluşmasına neden olmuş olan antijenler olup olmadığı araştırılır (3). Bu
yöntemde, konsantre veya konsantre olmayan gaita örneklerinde fluorescein isothiocyanate (FITC)
bağlı “monoklonal antikorlar” kullanılarak “ookistler” tanımlanmaktadır(1).
Bu testlerin kullanılışı kolaydır ve tecrübeli teknisyen gerektirmezler ve zaman kaybına yol
açmazlar. Bireysel laboratuarlarda da kullanılabilirler. Cryptosporoidosis tanısı için en duyarlı
(sensitivite:%99) ve özgün (spesifik:%100) yöntem olarak DFA bildirilmiştir (1).
Birçok kit,
Cryptosporidium, Giardia, ve E. histolytica için kombine edilmişlerdir.
Cryptosporidium ookist ve Giardia kistlerini birlikte saptayabilen kombine DFA kitleri ticari olarak
mevcuttur.
b.EIA (Enzim İmmunassay): Taze veya dondurulmuş gaita örnekleri ile formalin veya
sodyum acetate- acetic acid – formalin (SAF) ile fikse edilmiş prezerve gaita örneklerinde
Cryptosporoidosis tanısı için mikroplate şeklindeki bazı EIA kitleri ticari olarak bulunmaktadır. EIA
kitleri ile antijen taramasında konsantre edilmiş ve polyvinyl alcohol-treated (PVA) ile muamele edilmiş
örnekler test için uygun değildir. EIA kitleri mikroskopiye (genellikle acid-fast boyaması) karşı üstündür
ve DFA testi ile iyi korelasyon gösterirler. Klinik araştırmalar sonucu EIA kitlerinin duyarlılığı ve
özgüllüğü % 93-100 arasında bildirilmiştir. EIA testlerinin yalancı pozitif sonuçlar vermesi potansiyel
problemdir (1).
Cryptosporidium EIA testi, gaita örneklerinde Cryptosporidium ookist antijeninin tespiti amacı
ile kullanılır. Kullanılan EIA tekniğinde gaita örneği, örnek sulandırım sıvısı ile emulsifiye edilir. Bu
muameleden geçirilmiş gaita örneği sulandırımı ve Cryptosporidium ookist antijenine spesifik
monoklonal antikor içeren konjugat, mikropleytlerin Cryptosporidium ookist antijenine bağlanan
poliklonal antikorlar yapıştırılmış kuyucuklarına aktarılır. Şayet hasta örneğinde ookist varsa,
inkübasyon sırasında kuyucuklardaki monoklonal antikorlara ve konjugatta bulunan ookist spesifik
poliklonal antikorlara bağlanır. Oluşan spesifik olmayan bağlanmalar yıkama sırasında ortamdan
uzaklaştırılır. Substratın ilavesi ile, ookist varlığında oluşan enzim-antikor-antijen kompleksine bağlı
renk oluşumu tespit edilir.
c.Hızlı İmmunokromatografik Yöntemler: Bu yöntemler kombine antijen taraması
yapabilirler. Bu yöntem ile ya Cryptosporidium ve Giardia ya da Cryptosporidium, Giardia, ve E.
histolytica birlikte saptanabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı kısa test süresine sahip olması ve aynı
reaksiyonda birden fazla sonuç vermesidir. Bu testin EIA ve DFA ile duyarlılık ve özgüllüklerinin
karşılaştırıldığı çalışmalar devam etmektedir(1).
d.Cryptosporidium tanısı için kullanılan antijen testleri ile ilgili çalışmalar:
Johnston ve ark. (Johnston) yaptıkları çalışmalarında formalin ile fikse edilmiş 246 gaita
örneğinde Giardia ve/veya Cryptosporidium’u araştırmışlardır. DFA (The Merifluor) yöntemini altın
standard olarak aldıkları çalışmada Cryptosporidium için EIA (ProSpecT EZ, Alexon-Trend Inc, Minn.)
yönteminde duyarlılığı %70.3, özgüllüğü %99.5, hızlı tanı yönteminde (İmmunoCard STAT!, Meridian,
Ohio) duyarlılığı %67.6, özgüllüğü %99.0 olarak bulmuşlardır.
Garcia ve Shimizu (14) çalışmasında trikrom boyama ile doğrulanmış 171 gaita örneğinde
C.parvum’u ColorPAC (Becton-Dickinson) katı faz kalitatif immünokromatografik tanı yöntemi ile test
etmişlerdir. ColorPAC’ın duyarlılığını % 97.6, özgüllüğünü %100 bulmuşlardır.
III. GIARDIASIS
Giardia intestinalis, dünyanın her tarafında endemik ve epidemik diyarelerin başta gelen
etkenlerindendir. Gelişmekte olan ülkelerde enterik patojenlerin birinci sırada nedeni olup, 10 yaşından
küçük çocuklarda Giardia intestinalis, %15-30 prevalansta görülebilmektedir. Ülkemizde yapılan
araştırmalarda insidansı %1,9-37,7 arasında değişmektedir (15,16). Giardia çift çekirdekli ve flagellalı
bir protozoon parazittir. İki şekilde görülür: birincisi; infeksiyöz olmayan, armut şekilli olan ve ince
barsakta yaşayan trofozoit (9-20 µm) formudur. İkincisi; eliptik kenarlı ve infeksiyöz olan kist (8-12 µm)
formudur (17).
Tanısında, direkt mikroskobik inceleme ilk başta yapılması gereken yöntemdir. Fakat Giardia
intestinalis kist formunun aralıklı olarak gaitayla atılması ve ya gaitadaki kist sayısının az olması
sebebiyle mikroskobik incelemede yanlış sonuçlar alınabilir. Tek bir gaita örneği ile yapılan rutin gaita
incelemesinde, konsantrasyon metodu da eklense vakaların %10-50’sinde yanlış sonuçlar rapor
edilmektedir. Geleneksel tanı metotları için deneyimli personele ihtiyaç duyulur ve fazla efor ve zaman
harcanmasına neden olur. Mikroskopi dışında, enterotest, duodenal biyopsi ve fırça örneklerinin
incelenmesi diğer tanı yöntemleri arasındadır. Bunlar invaziv işlem olmaları ve özellikle çocuklarda
yapılması zor olduğundan tercih edilmemektedir. Gaita örneklerindeki organizmanın yüzeyindeki
antijenlerin saptanması mikroskobik tekniklere göre giardia tanısında daha yüksek duyarlılığa sahiptir.
Giardiasis immünolojik tanısında ticari olarak temin edilebilen ürünler mevcuttur. Günümüzde, gaitada
parazitin çeşitli antijenik yapılarını araştırmaya yönelik, DFA, EIA, ve hızlı testler gibi yöntemler giderek
daha sık kullanılmaya başlanmıştır (1,15,16,18).
a.DFA (Direkt İmmünfloresans Tekniği) : DFA yöntemi, gaita örneklerinde fluorescein
isothiocyanate (FITC) bağlı monoklonal antikorlar kullanılarak giardia kistleri tanımlanmaktadır.
Cryptosporidium ookist ve Giardia kistlerini birlikte saptayabilen kombine DFA kitleri de ticari olarak
mevcuttur. Bu organizmaların mikroskobik tanı yöntemi ile karşılaştırıldığında bu antijen yöntemlerinin
duyarlılığı ve özgüllüğü %100 dolaylarındadır. Bu testler kistlerin ve ookistlerin kantitasyonu için
kullanılabilir ve bu nedenle epidemiyoloji ve kontrol çalışmalarında daha kullanılışlıdır (1,3).
b.EIA (Enzim İmmunassay):
Giardiasis serolojik tanısı, eğer serumda antikor araştırılarak yapılacak ise tanısal değeri
bulunmamaktadır. Çünkü tedavi sonrası antikor düzeyi 2 hafta ile 15 ay gibi bir süre yüksek kalabilir.
Eğer gaitada bu parazitin antijeni araştırılacak ise parazite karşı üretilmiş özgül monoklonal antikorlar
kullanılmaktadır(2).
Taze veya dondurulmuş gaita örnekleri ile formalin, MIF veya sodyum acetate- acetic acid –
formalin (SAF) ile fikse edilmiş prezerve gaita örneklerinde Giardiasis tanısı için mikroplate şeklindeki
bazı EIA kitleri ticari olarak bulunmaktadır. EIA kitleri ile antijen taramasında konsantre edilmiş ve
polyvinyl alcohol (PVA) ile muamele edilmiş örnekler test için uygun değildir (1).
Giardiasis tanısında; EIA ile mikroskopik metodun avantaj ve dezavantajları vardır. Giardiasis
tanısında mikroskobisinin dezavantajları; değerlendirme için birkaç örneğe ihtiyaç duyulur, hastalar üç
kez laboratuara gitmek zorundadır, test performansı örneğin taze olmasına bağlıdır, deneyimli bir
teknisyen gerektirir. Avantajları ise Giardia haricinde başka parazitler de saptanabilir ve test maliyeti
düşüktür. Giardiasis tanısında, EIA’nın avantajları; tek bir gaita örneğinde yüksek duyarlılık ve
özgüllüğe sahiptir, gaita örneği 30 günden daha fazla saklanabilir ve deneyin çalışılması kolaydır.
Dezavantajları ise gaitada bulunan diğer parazitleri tanıma olanağı yoktur ve mikroskobiye göre
maliyeti yüksektir (19).
c.Hızlı İmmunokromatografik Yöntemler: Bu yöntemler kombine antijen taraması
yapabilirler. Bu yöntem ile ya Cryptosporidium ve Giardia ya da Cryptosporidium, Giardia, ve E.
histolytica birlikte saptanabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı kısa test süresine sahip olması ve aynı
reaksiyonda birden fazla sonuç vermesidir (1,20).
d.Giardia intestinalis tanısı için kullanılan antijen testleri ile ilgili çalışmalar:
Johnson ve ark.(21) yaptıkları çalışmalarında formalin ile fikse edilmiş 246 gaita örneğinde
Giardia ve/veya Cryptosporidium’u araştırmışlardır. DFA (The Merifluor) yöntemini altın standard
olarak aldıkları çalışmada Giardia için EIA (ProSpecT EZ, Alexon-Trend Inc, Minn.) yönteminde
duyarlılığı %90.6, özgüllüğü %99.5, hızlı tanı yönteminde (İmmunoCard STAT!, Meridian, Ohio)
duyarlılığı %81.3, özgüllüğü %99.5 olarak bulmuşlardır.
Maraha ve Buiting (22) yaptıkları çalışmada gaita örneklerinde dört EIA kiti ile G.intestinalis
antijenini araştırmışlardır. Giardiasis şüpheli 168 hastanın gaitasında mikroskopik inceleme ile Giardia
intestinalis’i 56 (%33) vakada saptamışlardır. Bir vakayı mikroskopi ile tespit edememişler fakat üç
farklı EIA ile pozitif bulmuşlardır. Toplam 57 örnek gerçek pozitif, 111 örneği gerçek negatif olarak
saptamışlardır. EIA’nın duyarlılığını % 63-91, özgüllüğünü % 95-99 olarak saptamışlardır. Tüm EIA
kitlerinde özgüllüğü ve Pozitif Prediktif Değeri yüksek bulmuşlardır. İnkübasyon süresi uzun olan EIA
kitinde (ProSpecT, EZ, Alexon-Trend Inc, Minn.) duyarlılık yüksek (%91) bulunmuştur.
Doğruman Al ve ark (23) çalışmalarında nativ-lugol incelemede şüpheli G.intestinalis kist
ve/veya trofozoitlerinin görüldüğü 44 gaita örneğinde; trikrom boyama ile 37 (%84), monoklonal EIA ile
39 (%88.6) ve monoklonal DFA ile 35 (%79.5)’inde pozitiflik saptamışlardır. Örneklerin 27
(%61.4)’sinde her üç metot ile pozitiflik bulmuşlardır. DFA yöntemi ile karşılaştırıldığında EIA
yönteminin duyarlılığı %88.6, özgüllüğü % 88.8 bulunmuştur.
Garcia (20) yaptığı çalışmada referans yöntemler ile G.intestinalis olduğu doğrulanmış 106
pozitif ve 104 negatif olan gaita örneğinde hızlı tanı testlerinden olan solid faz kalitatif
immünokromatografik yöntem (Simple Read, Giardia Rapid Assay, Medical Chemical Corporation) ile
duyarlılığı %97.2, özgüllüğü %100 saptamışlardır.
CDC tarafından Cryptosporidium spp ve Giardia spp’nin rutin tanısında DFA kiti,
Cryptosporidium spp için modifiye acid-fast boyası ve Giardia spp için Wheatley's trichrome boyası
kullanılmaktadır. Bu teknikler şüpheli vakaların doğrulanması ve ayırıcı tanı için kullanılmaktadır (1).
Düzen Laboratuarları Mikrobiyoloji Ünitesi’nde Gaitada antijen tayininde CDC’nin listesinde yer
alan duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek olan TechLab (TechLab, Blacksburg, Va, USA) kitleri
kullanılmaktadır. E.histolytica, G.intestinalis ve Cryptosporidium antijenleri için firma kit içeriğinde
duyarlılık ve özgüllüğü Tablo.2’deki gibi vermektedir.
Tablo.1: Paraziter tanıda kullanılan antijen testleri, kit adı, üretici firma ve test yöntemi listesi (*) (CDC)
Organizma
Kit adı
Üretici ve distribütör
Test tipi
Cryptosporidium spp.
Crypto CELISA
Cellabs
EIA
PARA-TECT™ Cryptosporidium 96
Medical Chemical Corporation
EIA
Cryptosporidium
spp./Giardia lamblia
ProSpecT Rapid
Remel
EIA
ProSpecT
Remel
EIA
Cryptosporidium
TechLab
EIA
Cryptosporidium
Wampole
EIA
Crypto CEL
Cellabs
IFA
XPect Crypto
Remel
Rapid
PARA-TECT™ Cryptosporidium/Giardia DFA
75
Medical Chemical Corporation
DFA
Merifluor
Meridian
DFA
ProSpecT
Remel
EIA
Crypto/Giardia CEL
Cellabs
IFA
ColorPAC*
Becton Dickinson
Rapid
ImmunoCard STAT!*
Meridian
Rapid
XPect
Remel
Rapid
Cryptosporidium
spp./Giardia
lamblia/Entamoeba
histolytica/dispar
Triage
BioSite
Rapid
Entamoeba histolytica
Entamoeba CELISA
Cellabs
EIA
E. histolytica
Wampole
EIA
E. histolytica II
TechLab
EIA
ProSpecT
Remel
EIA
Giardia CELISA
Cellabs
EIA
PARA-TECT™ Giardia Antigen 96
Medical Chemical Corporation
EIA
ProSpecT
Remel
EIA
Giardia II
TechLab
EIA
Giardia
Wampole
EIA
GiardiaEIA
Antibodies, Inc.
EIA
Giardia CEL
Cellabs
IFA
ProSpecT
Remel
Rapid
Entamoeba histolytica/E.
dispar
Giardia lamblia
(*) Bu tablo CDC’nin resmi web sitesinden alınmıştır (http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/DiagnosticProcedures.htm)
Tablo.2: E.histolytica, G.intestinalis ve Cryptosporidium spp. gaita antijen EIA kiti (TechLab,
Blacksburg, Va.) için duyarlılık ve özgüllük oranları.
Organizma / Yöntem
E.histolytica/EIA
Duyarlılık (%)
Özgüllük (%)
(Sensitivity)
(Specifity)
100
94.7
G.intestinalis/EIA
100
100
Cryptosporidium spp. /EIA
97.7
100
Düzen Laboratuvarı’nda 01.01.2006- 30.04.2007 tarihleri arasında EIA yöntemi ile incelenen
gaita örneklerinde parazit antijenlerinin sayı ve oranları Tablo.3’de verilmiştir. Bu tabloda sadece
gaitada parazit antijeni (EIA) istemi ile pozitif saptanan olguların sayısı sunulmaktadır. Yapılan EIA
testleri ile paralel olarak aynı zamanda rutin olarak çöktürme metodu ve nativ-lugol mikroskopik
incelemesi ile de bu parazitler araştırılmaktadır. E.histolytica EIA pozitif olguların hiçbirisinde
mikroskopi ile E.histolytica kisti saptanamamıştır. G.intestinalis kistleri, EIA ile pozitif saptanan 8
olgunun 7’sinde mikroskopi ile de saptanmıştır.
Tablo.3: EIA yöntemiyle incelenen gaita örneklerinde parazit antijenlerinin oranları.
E.histolytica
Örnek sayısı
802
Pozitif (n)
16
%
2.0
G.intestinalis
343
8
2.3
36
-
0.0
Organizma
Cryptosporidium spp.
ÖRNEKLERİN ALINMASI VE HAZIRLANMASI
Gaitada parazit antijenleri Düzen Laboratuvarı’nda her gün (Pazar günü hariç) çalışılmaktadır.
Test sonuçları çalışma günü akşamı saat 17.00’da rapor edilmektedir.
Örnek Tipi: Gaita
Temiz, ağzı kapaklı bir kaba alınan gaita örneği, mümkün olan en kısa sürede, 2-8 oC’de
saklanarak laboratuvara ulaştırılır. Testte çalışılacak gaita örneği mümkünse 24 saat içinde
çalışılmalıdır. Eğer 48 saat içinde çalışılmayacaksa, örnekler -20 ºC’de saklanır. Cary Blair veya C&S
gibi transport besiyerlerinde gelen gaita örnekleri de kullanılabilir. Bu durumda, örnekler 1:5 dilüe olduğu
için, örnek sulandırım tamponu ile sulandırılmadan, direk olarak testte kullanılır.
Gerekli en az gaita miktarı, katı örneklerde 0.15-0.20 gr, sıvı örneklerde 0.4 ml’ dir.
Her bir örnek için, bir tüp hazırlanır ve tüpün içine 0.4 ml örnek sulandırım sıvısı konulur. Katı
gaitalar; yaklaşık 0.15-0.20 g gaita örneği, temiz bir eküvyon yardımıyla alınarak, içinde örnek sulandırım
sıvısı bulunan tüplere aktarılır. Örnek tüpe aktarıldıktan sonra, eküvyon tüpünün kenarında çevrilerek,
sıvı süzdürülür. Sıvı gaitalar; pipet kullanılarak 0.4 ml örnek boş tüp içine konulur. Tüpler 10 saniye
vortekslenir. Hemen çalışılmayacaksa, sulandırımı yapılmış örnekler 2-8oC’ de saklanır.
Örneklerin tekrarlayan dondurma ve çözme işlemlerinden kaçınılmalıdır.
Kaynaklar:
1.
Centers
for
Disease
Control
and
Prevention
(CDC)
-
Diagnostic
Procedures
for
Stool
Specimens:
http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ DiagnosticProcedures.htm
2. Ak M: Enzyme Linked Immunsorbent Assay (ELISA). (Ed. Özcel MA, Altıntaş N). Parazit Hastalıklarında Tanı. Türkiye
Parazitoloji Derneği, Ege Üniversitesi Basımevi, İzmir, 1997; 241-59.
3. Özcel MA, Üner A, Ertuğ S: Immunfloresans Yöntemi. (Ed. Özcel MA, Altıntaş N). Parazit Hastalıklarında Tanı. Türkiye
Parazitoloji Derneği, Ege Üniversitesi Basımevi, İzmir, 1997; 215-39.
4. WHO. World Health Organization report of a consultation experts on amoebiasis. WeeklyEpidemiol. Rep, 1997;72: 97–100.
5. Tanyüksel M, Petri JWA. Laboratory diagnosis of amebiasis. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 713-729.
6. Haque R, Neville LM, Hahn P, Petri JWA. Rapid Diagnosis of Entamoeba Infection by Using Entamoeba and
Entamoeba histolytica Stool Antigen Detection Kits. J Clın Mıcrobıol 1995., 33: 2558–2561.
7. Petri WA, Singh U. Diagnosis and management of amebiasis. Cliin Infect Dis 1999;29:1117-25.
8. Ackers JP. The diagnostic implications of the seperation of E.histolytica and E.dispar. J Biosc (Supl. 3), 2002; 27: 573-578.
9. Yıldız-Zeyrek F, Özbilge H,Yüksel MF, Zeyrek CD, Sırmatel F. Şanlıurfa’da Parazit Faunası ve ELISA Yöntemi ile Dışkıda
Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar Sıklığı. Türkiye Parazitoloji Dergisi 2006; 30 (2): 95-98.
10. Schunk M, Jelinek T, Wetzel K, Nothdurft HD. Detection of Giardia lamblia and Entamoeba histolytica in stool samples by
two Enzyme Immunassay. Eur J Clin Microbil Infect Dis 2001; 20:389-91.
11. Garcia LS, Shimizu RY, Bernard CN. Detection of Giardia lamblia, Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar, and
Cryptosporidium parvum Antigens in Human Fecal Specimens Using the Triage Parasite Panel Enzyme Immunoassay. J Clin
Microbiol. 2000; 38(9): 3337–40.
12. Redlinger T, Corella-Barud V, Graham J, Galindo A, Avitia R, Cardenas V. Hyperendemic Cryptosporidium and Giardia
inhousholds lacking municipal sewer and water on the United States-Mexico Border. Am J Med Trop Hyg, 2002, 66(6): 794-798.
13. Otağ F, Aslan G, Emekdaş G, Aydın E, Taylan-Özkan A, Çeber K. Mersin İlinde İlkokul Öğrencilerinde Cryptosporidium
spp. Ookistlerinin Araştırılması. Türkiye Parazitoloji Dergisi, 2007; 31 (1): 17-19.
14. Garcia LS, Shimizu RY .Detection of Giardia lamblia and Cryptosporidium parvum Antigens in Human Fecal Specimens
Using the ColorPAC Combination Rapid Solid-Phase Qualitative Immunochromatographic Assay. J Clin Microbiol 2000;
38(3):1267-8.
15. Çetin E.T, Ang Ö, Töreci K. Tıbbi parazitoloji. 5. baskı, İstanbul Üniversitesi Basımevi, İstanbul,1995; s: 80-85.
16. Özcel MA, Üner A. Giardiosis. Türkiye Parazitoloji Derneği Yayın no: 14, Ege Üniversitesi Basımevi, Bornova, İzmir,1997.
17. Erlandsen LS, Meyer EA: Giardia and giardiasis: biology, pathogenesis and epidemiology. Plenum Pres, New York, 1984.
18. Garcia LS. Diagnostic Medical Parasitology. Fourth Edition. ASM Press, Washington, USA.2001, p.36-49.
19. Vidal AMB, Catapani WR. Enzyme-linked immunsorbent assay (ELISA) immunoassaying versus microscopy: advantages
and drawbacks for diagnosing giardiasis. Sao Paulo Med J. 2005; 123(6): 282-5.
20. Garcia LS, Garcia JP. Detection of Giardia lamblia Antigens in Human Fecal Specimens by a Solid-Phase Qualitative
Immunochromatographic Assay. J Clin Microbiol 2006; (44)12: 4587-8.
21. Johnston SP, Ballard MM, Beach MJ, Causer L, Wilkins PP. Evaluation of three commercial assays for detectionof
Giardia and Cryptosporidium organisms in fecal specimens. J Clin Microbiol 2003 (41)2: 623-6.
22. Maraha B, Buiting AGM. Evaluation of four enzyme immunassays for the detection of Giardia lamblia antigen in stool
specimens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19:485-7.
23. Doğruman Al F, Kuştimur S, Özekinci T, Balaban N, İlhan MN. The use of Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(ELISA) and Direct Fluorescent Antibody (DFA) Methods for Diagnosis of Giardia intestinalis. Türkiye Parazitol Derg 2006;
30(4):275-8.