Kromatografi Sistemleri

LABORATUAR CİHAZLARI
TANER TÜRKAN
SEM A.Ş.
 Sem Laboratuar Cihazları, 1989 yılında merkez ofisi İstanbul`da olmak üzere kurulmuştur.  Kromatografi cihazları, Spekroskopi cihazları, tamamlayıcı diğer cihazlar, mikro şırıngalar, kolonlar gibi her tür yardımcı aparat ve sarf malzemeleri satış ve satış sonrası destek konularında "Tam Hizmet" anlayışı ile hizmet vermektedir.  İstanbul, Ankara ve İzmir ofisleri ile Türkiye genelinde yaygın bayi ağı bulunmaktadır.
MİSYONUMUZ
Laboratuvar cihazları satış ve destek hizmetlerinde çeşitlilik, hız ve kaliteyi artırarak, en üst düzeyde müşteri memnuniyetini sağlamaktır.
TEMEL DEĞERLERİMİZ
 İleri teknoloji ürünü laboratuvar cihazlarını müşteri memnuniyeti odaklı yaklaşımı ve engin sektör deneyiminin sağladığı katma değer ile birlikte sizlerin hizmetine sunmaktır.
 İlkemiz müşterilerimiz için değer yaratmaktır. HİZMETLERİMİZ
 Kurulduğu günden bu yana giderek büyüyen firmamız bugün Türkiye’de toplam 120 kişi ile hizmet vermektedir.
 SEM Kalite odaklı hizmet anlayışı ile satış ve satış sonrası destek alanında Türkiye genelinde 4000’e yakın kullanıcıya hizmet vermektedir.
İŞ ALANLARIMIZ










Üniversiteler ve Enstitüler
İlaç Sanayi
Petrokimya ve Enerji
Çevre Laboratuvarları
Gıda ve Tarim Endüstrisi
Sağlık
Adli Tıp ve Kriminal
Kimya Endüstrisi
Tekstil Laboratuvarları
Maden ve Malzeme Endüstrisi
ve diğer ilgili alanlar
AR‐GE LABORATUVARIMIZ




Metod geliştirme çalışmaları Metod validasyon çalışmaları
Demo çalışmaları
Teorik ve uygulamalı eğitimler
NEREDEYİZ ?
İstanbul, Ankara, İzmir ofisleri ve tüm Türkiye’de etkin bayi ağı ile sizlerin hizmetinizdeyiz.
TEMSİLCİLİKLERİMİZ
KROMATOGRAFİ
Kromatografi, bir karışımda
bulunan maddelerin, biri sabit
diğeri hareketli faz olmak üzere
birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir
sistemde ayrılması ve
saflaştırılması yöntemidir.
Gaz ve Sıvı kromatografi arasındaki farklar
Polarity
LC
GC
LC
GC
10
0
10
2
10
4
10
6
10
8
S o lu t e M o le c u la r W e ig h t
11
Kromatografik Yöntemin
Seçiminde Numunenin Rolü
•
•
•
•
Gaz Kromatografi
Molekül ısı uygulandığında
buharlaşabilir olmalı.
Molekül sıcaklığa ve kataliz
reaksiyonlarına dirençli olmalı
Moleküler ağırlığı 500 amu dan
küçük olmalı
Tutucu faz seçiciliği var.
•
•
•
•
•
Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi
Numune sıvı faz içerisinde çözünür
olmalı.
Moleküleriçin ağırlık sınırı yok.
Tutucu ve Sürükleyici faz seçiciliği
var.
Numunenin analizden sonra geri
kazanımı mümkün.
Tahribatsız.
12
Gaz Kromatografi
GAZ FİLİTRELERİ
ELEKTROMETRE
Regülatörler
ENJEKSİYON
BLOĞU
Taşıyıcı gaz
Hidrojen
Hava
AKIŞ
KONTROLLERİ
KOLON
FIRIN
DETEKTÖR
BİLGİSAYAR
Gaz Kromatografi Sistemine Numune
Verme
Amaç: Numuneyi buhar fazından kolona aktarabilmek.
• Şırınga Enjeksiyonu (Sıvı örneklerin direk analizi)
– Manual veya Otomatik Örnekleme Sistemi ile enjeksiyon
• Valf Enjeksiyonu (Gaz Örneklerin direk analizi)
– Gaz Örnekleme valfi
• Harici Örnekleme Sistemleri (Sıvı ve katı örneklerde uçucuların analizi)
– Purge and Trap (Sularda uçuculaın direk analizi)
– Headspace (Katı ve sıvı numunelerden uçucu maddelerin direk
analizleri)
– Thermal Desorbsiyon ( Gaz örneklerden uçucuların analizi )
Enjeksiyon Bloğu Tipleri
•
•
•
•
•
•
Purge packed Split / Splitless Cool on‐column PTV ( Programable Temparature Vaporization )
VI ( Volatile Interface ) CIS ( Cooled Injection System ) ( Dolgulu kolonlar için )
( Kapiler Kolonlar için )
( Kapiler Kolonlar için )
( Kapiler Kolonlar için )
( Kapiler Kolonlar için )
( Kapiler Kolonlar için )
Enjeksiyon Bloğu Çalışma Sistemi
Septum
Septum purge hattı
O‐ring
Solvent / Örnek vent hattı
Liner
Buharlaşma yeterli ısıl enerji ısıtıcı blok tarafından örneğe transfer edildiğinde inert taşıyıcı gaz içinde gerçekleşir. Gerçekte bu değişim blok içindeki liner’ın sıcak yüzeylerinde oluşur.
ISITICI BLOK
= Taşıyıcı gaz
= Örnek molekülleri
= Solvent molekülleri
Ferrül
Kolon
Örnek Enjeksiyon Teknikleri • Split Injeksiyon.
Örnek ısıtılır, buharlaşır ve sadece küçük bir oranı analiz amacı ile kolona geçer. Bu teknik derişik örneklerde kullanılır .
• Splitless Injeksiyon.
Örnek ısıtılır, buharlaşır ve örneğin 95% den fazlası kolona analiz için geçer. Bu teknik seyreltik örneklerde , özellikle safsızlık analizlerinde kullanılır.
Örnek Enjeksiyon Teknikleri
• Programmed temperature vaporization (PTV).
Yüksek hacimde örnek soğuk enjeksiyon bloğuna enjekte edilir, sonra enjeksiyon bloğu solventin buharlaşacağı seviyeye ısıtılır ve solvent vent hattından dışarı atılır. Blok ısıtılarak analitin buharlaşması ve kolona transferi sağlanır. Bu teknik temiz örneklerde kullanılarak zaman ve iş kaybına neden olan örnek zenginleştirme gereğini ortadan kaldırır.
• Cool on‐column Injection.
Örnek direk olarak soğuk enjeksiyon bloğunda kapiler kolon içine enjekte edilir. Bu teknik kompleks örneklerde yüksek molekül ağırlıklı ve ısıdan bozunan maddelerin yüksek hassasiyetli miktarsal analizlerinde kullanılır. Uçucu olmayan maddeler içeren örnekler bu teknikte problem oluşturur. Cool On‐column Injeksiyon
Şırınga
İgnesi
Kolon
Sabit Kolon
Fazı
Örnek
Ayırım Bir Etkileşim Prosesidir.
Gaz
Kolon yüzey kaplaması
Taşıyıcı
Faz
Örnek
Sabit
Faz
Ayırım Nasıl Gerçekleşir.
Kromatografik ayırım malzemenin iki faz arasında dagılımı ve etkileşimi ile
gerçekleşir. (Taşıyıcı faz ve Sabit faz):
Taşıyıcı Faz
Sabit Faz
Gaz Katı
Kromatografi
(GSC)
Gaz
Katı
Gaz Sıvı
Kromatografi
(GLC)
Gaz
Sıvı
Kromatografik Ayırım Modeli
Maddelerin ayırımı
Akış
A
B
C
D
Kolon Tipleri
Dolgulu
GSC
Açık (Kapiler)
GLC
Duvar Kaplamalı
Açık tüp
Dolgulu
Uzunluk (metre)
İç Çap (mm)
530 micron
Dar tüp
0.5-10
5-100
5-100
2-4
0.530
0.1-0.25
Kolon Tipleri
Dolgulu
Açık (Kapiler)
Normal
Duvar kaplı ( Sıvı )
Açık tüp
Conventional
Packed and
Micro Packed
Porous
Layer
Bead
Bead
Column
Porlu tabaka
Açık tüp ( GSC )
mikron
WCOT
(geniş)
WCOT
(dar)
.5-10
5-100
5-100
5-100
2-4
0.530
0.3-0.75
.05-0.3
Akış (ml/min.)
10-60
4-30
1-30
0.3-1.0
Basınç degeri (psi)
10-90
1-20
1-40
5-90
Numune kapasitesi
100 ng/peak
100 ng/peak
50 ng/peak
Dolgulu
Uzunluk (metre)
İç Çap (mm)
530
Gaz Katı Kromatografi (GSC)
Uygulamaların 10%
Dolgulu kolon
Taşıyıcı gaz
Tutucu madde (GSC)
Geniş yüzey alanlı ve porlu
Kapiler - Porous Layer Open Tubular (PLOT)
Taşıyıcı gaz
Gaz Sıvı Kromatografi (GLC)
Ayrıcı Dolgu
Dolgulu kolon
Taşıyıcı gaz
Katı destek
Sıvı Faz
Çok büyük yüzey alanı ve Çok porlu.
Kapiler kolon
Wall Coated Open Tubular (WCOT)
Sıvı Faz
Gaz Sıvı Kromatografi (GLC)
Uygulamaların 90%.
•
•
Bölünme ile veya Sabit fazda farklı çözünürlük ( tutunurluk ) ile ayırım.
Moleküller polar farklılıkları nedeni ile ayırıma tabi olurlar ( dipole
güçlerin etkileşimi).
Genelleme:
“Like disolves like.”
veya.
Polar Polar ile etkileşir.
Örnek: Alkoller polar’dır.
C b
l bi
f d
Çıkış zamanı ‐ % Kolon kaplaması
o
A. 30% Liquid Phase at 50 C.
1
o
B. 20% Liquid Phase at 50 C.
1
o
C. 10% Liquid Phase at 50 C.
1
2
D. 5% Liquid Phase at 50 C.
1 2
o
E. 1% Liquid Phase at 50 C.
1 2
o
2
2
Kolon Tiplerinin Karşılaştırması
Kolon test numunesi
Packed Column Analysis:
5% OV101
on 80/100 Chromosorb
Capillary: MegaBore
30m X 0.53mm X .88m
Conventional:
30m X 0.32mm X .25m
Kapiler kolonların Yaygın tutucu faz kaplamaları
Phases With Similar
McReynolds Constants
Temp
Limits
Composition
Polarity
Applications
1. 100%Dimethyl
Polysiloxane (Gum)
Nonpolar
OV-1,
SE-30
-60 C to
325 C
2. 100%Dimethyl
Polysiloxane (Fluid)
Nonpolar
Phenols, Hydrocarbons,
Amines, Sulfur Compounds,
Pesticides, PCB's
Amino Acid Derivatives,
Essential Oils
OV-101,
SP-2100
0 Cto
280 C
3. 5%Diphenyl
95%Dimethyl
Polysiloxane
Nonpolar
Fatty Acids, Methyl Esters,
Alkaloids, Drugs,
Halogenated Compounds
SE-52,
OV-23,
SE-54
-60 C to
325 C
4. 7%Cyanopropyl
7%Phenyl Polysiloxane
Intermediate
Drugs, Steroids, Pesticides
OV-1701
5. 50%Phenyl, 50%Methyl,
Polysiloxane
Intermediate
Drugs, Steroids,
Pesticides, Glycols
OV-17
-20 to
280 C
60 C to
240 C
6. 50%Cyanopropylmethyl,
50%Phenylmethyl
Polysiloxane
Intermediate
Fatty Acids, Methyl Esters,
Alditol Acetates
OV-225
60 C to
240 C
7. 50%Trifluoropropyl
Polysiloxane
Intermediate
Halogenated Compounds,
+Aromatics
OV-210
45 C to
240 C
8. Polyethylene
Glycol-TPA modified
Polar
Acids, Alcohols, Aldehydes
Acrylates, Nitriles, Ketones
OV-351,
SP-1000
60 C to
240 C
9. Polyethylene Glycol
Polar
Free Acids, Alcohols, Ethers,
Essential Oils, Glycols, Solvents
Carbowax 20M
60 C to
220 C
Specific application notes fromcolumn suppliers provide information
for choosing a specific column.
Kolon Fırını Sıcaklık Çalışmaları
• Izo termal:
– Fırın sıcaklığı analiz boyunca sabit sıcaklıkta tutulur.
– Geç çıkan malzemelerde yüksek pik genişlemesi görülür.
• Sıcaklık Programlaması:
– Analiz edilen malzemelerin geniş kaynama sıcaklığı aralığında olması (>100°).
– Analiz süresi kısalır ve daha düzgün pik yapıları elde edilir.
– Artan kolon kanaması baseline kaymalarına neden olur.
– Çok kademeli program yapılabilir.
Kolon Sıcaklığı Çalışması
Isothermal
Kolon Sıcaklığı Çalışması
Temperature Programmed
Çıkış zamanı – Fırın Sıcaklığı
o
A. 30 C.
1
2
o
B. 40 C.
1
2
o
C. 50 C.
1
2
o
D. 60 C.
12
Frompg. 58 - BASIC GAS CHROMATOGRAPHY by A.M. McNair & E.J. Bonelli, VARIAN
Sıcaklık Programlı çalışmanın Karakteristikleri.
• Geniş kaynama aralıklı malzeme karışımları analizinde.(>100 0C)
• Analiz süresi kısalığı
• Daha Keskin pik yapıları.
• Daha iyi miktarsal doğruluk, özellikle geç çıkan maddelerde.
• Kolon kanamasının artması ve taban çizgisi kayması.
• Sıcaklığın artması ile Linear akışkanlıkta azalma oluşur ve kolon içi akışı sıcaklık yükseldikçe azalır
Gaz Basınç Sistemlerinin Çalışma
Modları
• Sabit Basınç (Constant Pressure) • Sabit Akış (Constant Flow)
• Basınç – Akış Programlama
– Basınç – akış değişikliği kullanıcı tarafından programlanır.
– Başlangıç programı sonrasında sabit akışa geçilebilir.
Akış ‐
Sıcaklık
30M x 0.32 x 0.25uM HP‐5
Sabit akış modu
AKIŞ (mL/min)
AKIŞ (mL/min)
Sabit basınç Modu
5 psi
1.0
.8
.6
.4
1.0
.8
0.92 mL/min
.6
.4
.2
.2
50
50
100
150
250
200
100
150
300
200
250
300
SICAKLIK
BASINÇ (psi)
10
8
6
10
8
6
4
4
2
2
50
50
100
150
200
250
300
100
150
200
250
SICAKLIK
SICAKLIK
1.8
1.6
HETP (mm)
BASINÇ (psi)
SICAKLIK
1.4
1.2
1.0
.8
.6
.4
.2
1
2
3
AKIŞ
4
5
300
Sabit Akışın Avantajları
•
•
300
Fırın
Sıcaklığı
250
200
50
40
30
Giriş
Basıncı
150
100
20
10
Zaman
BASINÇ (psi)
•
Sıcaklık programlı çalışmalarda Optimum Lineer akışın sürekliliğini sağlar.
Son piklerin iyi miktarsal analizi.
– Gelişmiş pik yapısı
Gelişmiş ayırım
Akışa hassas detektörlerin stabilitesi
TCD
MSD
Azalmış çıkış süresi/ Sıcaklık
Kısa analiz süresi
Düşük fırın sıcaklığı
Kolonun daha uzun kullanımı
SICAKLIK
•
Düşük Fırın Sıcaklıkları
Basınç Programının avantajları
Enjeksiyon anında basıncın yükselmesi.
•
Kalış süresinin azalması
– Termal bozunmanın azalması
– Splitles enjeksiyonda kısa Purge zamanı
– Kısa analiz süresi
Daha yüksek enjeksiyon hacmi
300
FIRIN
SICAKILIGI
250
50
40
30
200
150
GİRİŞ
BASINCI
100
ZAMAN
20
10
BASINÇ (psi)
– Yüksek hassasiyet
– Yüksek doğruluk
SICAKLIK
•
Basınç Programının Avantajları
Kısa analiz süresi
•
Azalmış kolon bozunması
250
OVEN
TEMPERATURE
50
40
200
30
150
20
100
INLET
PRESSURE
TIME
10
P R E S S U R E ( p s i)
•
300
TEM PERATURE
Çok kademeli programlar
Detektörler
GC Detektör: Tanımlama
Bir GC detektörü taşıyıcı gazdan farklı bir malzemenin varlığını algılayan ve bu bilgiyi elektrik sinyaline dönüştüren bir araçtır.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Thermal Conductivity Detector (TCD).
Flame Ionization Detector (FID).
Electron Capture Detector (ECD).
Nitrogen Phosphorus Detector (NPD).
Flame Photometric Detector (FPD).
Pulse Flame Photometric Dedector (PFPD).
Electrolytic Conductivity Detector (ELCD, HALL).
Photo Ionization Detector (PID).
Mass Selective Detector (MSD).
Infrared Detector (IRD).
Atomic Emission Detector (AED).
Detektör Yanıtı Karakteristikleri
Response:
Örneğin birim miktarına verilen yanıt. Response/ miktar eğrisi kalibrasyon eğrisidir. Bu egrideki en küçük miktar noktası MDL ( Minimum detekte edilebilirlik) noktası olarak adlandırılır.
Seçicilik:
Detektörün yanıt vereceği yapıları belirler.
Detektörler
Detektör Tipleri
Kısa Açıklama
TCD
Filament sıcaklığı analitin taşıyıcı gaz içinde bulunması durumunda
yükselir, böylece filament rezistansı artar.
FID
Alev içinde yanan maddenin ürettiği iyonlar akım değişikliğine neden
olur.
ECD
Elektro negatif madde dedektörden geçerken düşük enerjili termal
iyonları yakalar, hücre içinde akım düşmesine neden olurlar.
NPD
Nitrogen ve phosphor’lu maddeler Alkali metal tuzu buharı ile
zenginleştirilmiş alevde akımın yükselmesine neden olurlar.
FPD
Sülfür ve Fosfor iceren maddeler alev içinde yanarken kimyasal
ışıma oluştururlar ve selektif dalga boyunda bu ışıma ölçülür.
ELCD
Halojenler, sülfür, veya azotlu maddeler özel reaksiyon hücresinde
reaksiyon gazı ile karıştırılırlar. Oluşan ürün daha sonra uygun bir
sıvı ile karıştırılarak elektrik geçirgen bir sıvı elde edilir.
Detektörler
Detektör Tipleri
Kısa Açıklama
PID
Molecules are ionized by excitation with photons from a UV lamp.
The charged particles are then collected, producing a current.
MSD
Molecules are bombarded with electrons producing ion fragments
which pass into the spectrometer's mass filter. The ions are filtered
based on their mass/charge ratio.
IRD
Molecules absorb infrared energy, the frequencies of which are
characteristic of the bonds within that Molecule.
AED
Molecules are energized by a plasma source and separated into
excited atoms. As electrons return to their stable state, they emit
light, which is element Specific.
GC Detektörleri karşılaştırması.
TCD
FID
ECD
AED
PID
NPD
(N)
IRD
NPD (P)
FPD (S)
MSD
(SCAN)
(X)
ELCD
ELCD
10-15
fg
ppt
(SIM)
(S or N)
10-12
pg
ppb
1 ppm =
10-9
ng
ppm
1 ng
1 L
10-6
g
ppthousand
=
1 mg
Liter
=
10-3
mg
percent
1 L
Liter
Kapiler Kolonlar Ve Detektör Hassasiyetleri ( Seçicilik)
FID
ECD
NPD (P)
LİKİT KROMATOGRAFİ
Tipik HPLC sistemi
Enjektör
Karıştırıcı
pompa
Kromatogram
Kolon
detektör
Çözenler
49
Tipik HPLC kolon dolgu maddesi
OH
OH
OH
O
O
Si
Si
Si
Si
O
O
O
OH
Si
O
Silica Gel
Surface
Chemically Modified
Silica Gel
Pores
CH
Si
Si
3
Si - O - Si - (CH2 )17 CH 3
CH
Si
3
Si
Si
50
Tipik kolon dolgu maddesi ‐
Styrene DVB
CH = CH 2
CH = CH 2
- CH 2- CH - CH2- CH - CH2 - CH - CH2 -
CH = CH 2
- CH 2- CH - CH2- CH - CH2 - CH - CH2 -
+
Styrene
•
•
•
Divinyl Benzene
Ters ve Normal faz
Iyon değişim
Boyut dağılım Kromatografisi
51
R
R
Normal‐Faz Sıvı
Kromatografisi
H
Si
O
Si
Si
O
O
H
H
H
O
O
Kolonlar
Silika (Adsorption)
Siyano (Bonded Phases)
Amino
Diol
O
O
O
O
Tasıyıcı Faz
Organik Solventler
Kullanım yeri
Yapısal izomerlerin ayırımı
Organik/su taşıyıcı fazında tamami
ile çözünmeyen maddeler
52
Ters Faz Sıvı kromatografisi
Kolonlar
C8 - Octyl Silyl
C18 - Octadecyl Silyl
Cyanopropyl
Aminopropyl
Polymer-based
Taşıyıcı Faz
Su ile:
Methanol
Acetonitrile
Isopropanol
Tetrahydrofuran
Ayrılma mekanizması analiz edilecek
maddenin taşıyıcı faz ile sabit faz
arasındaki çözünürlügüne baglıdır.
•Suda az çözünürlük – uzun tutunma
•Karbon atomu sayısı arttıkça – uzun
tutunma
•Dallı yapılar normal izomerlerden daha
az tutunurlar
•Doymamışlık tutunmayı kısaltır.
53
Ion‐Pair Kromatografi
Stationary
phase
+
Counter ion
-
+
+
Ion-Pair Reagents:
Solute ion
-
Tetrabutylammonium phosphate
Strong and weak acids
Alkylsulphonic acids
Strong and weak bases
+
Solute ion
54
İyon Degişimi kromatografisi
M echanism :
Ionic Interaction
-
+
Cl
N
Cl
-
+
N
Stationary Phase:
Sulfonates (SCX)
Triaklyam m onium (SAX)
Carboxym ethyl (W CX)
Diethylam inoethyl (W AX)
SO 3
+
H
SO 3
+
H
M obile Phase:
+
SO 3
H
Ionic Solutions (Counterion)
Buffers
Organic Modifiers
55
Büyüklük dağılımı kromatografisi
Mechanism:
Elution order is a function
of molecular size
Stationary Phase:
Cross-linked gels with
defined pore size
Must be non-reactive
with mobile phase.
Mobile Phase:
Aqueous solvents (GFC)
Organic solvents (GPC)
Must be non-reactive
with stationary phase.
56
Kromatografik Parametreler
t
R(B)
t R(A)
Detektör yanıtı
t
R
= retention time ( Alı konma zamanı)
t 0 = Tutunmayan maddenin alı konma zamanı
W = tabanda pik genişliği
t
0
A
B
Enjeksiyon
W
A
W
B
Zaman
57
Ayırıma etki yapan parametreler
•
•
•
•
•
•
Kolonun tutucu faz seçimi
Kolon uzunluğu ve çapı
Taşıyıcı faz kompozisyonu
Sıcaklık
Akış Örnek hacmi
58
Ayırım İşlemi
Ayırımın hedefi: Örnek bileşenlerinin birbirlerinden ayrılması ( Resolution )
t
t
A
R resolution
tB
bileşen B nin tutunma süresi
tA
bileşen A nin tutunma süresi
w Pik tabanındaki genişlik (sn)
W1/2 Pik yarı yüksekliğindeki genişlik
RA
RB
B
0
R=2
t RB - t RA
W A+ WB
R=1.176
t
RB -
t RA
W 1/2A + W 1/2B
60
Rezolüsyon Değerleri
0.4
0.5
0.8
0.6
1.00
0.7
1.25
For equal peak areas, R of 1.5
gives baseline separation
61
Seçiciliği etkileyen parametreler
Change mobile phase
composition
Stronger
Solvents
Weaker
Solvents
IPA/Water
ACN/Water
DECREASING
MeOH/Water
INCREASING
Change stationary phase
Not
Easily
Overloaded
Easily
Overloaded
C-18
C-2
Low Organic
Stationary Phase
High Organic
Stationary Phase
62
Sıcaklığın ayırıma etkisi
40º C
A B
65º C
B
0
5
A
10
Zaman (Dakika)
63
Solvent gücü ‐ Normal Faz
X+T+B
CH
HC
3
3
X = Xylene
T
CH 3
T = Toluene
X
B
B = Benzene
°= 0.42
Methylene
Chloride
Mobile Phase
°= 0.00
n-Pentane
64
Peak Symmetry
S = B/A
A
B
10% of peak height
Excellent
S = 1.0 - 1.05
Acceptable
S = 1.2
Unacceptable
S=2
Awful
S=4
65
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
High Pressure Liquid Chromatography
Sistemi oluşturan parçalar
HPLC Sistemi Ana Parçaları
Ana Parçalar
• Solvent Haznesı
Injector
• De-gas
Mixer
• Pompa
Pumps
Chromatogram
• Kolon / Fırını
Column
Detector
Solvents
• İnjeksiyon
• Detektör
• Veri Analiz
67
HPLC Tubing
• Paslanmaz çelik
– Genellikle dış çap 1/16" ve çeşitli iç çaplar. • Teflon
– 1000 psi basınca kadar çalışır. Genellikle solvent şişeleri ile pompa arasında kullanılır.
• PEEK
– Metal akış hatları istenmediginde paslanmaz çelik hatlar yerine kullanılabilir. Max çalışma basıncı 1000‐8000 psi.
• Tefzel
68
HPLC Pompası
Temel üç fonksiyonu vardır.
1. Doğru ve sabit akış sağlamak.
2. Doğru taşıyıcı faz kompozisyonu sağlamak.
3. Sıkıca doldurulmuş kolon içinden malzeme ve sıvı
fazın akışını sağlamak için gerekli gücü sağlamak.
• Otomobil lastiği basıncı 2 bar
• HPLC Pompa basıncı 400‐1300 bar
69
Pompa Tipleri
• İsokratik pompa.
– Tek veya karışım halinde bir taşıyıcı fazın zaman içinde kompozisyonunun değişmemesi.
• Gradient pompa.
– Birden çok sıvının zaman içinde oranlarının değişmesi.
– İkili , üçlü veya dörtlü gradient.
• Alçak basınç karışımlı pompalar.
• Yüksek basınç karışımlı pompalar.
70
Taşıyıcı Faz Degaz Sistemi
12 ml
Helyum veya vakum
Solenoid valve
Vakum
Helyum degaz
• Helyum degaz
• Vakum filtrasyon
• Ultra sonikasyon
Vakum degaz
• On line Vakum degaz
71
Çift Piston Seri Pompa
• İlk piston ikincinin iki
katı hacme sahiptir.
• Sürekli ve kararlı basınç
ve akış sağlar.
72
İzokratik Pompa
Damper
Purge
valve
To ALS
and
Column
Outlet
valve
Inlet valve
Waste
73
Alçak Basınç Gradient Pompa
Vacuum haznesi
Solvent
şişeleri
Damper
Inlet
valfi
Purge
valfi
Atık
oranlama valfi
74
Otomatik Örnekleyici
Standard loop volume
Total delay volume
Minimal (bypass) delay volume
300 µl
300 µl + Vinj
6.2 µl
Metering device
Vial gripper
Sampling
unit
6-port valve
From pump
To column
To waste
75
Manual Injection
Load
Sample
Syringe
Inject
To
Waste
To
Column
From
Pump
Sample
Loop
(Fixed Volume)
To
Column
76
Kolon Fırını
• Tekrarlanabilirlik
• Analiz süresi
77
Detektörlerin Sınıflandırılması
• Örnek varlığının ölçülmesi.
–UV , FLD, MS
• Örnek ile taşıyıcı faz arasındaki genel farklılıkların
ölçülmesi.
– RID
• Taşıyıcı fazın uzaklaştırılması ile ölçüm.
- ELSD ( Evaporatif Laser Scattaring Detectör ), etc.
78
Detektörlerin % Kullanımı
43.0%
4.0%
22.0%
1.0%
5.0%
7.0%
10.0%
UV-VIS
DAD
Fluorescence
Refraktif Indeks
Elektrokimyasal
Conductivity
Mass spec
Others
8.0%
79
Detektör Karakteristikleri
Hassasiyet
Seçicilik
VWD
DAD
ng/pg
-
ng/pg
++
80
Pik tanımlamaları
Fluorescence
pg/fg
++
10
Yüksek hassasiyet
Electrochemical
pg/fg
+
>20
Yüksek hassasiyet
Conductivity
ng/pg
-
10
Iyon
Kromatography
Refractive
Index
Mass
Spectrometer
ug/ng
-
100
Universal
ng/pg
++
<100%
Detector Tipi
Response to %
of compounds
80
Avantajları
Ucuz
MW & yapısal
bilgi
80
WL 247/504
WL 302/420
WL 248/411
WL 270/388
WL 241/394
In
d
en
e
)p
yr
en
e
i)p
er
yl
en
o(
12
3cd
Be
nz
o(
gh
Be
nz
o(
k)
flu
or
an
th
en
Be
e
nz
o(
a)
py
re
ne
Be
nz
o(
e)
py
re
Pe
ne
ry
le
ne
Ch
ry
se
ne
Py
re
ne
Farklı Detektör hassasiyeti ihtiyacı
UV-signal
Fluorescence
PAH's extracted from soil;
Sup.LC-PAH 150x4.6mm;
Solv.: H2O/CH3OH= 10:90
81
Farklı detektör seçiciliği ihtiyacı
Flecainide in
Serum
UV signal
FL signal
Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected
UV and fluorescence signal
82
Kalitatif Bilgi ihtiyacı
Qualitative Information
Chlortoluron ?
Atrazine ?
Take peak spectrum (MS)
Take peak spectrum (UV)
200
58
215
44
172
68
96
60
Wavelength (nm)
80
100
138
132
104
120
140
158
160
180
200
Mass/Charge
83
220
UV – Vis Sistemli Detektörler
• Sabit veya değişebilir dalga boylu detektör.
– Tek dalga boyu veya programlanabilir.
• Diode Array Detektör.
– Çoklu dalga boyu.
– Spektrum (Kütüphane , Pik saflığı).
84
Optik Dizayn
Taramalı ve Sıralı Diyot Detektörler
Detector
Entrance slit
Source
Entrance
slit
Diode-array
detector
Exit slit
Flow cell
Source
Flow cell
Concave
grating
Concave grating
Geleneksel Taramalı
detektörler
Diode-array
Detektör
85
Tek Dalga Boylu dedektörler
Slit
Örnek
diode
Lens
ayna
E +
e
E +
vib
UV
Grating
0->4
0->3
0->2
0->1
Referans
diode
0->0
ayna
Işık
Ayırıcı
0->2 0->1
0->3
0->4
Ev
Akış hücresi
E = hv =
ex
spectrum
Absorption
Cut‐off filter
Holmium oxide filter
Döteryum
lamba
S1
S0
V4
V3
V2
V1
V0
86
Erot
Diode Array Detector
Vis
Lamp
Achromatic
Lens
Diode Array
Detector
Flow Cell
UV
Lamp
Homium
Filter
Grating
Optical
Slit
87
Diode Array Spectral Capabilities
Graphical and Numerical Results
Spectra
Purity Match
999
Purity Match
764
200
400
Wavelength (nm)
200
400
Wavelength (nm)
Signal
impure
Three dimensional data allows one to:
• Perform peak purity.
• Search user‐created libraries.
• Recreate signals from stored spectra
pure
88
S0
S1
V4
V3
V2
V1
V0
Evib+
S0
Emission
spectrum
Absorption
spectrum
E rot
0->4
E +
e
0->1
0->2
0->3
E
v
Absorption
spectrum
E = hv =
ex
0->4
0->3
0->2
0->1
0->0
0->4
0->3
0->2
0->1
0->0
0->1
0->2
0->3
0->4
E
v
UV Absorbsiyon ‐ Floresans
Eksitasyon
UV
FLD
Radiationless
conversion
S1
V4
V3
V2
V1
V0
89
Optik Yapı
Floresans Detektör
Xenon
flash Lamp,
15 W
Emission
M onochromat or
signa l &
spectr a mode
Lens
PM T det ect or
M irror
Exit at ion
M onochromat or,
signa l &
spectr a mode
Lens
Reference Diode
8 µl Flow Cell, a uto-r ecognition
90
FLD‐data ve Spektrum
Spectrum
Flash #
1*
2
3
4
5
6
7
8
Time
[msec]
0
14
28
42
56
70
84
98
Ex
[nm]
250
230
250
240
250
250
250
260
Em
[nm]
350
350
350
350
350
350
350
350
Intensity
5
4
8
15
20
30
30
25
w' length
Chromatogram
*) flash duration = 1 microsecond
time
91
UV‐spektrum / FLD‐specktrum
Norm
35
*Benzo(b)fluoranthene
indentifiedby UV-Library
30
25
20
15
10
5
0
200
250
300
350
400
450
nm
92
Refractive Index Detectör
Beam Deflection
Fresnel Prism
Laser Interferometer
Reference
Cell
Sample
Cell
Photodiodes
Sample
Reference
Sample
Reference
93
SEÇİCİ DEDEKTÖRLER
KÜTLE DEDEKTÖRLER
KÜTLE DEDEKTÖR SEÇİMİ
Doğru analizör seçimi için..
BİLİNMEYENLER mi “TESPİT EDİLECEK”?
BİLİNENLER mi “TAYİN EDİLECEK?
BİLİNENLER “KONFİRME mi EDİLECEK?
ve
MATRİS KOMPLEKS Mİ?
Hedefli Tarama vs Hedefsiz (Genel Tarama) Akış Şeması
Hedefsiz (Genel) Tarama
Start
Start
Create
AMRT Editor
Edit
Tanımlama KONFİRMASYON
Start
AMRT
Create
Edit
Library Editor
MS‐MS Lib
TOF‐based Screening
QTOF‐based Confirmation/Identification
Feature Extraction
Formula Generation
Report
Report
Stop
Hedefli Tarama
KANTİTATİF
QQQ‐based Screening
QQQ‐based Quantitation
Target compound transitions
Generate Standard Curve
Start
Stop
Report
Report
MRM DB
Find MRM Transitions
Start
Optimizer
Optimize CE
Metot Optimizasyonu ve MRM Veri tabanı oluşturma
Stop
QQQ’de kullanılan MRM MS/MS nedir?
Multiple Reaction Monitoring
MS: iyon kaynağından gelen birçok iyon var
Q3: SIM
Q3: Product Ion Scan
Product 2
Product 1
Q1 SIM
CID öncesi prekürsor
iyonu izole ederiz
Product 3
CID + Q2 SIM Neden MS/MS modu SIM moduna
göre daha fazla Seçiciliğe sahip?
MS/MS (QQQ)
SIM (Single Quad)
• seçicilik spektral rezolüsyona doğru orantılıdır
• aynı m/z değerine sahip iyonlar için seçicilik yoktur
• prekürsör seçiciliği SIM ile aynıdır
• en azından bir product (ürün) iyonunun interferansa ait olmayan ancak prekürsöre ait olan bir fragman (parçalanma) iyonu olma ihtimali yüksektir
Product 2
interferans
Product 1
İnterferans
Product 3
analit
Prekürsör İyon
Unit (0.7 Da) kütle rezolüsyonu
Neden MS/MS? 100 fg HCB
MS SIM
MS/MS MRM S/N: 116:1 RMS
MS
Single Quad
SIM
MS/MS
Triple Quad
MRM
Kromatografi analizcisinin hayali: düz bir baseline üzerinde tek bir pik
Şiddet
MS/MS sayesinde neden daha düşük LOD’lere ulaşabiliyoruz?
Sinyal
S/N
(Dedeksiyon Limiti
Gürültü
MS/MS kademe
November
Hedefli Tarama (MS/MS) cihazları
•Düşük Dedeksiyon Limitleri
•Geniş Dinamik Aralık– 6x106
•Yüksek kütle aralığı – 3000 m/z
•Kolay Metod Geliştirme
•Kolay Numune Hazırlama
•Yanlış Pozitiflerin Engellenmesi
•Aynı anda hem analiz hem konfirmasyon
KALICI ORGANİK KİRLETİCİLER (KOK)
•
•
•
•
Zehirlidirler. Çevrede kolayca yok olmazlar. Besin zincirinde birikirler
Hava, su , toprakla kaynaklarından çok uzak mesafelere kolayca yayılabilir ve
taşınabilirler. 12 adet Kalıcı Organik Kirletici
• Aldrin (Özellikle karınca ve çekirgelerle mücadelede kullanılan bir
tarım ilacıdır.) • Klordan (Ziraii mücadelede kullanılan bir tarım ilacıdır.) • DDT (Bit ve pire gibi zararlılarla ve sıtma ile mücadelede yaygın olarak
kullanılan tarım ilacıdır) • Dieldrin (Ziraii mücadelede kullanılan bir tarım ilacıdır.) • Dioksinler (Yakma prosesleri ve bazı klorlu pestisitler ile endüstriyel
kimyasalların üretilmesi sırasında istenmeden açığa çıkan bir yan
üründür.) • Endrin (Ziraii mücadelede kullanılan bir tarım ilacıdır.) • Furanlar (Dioksinler gibi yakma prosesleri ve bazı klorlu pestisitler ile
endüstriyel kimyasalların üretilmesi sırasında istenmeden açığa çıkan
bir yan üründür.) Heptaklor (Fare, sıçan gibi zararlı hayvanlarla mücadelede kullanılan bir
pestisittir.) Hekzaklorobenzen (Zararlı mantar ve istenmeyen otlarla mücadele
kullanılan ve dioksin furan oluşumuna neden olan bir pestisittir.) Mireks (Ziraii mücadelede kullanılan bir tarım ilacıdır.) Poliklorlu Bifeniller (Elektrik trafolarında ve kapasitörlerde kullanılan
bir endüstriyel kimyasal olup yanmaya karşı direnç gösterdiği için boya, plastik ve karbonsuz kopya kağıtlarının üretiminde kullanılmıştır.) Toksafen (Ziraii mücadelede kullanılan bir tarım ilacıdır.) •
•
•
•
•
•
Klordekon (Pestisit) Hekzabromobifenil (Endüstriyel Kimyasal) Lindan (Pestisit) Alfa Hekzaklorosiklohekzan (Pestisit) Beta Hekzaklorosiklohekzan (Pestisit) Tetrabromodifenil eter ve pentabromodifenil eter (Endüstriyel
Kimyasal) • Hekzabromodifenil eter ve heptabromodifenil eter (Endüstriyel
Kimyasal) • Perflorooktansülfonik Asit(PFOS) ve Perflorooktansülfonilflorit
(Endüstriyel Kimyasal) • Pentaklorobenzen (Pestisit ve istenmeden üretilen yan ürün) KALICI ORGANİK KİRLETİCİLERİN ANALİZLERİ
GCMSMS ile Dioksin ve Furan Analizleri
GC/MS/MS Dioxin Analyzer Konfigurasyonu
7010 MS/MS Instrument Detection Limit (IDLRSD) in fg
IDLRSD = tα,n‐1 x RSD x c
100
CMPD
RRF
2378‐TCDF
2378‐TCDD
12378‐PeCDF
23478‐PeCDF
12378‐PeCDD
123478‐HxCDF
123678‐HxCDF
234678‐HxCDF
123478‐HxCDD
123678‐HxCDD
123789‐HxCDD
123789‐HxCDF
1234678‐HpCDF
1234678‐HpCDD
1234789‐HpCDF
OCDD
OCDF
1.239
1.379
1.247
1.072
1.120
1.300
1.185
1.247
1.213
1.175
1.277
1.908
1.274
1.278
0.977
0.761
1.064
tα,n‐1 = t value (coefficient) at the level of α with the sample size of n‐1
c = concentration of the std sample injected
10 reps (5 fg/µL)
%RSD IDLRSD (fg)
8.99
1.2
11.33
1.6
3.96
2.7
4.15
2.9
4.29
3.0
7.81
5.4
6.56
4.5
4.53
3.1
8.02
5.5
9.76
6.7
6.88
4.8
6.70
4.6
5.15
3.6
7.79
5.4
7.93
5.5
7.56
10.4
5.16
7.1
2378‐TCDD
x10 2 2378-TCDD: + MRM (321.9 -> 258.9) TCDD_5fg_009.D Smooth
1
0.98
0.96
0.94
0.92
0.9
0.88
0.86
0.84
0.82
0.8
0.78
0.76
0.74
0.72
0.7
0.68
0.66
0.64
0.62
0.6
0.58
0.56
0.54
0.52
0.5
0.48
0.46
0.44
0.42
0.4
0.38
0.36
0.34
0.32
0.3
0.28
0.26
0.24
0.22
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
16.05
16.1
16.15
16.2
16.25
16.3
Average S/N = 3.282
16.35
16.4
16.45
16.5
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)
16.55
16.6
16.65
16.7
16.75
16.8
16.85
Agilent: 5 fg kolona enjeksiyon
Agilent Restricted
10
Method Parametreleri
GC Conditions
Column
DB 5MSUI 60 m x 0.25 mmID x 0.25 µm Injection port liner
2mm id dimpled splitless liner, UI
Injection mode
Cold‐splitless (compressed air/CO2 cooled MMI)
Injection volume
1 µL Inlet temperature program
Carrier gas
Oven program
MS transfer line temperature
600 °C/min
60 °C
0.31 min
330 °C 5 min
MS set points
He, constant flow 0.700 mL/min 60 °C
1 min
Electron Energy
70 eV 30 °C/min
270 °C
1 min
Tune
eihs.tune.xml
2 °C/min
310 °C
0 min
EM gain
10
5 °C/min
350 °C
0.5 min
MS1 resolution
Unit
MS2 resolution
Quant/Qual transitions
Unit
1.5 mL/min N2
4 mL/min He Fraction Specific
Dwell times
Fraction Specific
Collision energies
Optimized
Source temperature
350 °C
Quad temperatures
150 °C
350 °C
Collision Cell
Agilent Restricted
11
Dioxins/Furans
Resolution = 0.64
Peak to Peak Valley = 14.1%
Resolution = 0.69
Peak to Peak Valley = 23.5%
Level CS5 (TCDD = 2.0 ppb; 13C12 = 100 ppb)
Tetra
Penta
Hexa
Hepta
Octa
Agilent Restricted
11
PCBs
Dioksin Metodu ile Aynı Parametreler
Level CS4 (PCB 123/118 = 10/50 ppb; 13C12 = 10 ppb)
28
123 & 118
Resolution= 0.57
138
105
81 &77
114
153
101
126
167
156 & 157
123 & 118
52
180
169
189
Agilent Restricted
11
•
•
Kontrol Standartları
STD01 – Hexa‐dioxin/furan‐isomers
STD02 – PCBs 123 & 118
Example Chromatograms
Blue – PCBs
Black – Dioxins/Furans
Std 01
Dioxins/Furans & NO–PCB
22 cmpds
Std 02
MO– & NDL– PCBs
14 cmpds
Agilent Restricted
11
7010 MS/MS Linearity
R2
PCB
R2
2378‐TCDF
1.0000
PCB – 28
1.0000
2378‐TCDD
1.0000
PCB – 52
1.0000
12378‐PeCDF
1.0000
PCB – 101
1.0000
23478‐PeCDF
1.0000
PCB – 81
1.0000
12378‐PeCDD
1.0000
PCB – 77
1.0000
123478‐HxCDF
1.0000
PCB – 123
0.9974
123678‐HxCDF
1.0000
PCB – 118
0.9998
234678‐HxCDF
1.0000
PCB – 114
0.9978
123478‐HxCDD
1.0000
PCB – 105
0.9999
123678‐HxCDD
1.0000
PCB – 153
0.9999
123789‐HxCDD
1.0000
PCB – 138
1.0000
123789‐HxCDF
1.0000
PCB – 126
1.0000
1234678‐HpCDF
1.0000
PCB – 167
1.0000
1234678‐HpCDD
1.0000
PCB – 156
1.0000
1234789‐HpCDF
1.0000
PCB – 157
1.0000
OCDD
1.0000
PCB – 180
1.0000
OCDF
0.9998
PCB – 169
1.0000
PCB – 189
1.0000
Selected Hexa‐Furan Calibrations
20.0000
y = 0.0182x + 0.0172
R² = 1
18.0000
16.0000
Relative Response
Dioxin/Furan
y = 0.0122x + 0.0075
R² = 1
14.0000
12.0000
10.0000
y = 0.0112x + 0.0117
R² = 1
8.0000
y = 0.0112x + 0.0042
R² = 1
6.0000
4.0000
2.0000
0.0000
0
200
400
600
800
1000
1200
Concentration (pg/µL)
123478‐HxCDF
123678‐HxCDF
234678‐HxCDF
123789‐HxCDF
Agilent Restricted
11
PAH Analizör
GCMSMS Pestisit Analizleri
LCMSMS Pestisit Analizleri
Pag
Sorularınız?
Teşekkürler