Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)

Arş. Gör. Mehmet GÜMÜŞTAŞ
Genel
olarak
kromatografi,
çeşitli
maddelerin
hareketli
faz
yardımıyla, sabit bir faz arasından değişik hızlarla hareket
etmeleri esasına dayanır.
İlk defa 1906 yılında bir Rus botanikçi Tswett
tarafından kullanılmıştır.
Yaptığı
çalışmada
yapraklardaki
pigmentleri
ayırmayı CaCO3 kolon ve petrol eteri kullanarak
başarmıştır.
Bu çalışmalardan sonra kromatografi, 1952 ve 1960 yıllar arasında hızlı
bir şekilde gelişerek analitik teknikler arasında önemli bir yer almıştır.
Bütün sıvı kromatografik teknikleri arasında en
yaygın kullanılanı dağılma kromatografisidir. Bu
teknik sıvı-sıvı kromatografi ve sıvı-bağlı faz
kromatografisi olmak üzere iki alt sınıfta
incelenir.
Sıvı-sıvı tekniğinde durgun faz katı yüzeyine
fiziksel adsorpsiyonla, bağlı-faz tekniğinde ise
kovalent bağlar ile tutturulur.
ABSORBSİYON
ADSORBSİYON
HPLC ne amaçla kullanılır?

HPLC uçucu olmayan kimyasal ve biyolojik bileşenlerin ayrımı için kullanılır.

Örnek olarak

•
İlaç etken maddeler, aspirin, ibuprofen veya asetaminofen
•
Proteinler, yumurtanın beyazı veya kan proteinleri
•
Poimerler gibi organik kimyasallar (polisitiren or polietilen)
•
Gıdalardaki pestisit ve vitaminler
•
Birçok doğal bileşen, ginseng, bitkisel ilaçlar, bitki ekstraktları
•
Sıcaklık ile kararlılığını kaybeden bileşenler, trinitrotoluen (TNT), enzimler
NOT: Eğer uçucu bir bileşik ile çalışacaksak (bir gaz veya petroldeki bir
hidrokarbon türevi), Gaz kromatografi sistemi tercih edilmelidir.
Kromatografik ayırmada maddeler birbiriyle karışmayan iki faz
arasında dağılırlar.
Fazlardan birine hareketli (mobil) faz, diğerine ise durgun faz
(stasyoner faz) denir.
Karışımdaki her maddenin hareket hızı (tR), maddenin hareketli
veya mobil faza olan ilgisine göre belirlenir.
Hareketli faza daha çok ilgisi olan maddeler daha hızlı hareket
ederler.
Kolondan çıkan her maddenin konsantrasyon profili, pik olarak
adlandırılır.
Piklerin oluşturduğu tabloya da kromatogram adı verilir.
Bir kromatogram neye benzer?
B
Her bir sinyal pik olarak adlandırılır
C
A
Örneğin enjekte edildiği zaman
0
2
4
6
8
Zaman
10
12
14 min
HPLC nin uygulanışı

İlaç endüstrisini baz aldığımızda, dozaj formlarında bulunan aktif
bileşenin kalite kontrolü hayati önem taşımaktadır ( ) .

HPLC sistemi bu aktif bileşen veya dozaj formunun içerisinde bulunan,
ilacın sentezlenmesinden veya bozunmasından kaynaklanan
safsızlıkların (
) tespiti için kullanılabilir.

Bu noktada yapılan kalite kontrol hastanın güvenliğini sağlamaktadır.
1. adım: Tabletin uygun çözücüde çözünmesi
2. adım: Ayrım

Bileşenlerin ayrımı kolonda
gerçekleşir

Kolon, çelik bir borudan
oluşan içi silika jel ile
doldurulmuş bir yapıdan
oluşur.
Kolon
Sabit Faz Partikülleri

Kolon
Sabit Faz Partikülleri
Çözünen karışım kolona
enjekte edilir.
Kolon
Sabit Faz Partikülleri
Kolon boyunca sıvının
(metanol ve su karışımı gibi)
hareket etmesi için bir
basınç uygulanır
Hareketli Faz
Bu sıvı karışımına hareketli
faz denir.
Hareketli faz, sabit faz
boyunca ilerleyerek, enjekte
edilen numuneyi taşımakla
görevlidir.
Hareketli Faz
Farklı bileşenler, kolonda
farklı hızlarda ilerlerler.
Bunun anlamı bileşenlerin
kolon çıkışına farklı
zamanlarda hareket etmesi
demektir.
Hareketli Faz
3. Adım: Bileşenlerin miktarlarının tayin edilmesi

Bileşenler ayrıldıktan sonra, karışım içerisindeki bileşenlerin
miktarlarının tayini için UV ışık kaynağından faydalanılır

Işığın madde tarafından absorblanması, madde miktarı ile orantılıdır
diyebiliriz

Örneğin madde miktarını 2 katına çıkarırsak, madde 2 kat daha fazla
ışığı absorblayacak demektir.
Dedektör ışığın yoğunluğunu
ölçmekle görevlidir.
Işık geöişindeki azalma
dedektörde bir cevap oluşturur
ve buna da pik denir.
Detector
4. Adım: Bileşenlerin nicel olarak tayini

Öncelikli olarak temel maddeye
ait pik görülmekte

Görüntüyü yaklaştırdıkça küçük
pikler gözükmeye başlamaktadır.Bu
sinyaller safsızlıklara aittir.

Hasta sağlığı açısından bu
safsızlıklar belirlenen limitlerin
altında olmak zorundadır.
HPLC sistemine genel bakış


Agilent 1200
Infinity SK
Sistem
Genel olarak 5 kısımdan oluşur
•
Pompa
•
Enjektör
•
Kolon
•
Dedektör
•
Kaydedici
Bu kısımlardan bazıları çalışılacak bileşene göre
değişiklik gösterebilir
HPLC sisteminin parçaları
Pompa
Pompanın görevi sıvının sistemde dolaşımını
sağlamaktır. Dakikada akan mL cinsinden
gösterilir.

•
HPLC için normal bir akış 1- 2-mL/dk aralığındadır.
•
Maksimum 400 bar.
•
UHPLC pompaları ile 600 - 1500 bar.
Bir deney esnasında, pompa değişmeyen, sabit bir akış sağlıyorsa
bu sisteme isokratik sistem denir.
Fakat hareketli fazda analiz esnasında değişimler gerçekleşirse
çalışılan sisteme gradient sistem adı verilir.
1260 Infinity Izokratik pompa– Çalışma prensibi
AIV: Active inlet valve
OBV: Outlet ball valve
1260 Infinity Çoklu pompa– Çalışma prensibi
Damper
Pump
outlet
Purge
valve
Mixer
To waste
Outle
t
Valve
Inlet Valve
From solvent
bottle
Seal
Piston
Pump head A
Mixing
Chamber
Outle
t
Valve
Seal
Piston
Pump head B
Inlet Valve
From
solvent
bottle
Gradient ve Isokratik Koşulların Kıyaslanması

İzokratik

Çözücü bileşimi hep sabittir
•
Basit ayrımlar için idealdir
•
Kalite kontrol departmanlarında
sıklıkla tercih edilir.

Gradient

Hareketli faz bileşimi zamanla
değişim gösterir.
•
Kompleks karışımların ayrımı için
idealdir.
•
Bilinmeyen karışımlarda metod
geliştirmek için tercih edilir.
•
En yaygın kullanılan şekli doğrusal
artan gradient tir.
Neden gradiente ihtiyaç duyuyoruz?
Herbisitlerin ZORBAX StableBond-C18 kolon kullanılarak ayrımı
Izokratik
70% su/30% Asetonitril
Kolon:
Hareketli faz: A: H2O 0.1% TFA, pH 2
1,2
1,2
B: Asetonitril
4
4
5
5
Akış Hızı:
1.0 mL/min
Sıcaklık:
35°C
Örnek:
1. Tebuthiuron
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
3
3
6
6
7
7
0
0
Gradient 20 – 60%
Asetonitrile/su
ZORBAX SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 µm
25
25
4
4
Prometon
Prometryne
Atrazine
Bentazon
Propazine
Propanil
Metolachlor
2
2
Time (min)
Time (min)
Not:
Son pikin
alıkonma süresi
25 dakikadır
3
3
66
11
75
75
5
88
Not:
8
8
Son pikin
alıkonma süresi
70 dakikadır
50
50
5
00
30
55
7
7
1010
1515
Time (min)
20 20
Time (min)
25
25
30
Enjektör sistemleri

Enjektör:
–
Genellikle enjekte edilen numune
hacimleri
0.1- 20-mikrolitre (µL) arasındadır.
–
Sistemdeki yüksek basınca dayanıklı
olmalıdır.
Manuel enjeksiyon valfi
Günümüzde oto örnekleyiciler analizcilerin zaman
kaybını en aza indirecek şekilde tasarlanmaktadır.
Oto örnekleyici sistemi
Enjektör bölmesi hakkında bilinmesi gerekenler

Enjeksiyon hacmi aralığı: 0.1 µl den 100 µl ye kadar enjeksiyon
yapılabilir. Farklı enjektörler kullanılarak bu miktar arttırılabilir.

Enjektör bölmesi: Farklı hacimdeki vialler kullanılabilir.

Carryover (Bulaşma): Numunenin enjeksiyonlar arasında bulaşmasını
ifade eden bir terimdir. En aza indirmek için yıkamalar yapılabilir.

Numune kapasitesi: Oto örnekleyicinin plaka tipine göre değişir.

Kesinlik: Enjeksiyon hacimlerinin tekrarlanabilirliğini ifade eder.

Doğruluk: Kesin olarak alınan numune hacminin doğru değere yakınlığıdır.
Kolon bölmesi
5 – 100 °C arasında ayarlanabilmektedir.

Kolon, ısıtıcı bloklar arasına
yerleşir.

Kromatografik sistemin kalbi olarak nitelendirilir.

Ayrım, bileşenlerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine
göre gerçekleşir.
•
Partikül boyutu küçüldükçe, uygulanan basınç artar.
Kolon



Analizler için doğru kolon seçimini yapmak çok önemlidir.
HPLC de kullanılan kolon tipleri
•
Analitik: iç çapı (i.d.) 1.0 - 4.6 mm; uzunluğu 15 – 250 mm
•
Preparatif: i.d. > 4.6 mm; uzunluk 50 – 250 mm
•
Kapiler: i.d. 0.1 - 1.0 mm; boyları değişkendir
•
Nano: i.d. < 0.1 mm, ya da < 100 µm
Kolon bağlantı materyalleri
•
Paslanmaz çelik En çok tercih edilen bağlantı ekipmanı türüdür,
yüksek basınca dayanıklıdır.
•
Cam (Biomoleküller için kullanılır)
•
PEEK polimer (Baınca daha az dayanıklıdır fakat kullanımı daha
pratiktir.)
Kolon partikülleri

Kolonlar genellikle poroz silica partikuller ile
doldurulurlar
En cok kullanılan ebatlar 5 μm, 3.5 μm, ve 1.8 μm

Yüksek basınç altında dolum yapılmalıdır.
Bu yüzden bir çok kişi hazır kolon kullanır

Bir bileşiğin alıkonma zamanı partikül büyüklüğüne,
yapısına ve kimyasına göre değişiklik gösterir.
Kolon dolgu
materyali
Kolon seçimi
Çözücü
Mod
Organik
Molekül ağırlığı <
2,000
Hekzan
Normal faz
MeOH /
MeOH:H2O
veya
ACN /
ACN:H2O
Ters Faz (RP)
HILIC ( polar bileşikler için)
THF
Jel permasyon
Iyonik olmayan
Ters Faz
HILIC
Sulu faz
Iyonik
Molekül ağırlığı>
2,000
Ters Faz
Organik
Jel permasyon
Sulu faz
Jel permasyon
Ion-değişim kromatografi
Ters Faz(Daha büyük partiküllü
kolon ile)
Ayrım şekilleri

Temelde 4 yöntem kullanılır
•
Ters Faz
•
Normal Faz
•
Iyon değişim kromatografi
•
Boyut eleme kromatografi
Ters Faz

Mevcut bileşenlerin 90% ından
fazlası için kullanılabilir.

Apolar, polar, iyonlaşabilen
veya iyonik bileşenler için
kullanılabilir.
Kolon apolar özellik gösterirken
(C18, C8, C3, phenyl) hareketli faz
polar özellik gösterir.
(tampon) + su ile karışabilen
organik çözücü ( metanol veya
asetonitril)
10 sulfa tipi ilacın ayrımı
Normal Faz

10% kadar bileşik için tercih
edilebilecek bir yöntemdir.

Aşağıdaki durumlarda
kullanılabilir:
•
Suya karşı hassas
bileşikler
•
izomerler
•
Kiral analizler
Kolon polar
(e.g., silika jel, cyanopropylbonded,
amino-bonded) özellik
gösterirken hareketli faz apolar
olmalıdır.
(hekzan, iso-oktan, methilen
klorür, ethil acetate gibi).
Source: Application # 5991-0395EN
Normal-faz kromatografide,
polarlığı en az olan bileşen kolondan ilk önce çıkar;
hareketli fazın polarlığı arttıkça elüsyon zamanı azalır.
Ters-faz tekniğinde ise,
aksine, polarlığı en çok olan bileşik kolondan ilk önce çıkar
ve hareketli fazın polarlığı arttıkça elusyon zamanı artar.
Polaritesi yüksek olan bileşik kolonu önce terkeder.
Dedektör
Kolonu terk eden bileşenleri görebilmemizi sağlar
• Ayrılan moleküllerin miktarını belirlememizi
sağlar
• Dedektörden geçen maddeler bir kaydedici
yardımıyla kaydedilerek, zamana karşı
dedektör cevabına ait bir grafik oluştururlar
buna da kromatogram denir.
En çok kullanılan dedektörler
• Spektroskopik
• Floresans
• Kırılma indisi
UV Absorbsiyonuna dayanan Spektroskopik dedektör
UV dedektör
DAD dedektör
Zaman t
Ayrım tr2-tr1
Pik genişliğiWb1,2
tr2-tr1
Mukemmel Ayrim
tr2-tr1
Kabul edilebilir bir ayrim
h
tri
Alıkonma zamanı
W1/2 Yari yükseklikteki pik
genişliği
Wbi Taban pik genişliği
tr2
tr1
W1/2
Wb1
Wb2
t
Ayrım Gücü

Ayrım gücü, kolonun pikleri ayırma kapasitesini ifade eder.

Etkin tabaka sayısına (N), seçiciliğe (a) ve kapasite faktörüne
bağlıdır (k)
•
Rs değeri 1.5 ve üzeri olursa pikler birbirinden kesin olarak
ayrılmıştır diyebiliriz.
Ayrım gücünü hesaplamak için
a 1  k 
Rs  1 N  
 

4
 a  1 k 
Etkinlik

Seçicilik
Kapasite faktörü
Ayrım gücünün artması aşağıdaki koşullar ile sağlanır
• Bunlardan en önemlisi seçiciliktir. Seçicilik parametresindeki ufak bir
değişimin ayrıma etkisi çok büyük olur
• Alıkonma zamanını etkisi k değeri küçük olduğunda önem taşımaktadır.
• Etkinlik ise kolonun ayrım gücünü ve yeni olduğunu ifade eder.
Etkin tabaka saysının hesaplanması (N)
 tr 

N  16  
 Wb 


•
•
2
 tr 

N  5.54  
 W1/ 2 
2
Yüksek tabaka sayısı daha hızlı, simetrik ve keskin piklerin elde
edileceğini gösterir.
Kolonun etkinliği
Kolon uzunluğuna
Kolon dolgu partiküllerinin boyutuna bağlıdır
Tabaka ne demek?
Rs ~ 1
4
N
Rs ~ 1
LC
dp
h
Lc
Lc
1
~
4 H
4 h d
p
Kolon uzunluğu
Partikül büyüklüğü
1 tabakanın yüksekliği
Yüksek tanaka sayısı:
• Keskin ve dar piklerin oluşmasını
• Daha iyi bir tayini
• Bileşenlerin birbirinden daha güzel ayrılmasını
sağlar
Kapasite faktörü(k)
æt - t ö
k =ç r 0÷
è t0 ø
Kapasite faktörü, maddelerin bağıl alıkonmasının bir ifadesidir.
Hesaplanması için maddelerin alıkonma zamanlarının yanı sıra ölü
zamanın da (t0) belirlenmesi gerekir.
t0- kolonda tutunamayan maddenin alıkonma zamanını ifade eder.
Urasil, KBr gibi maddeler ölü zaman belirteci olarak kullanılabilir
Kapasite faktörünü:
• Sabit faz
• Hareketli faz etkiler.
Seçicilik (α)
k2
a
k1
a
k1
k2i
Seçicilik
ilk bileşene ait alıkonma zamanı
ikinci bileşene ait alıkonma zamanı
Birbirini takip eden iki pik arasındaki ayrımın ifadesidir.
α=1 olduğunda iki pik birbirinden ayrılamaz ve birleşerek kolonu terk eder.
α yı etkileyen faktörler:
• Hareketli faz
• Sabit faz
• Sıcaklıktır
N, α ve k nın ayrım gücüne etkisi
Kolonun ayrım gücüne etkisi

pH etkisi
Organik çözücü yüzdesi azaldıkça alıkonma zamanı uzamaktadır!!!
26.5.2015
Sıcaklığın etkisi