HPLC

Kromatografi Nedir?
Kromatografi, bir karışımda bulunan bileşenlerin birbirinden ayrılmasını gerçekleştiren ve bu sayede
kalitatif ve kantitatif analizlerinin yapıldığı yöntemlerin genel adıdır. Bu yöntemlerde çalışma
düzeneği temel olarak iki bileşenden oluşur. Bu bileşenlere sabit faz (stationary phase) ve hareketli faz
ya da mobil faz (mobile phase) adı verilir. Mobil fazın içerisinde yer alan bileşenler, sabit faza ait
dolgu maddesiyle etkileşmeleri sebebiyle, bir miktar tutulurlar. Bu tutulma, örnekteki farklı bileşenler
için farklı miktarlarda olur. Böylece bileşenler sabit fazın sonlarına doğru, farklı hızlarda ilerledikleri
için, birbirinden ayrılmış vaziyette sabit fazı farklı zamanlarda terkederler. Bu şekilde sabit fazdan
çıkan bileşenlerin derişimleri uygun bir biçimde ölçülür ve zamana veya mobil fazın kullanılan
hacmine karşı y-ekseninde işaretlenerek “kromatogram” denilen grafikler elde edilir.
1903: Russian botanist Mikhail Tswett
Adsorpsiyon kolon kromatografi tekniğine göre bitki pigmentlerini ayırmıştır
–
Cam bir kolonu kalsiyum karbonat
ve alumina ile doldurmuş
–
Saf çözelti ile örnek kolana dökülmüş
–
Dikey konumdaki kolon içerisinde örnek
hareket ettikçe, farklı renkte bantlar oluşur.
–
Örnek içindeki renk maddelerinin ayrımı
gerçekleşmiştir.
–
Kromatografi Latince kökenli “color writing”
kelimelerinden türetilmiştir.
Ayrıca, Tswett kelimesi rusçada renk anlamına gelmektedir.
HPLC
Enjektör
HPLC donanımını oluşturan enjektör örneğin sabit faz (kolon) öncesinde mobil faza enjekte edilmesi
için kullanılır. Elle kumanda edilen manuel ve bilgisayar kumandalı oto-enjektörler olmak üzere 2
çeşidi bulunmaktadır.
- Manuel Enjektörler(Manuel Injector): Örneğin enjekte edilebilmesi için enjektör önce doldurma
pozisyonuna (load position) getirilerek örnek, isteğe göre seçilebilen sabit hacimli, loop içerisine
doldurulur. Loop’a doldurulan örnek hacmi loop sabit hacmini geçerse, fazla olan kısım dışarıya
otomatik olarak atılır. Daha sonra enjektörün kolu enjeksiyon pozisyonuna (inject position) getirilerek
örnek mobil faz içerisine enjekte edilmiş olur. Kullanılan loop hacimleri çok değişken olup genellikle
1
5 mL – 5 mL aralığında değişir. Loop hacmi küçüldükçe tekrarlanabilirlik adına yapılan hata oranı da
büyümektedir.
- Oto-enjektörler(Autosampler): 2 tip oto-enjektör mevcuttur. Bunlar XY tipi ve carousel tipidir. XY
tipinde enjektör hareketli olup belirtilen koordinatlara giderek örneği şişesinden çekmekte ve loop
vasıtasıyla mobil faza enjekte etmektedir. Bunun için seçilen örneklere ait bilgilerin, gerekli yazılım
kullanılarak, önceden bilgi işlemciye girilmesi gerekmektedir. Carousel tipinde ise örnekler dönen,
dairesel şekilli bir taşıyıcı vasıtasıyla sabit bir enjektörün altına taşınmaktadır.
Kolon
Modern HPLC donanımının 4 temel yapı taşından birisi olan kolon, karmaşık örneklerde bileşenlerin
birbirinden iyi çözünürlükle ayırımından sorumlu sabit fazdır. Kolon imalatında yapı materyali olarak
316 paslanmaz çelik, TEFLON, cam veya PEEK en sık tercih edilenlerdir. Kolonun ayırım gücü ve
performansı yapıldığı materyalden çok, iç yüzeyine yapılan kaplamada kullanılan malzemenin
kimyasal ve fiziksel özelliklerinden etkilenmektedir. Kullanılan bu tür kaplama malzemeleri çok
çeşitli olup, kullanılacak mobil fazın ve uygulanacak HPLC metodunun özelliklerine ve analizi
yapılacak örneğin bilinen kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre seçilmelidir. Seçilecek kolonun
HPLC uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak basınca dayanıklı olmasına dikkat
edilmelidir. Birçok analitik kolonun iç çapı 2-5 mm aralığında değişmektedir. Kolon iç çapı arttıkça
akış hızı ve iç doldurma hacmi artmakta ama oluşacak piklerin çözünürlüğü dolayısıyla duyarlılık
azalmaktadır. Kolonların boyları (uzunluğu) çok çeşitli olup genellikle 30-300 mm aralığında
değişmektedir. Kolon uzunluğu arttıkça örnek bileşenlerinin ayırımı daha iyi olmakta fakat analiz
süresi uzadığı için daha fazla mobil faz harcanmaktadır. Kolon boyutlarının tanımlanmasına
uluslararası standartlar getirilmiştir. Buna göre önce mm cinsinden uzunluk ve çap yazılmakta, bunu
firma adı, sabit faz türü, AO türünden poroz yüzey çapı ve mm cinsinden partikül büyüklüğü
izlemektedir. Örneğin, 250/4,6 Nucleosil C18 100 – 5 yazıldığında, kolonun 250 mm uzunluk ve 4,6
mm iç çapa sahip olduğu anlaşılmaktadır. Kolonun firması (markası) Nuclesoil olup, sabit faz türü
normal fazda kullanılan bir tür olan C18 dir. Poroz yüzey çapı 100 AO olup, dolgu materyaline ait
partikül büyüklüğü 5 µm’dir.
Yüksek basınçta yapılan kromatografide, sisteme verilmeden önce, hareketli fazın içerisindeki
çözünmüş gazlar uzaklaştırılmalıdır; aksi halde sistemin düşük basınçlı kısmı olan dedektörde,
çözünmüş gazlar (özellikle hava) kabarcık oluşturur. Bu durum, dedektörden çok hatalı değerler
alınmasına neden olur. Hareketli fazdan gaz uzaklaştırma işlemi ısıtma veya vakum uygulayarak
olur.10-60 ml/h akış hızını elde etmek için hareketli faza uygulanan basınç, 30-400 atm arasında
değişir.
SK koşulları iyi ayarlandığında, kolonda birbirinden ayrılan maddeler taşıyıcı faz ile birlikte ölçüm
birimi olan dedektöre gelirler. Dedektör maddenin derişimi ile doğru orantılı bir özelliğini ölçmelidir.
Bu amaçla; Absorbans Dedektörü, Floresans Dedektörü, Kırılma İndisi Dedektörü, Elektrokimyasal
Dedektör ve İletkenlik Dedektörü kullanılabilir. Absorbans dedektörleri, akış hücrelerinden geçen
sıvının -sabit ya da istenilen değere ayarlanabilir dalga boyundaki- ışığı absorpsiyonunu ölçerler.
Floresans dedektörler, belli bir dalga boyunda ışığı absorpladıktan sonra başka bir dalga boyunda ışın
yayan yani florasans özellik gösteren maddelerin yaydığı ışık şiddetini ölçerler. Kırılma indisi
dedektörleri ise akış hücrelerinden geçen akımın kırılma indisini ölçerler. Absorbans dedektörü
2
kullanılırken seçilen dalga boyunun, ışığın % 90’ının absorplandığı dalga boyu olarak tanımlanan,
çözücü uv-cut off değerinden yüksek olmamasına dikkat edilmelidir. Bu durum, özellikle düşük dalga
boylarında absorpsiyon yapan örnekler için önemlidir. Akış hücresine gelen madde derişimi ve/veya
cinsi değiştiğinde dedektör sinyalinde değişiklik olur. Kaydedici, zamana göre dedektörden gelen
sinyali (voltaj değişimini) kaydeder .
HPLC Sistem Türleri
A) Isocratic sistem (tek pompa, tek solvent, solvent karışım olabilir, ayırım yetersizdir)
B) Düşük basınçlı gradient sistem (tek pompa, max 4 farklı mobil faz, karışma pompadan önce)
C) Yüksek basınçlı gradient sistem (2 yada 3 pompa, 2 yada 3 farklı mobil faz, karışma pompadan
sonra)
3
4
Karbonhidrat Analizi
HPLC sistemi kullanılarak mono ve oligosakkaritler ile hidroliz işlemi gerçekleştirilmiş
polisakkaritlerin kalitatif ve kantitatif analizleri gerçekleştirilebilir. Bu yöntem ile hızlı sonuç
alınabilmekte ve örnekte yüksek konsantrasyonlarda şeker bulunması halinde çalışılabilmektedir.
Ayrıca yüksek düzeyde kesinlik ve doğruluk söz konusudur. Analiz edilecek örnek, gaz
kromatografisinde olduğu gibi türevlendirme işlemine gereksinim duyulmazken, enjeksiyon öncesinde
mikrofiltreden (0.45µ) geçirilmelidir.
HPLC de ayırım, örneğin yatışkın (sabit) ve hareketli (mobil) fazlar arasındaki etkileşimlerine bağlı
olarak gerçekleşir. Bu bağlamda, kullanılan yatışkın ve mobil fazın özelliklerine bağlı olarak da sistem
farklı şekillerde isimlendirilebilir. Aşağıda karbonhidrat analizleri için kullanılabilecek bu sistemlere
kısaca değinilmiştir.
5
Özellik
Yağ-çözünür olanlar
Geniş kullanım alanı
Moleküler ağırlık dağılımı,
protein ayrımı
İyonik bileşenleri ayrımı
Enzim ve proteinlerin
saflaştırılması
Normal faz kromatografisinde yatışkın faz polar karakterde olup, ayırım mobil fazın polaritesindeki
artışa bağlı olarak gerçekleşir. Karbonhidratların HPLC ile analizlerinde yaygın olarak kullanılan bir
yöntemdir. Silikajel yüzeyine çeşitli şekillerde amino grupları bağlanması ile hazırlanan kolonlar
(amino kolon) yatışkın faz olarak kullanılır. Hareketli faz olarak da genellikle asetonitril-su (%50-85
asetonitril) karışımı, karbonhidrat ayrımında etkili bir şekilde kullanılabilir. Ayırım sırası
monosakkaritler ve şeker alkolleri, disakkaritler ve oligosakkaritler şeklindedir. Bu kolonların en
önemli dezavantajı, indirgen şekerlerin yatışkın fazdaki amino grupları ile reaksiyona girme eğilimi ve
bunun sonucu olarak kolon performansının zamanla azalmasıdır. Bu olumsuzluğu kısmen engellemek
için ise az miktarda çözünür amin bileşiği modifiye edici ajan olarak hareketli faz içerisine ilave edilir.
Modifiye edici bu ajanların en az iki amino grubu olup, bunlardan bir tanesi silikajel yüzeyine
adsorbsiyon için gereklidir. Diğerleri ise karbonhidrat analizi için serbest kalmalıdır. Modifiye edici
ajan hareketli faz içerisinde yer aldığından, kolon sürekli olarak rejenere edilmelidir.
Interaction : Adsorption
Packing materials : Polar ex.
Silica gel
Silica-NH2
Silica-CN
Silica-OH
Mobile phase :
Non-polar
ex.
n-Hex/CH2CL2
iso-Oct/IPA
iso-Oct/AcOEt
Sample :
Fat-soluble, Different polarity
6
Ters faz kromatografisinde yatışkın faz hidrofobik karakterde, hareketli faz ise büyük oranda sudur.
Hidrofobik yatışkın faz, C18 yada fenil kolonlar olabilir. Karbonhidrat analizinde bu yöntemin en
önemli dezavantajı, monosakkaritlerin kısa alıkonma süreleri dolayısıyla ayırımın iyi olmamasıdır.
Sodyum klorür vb tuzların ilavesi ile alıkonma süreleri uzatılarak, yöntem monosakkkarit analizi
açısından daha uygun hale getirilebilir. Ters faz kromatografisi ile karbonhidrat analizinde
anomerlerin varlığı dolayısıyla pikler üst üste gelebilir. Mobil faza amin ilave edilerek
anomerizasyonun (mutarotaston) hızlandırılması ile bu problemin önlenmesi sağlanır. Ancak kısa
süreli alıkonma süresi dolayısıyla ayırım negatif etkilenir.
Interaction : Hydrophobic
Packing materials : Non-polar
ex.
Silica-C18
Silica-C8
Polymer
Mobile phase :
Polar ex.
MeOH/H2O
CH3CN/H2O
MeOH/Buffer sol.
7
Sample :
Having different length of carbon chain
8
9
Boyut eleme kromatografisi (Size-Exclusion Chromatography, SEC), özellikle yüksek mol
kütleli türlere uygulanabilen güçlü bir tekniktir. Bu yöntemin ana uygulamalarından biri, büyük
polimer veya doğal ürünlerin mol kütlelerinin veya mol kütlesi dağılımlarının hızlı bir şekilde
tayinidir. SEC, karbonhidrat araştırmalarında, polisakkaritlerin moleküler kütle dağılımlarını
belirlemede en çok kullanılan yöntemlerdendir.
Son yılllarda karbonhidrat analizleri için popularitesi artan bir yöntem olan yüksek performanslı
anyon değiştirme kromatografisinde (HPAEC) anyonik karakterde bir yatışkın faz ile yüksek pH
değerine sahip bir hareketli faz kullanılmaktadır. Yüksek alkali ortamlarda (pH 10-14)
karbonhidratların hidroksil grupları iyonize olurlar ve böylece şekerlerin anyon değiştirme reçineleri
ile ayrılması sağlanır. Mono ve disakkaritlerin ayrılmasında hareketli faz olarak sodyum hidroksit,
daha yüksek moleküllü karbonhidratlarda ise iyonik gerilimi arttırmak amacıyla sodyum asetat içeren
çözeltiler kullanılır. Anyon değiştirme kromatografisi genellikle elektrokimyasal dedektörlerle birlikte
kullanılır. Şekil 3.1’de bu yöntemle elde edilmiş örnek bir kromatogram gösterilmektedir.
10
Şekil 3.1. HPAEC ile bazı şekerlerin ayırımını gösteren örnek kromatogram
Katyon değiştirme kromatografisinde mikroporoz yapıda polimerik reçineler yatışkın faz olarak
kullanılır. Yapılmak istenen ayrıma bağlı olarak reçine, çeşitli metal iyonları ile yüklenir. Bu amaçla
genellikle Ca2+, Pb2+ yada Ag+ kullanılır. Mobil faz olarak ise çeşitli oranda (genellikle <%40) metanol
ve/veya asetonitril gibi organik çözelti içeren su kullanılır. Ayırım işlemi yüksek sıcaklıklarda (>80˚C)
gerçekleştirilir. Böylelikle yatışkın ve hareketli faz arasındaki kütle transfer hızının arttırılması ile
kolon verimi yükselir ve daha iyi ayırım sağlanır. Katyon değiştirme reçineleri ile karbonhidrat ayırımı
azalan molekül ağırlık sırasına göre gerçekleşir. Buna göre polimerizasyon derecesi 3’den büyük olan
oligosakkaritler ilk ayrılır. Bunu trisakkaritler, disakkaritler, monosakkaritler ve alditoller izler. Bu
yöntemin en önemli avantajı monosakkaritlerin iyi bir şekilde ayrılabilmesidir (Şekil 3.2).
11
Şekil 3.2. Katyon değiştirme kromatografisi ile elma suyundaki şekerlerin ayırımı [Ca-form kolon
(Interaction CHO-620; 30 x 0.65 cm; 90˚C); hareketli faz, saf su (0.5 mL/dak); refraktif
indeksdedektör]
12
Karbonhidrat analizlerinde kullanılan başlıca dedektörler ise refraktif indeks ve elektrokimyasal
dedektörlerdir.
Refraktif indeks dedektörler, karbonhidrat analizlerinde yaygın olarak kullanılırlar. Refraktif indeks
ölçümleri geniş karbonhidrat konsantrasyonlarında lineer sonuç verip evrensel olarak tüm
karbonhidratlara uygulanabilirken, bu dedektörlerin bazı dezavantajları da vardır. Refraktif indeks
fiziksel bir özellik olduğundan akış koşullarının, basınç ve sıcaklığın değişimine karşı oldukça
duyarlıdır. Modern HPLC ekipmanları ve sıcaklık kontrollü dedektörler bu olumsuz değişimlerden
13
kaynaklanan problemleri minimize edebilirler. Bununla birlikte refraktif indeks dedektörlerin en
önemli sınırlayıcı faktörleri gradyen ayırım uygulanamaması ve düşük konsantrasyonlara karşı duyarlı
olmamalarıdır.
Elektrokimyasal dedektörler ise vurgulu amperometrik dedektör (Pulsed Amperometric Dedector,
PAD) olarak da adlandırılırlar ve yaygın olarak anyon değiştirme kromatografisi ile birlikte
kullanılırlar. Amperometrik ölçümler, elektrottaki bileşenin indirgenme yada yükseltgenmesi sonucu
akımda meydana gelen değişimin belirlenmesi temelinde gerçekleştirilir. Vurgulu amperometrik
dedektörlerde, karbonhidrat oksidasyonu sonucu akımda meydana gelen değişim altın yada platin
elektrotta ölçülür. Bu dedektörlerin avantajları çok düşük tespit limitleri yanında gradyen ayrıma da
uygun olması, dolayısıyla da ayırım koşullarının optimizasyonunda daha esnek çalışılabilmesine
olanak sağlamasıdır.
14
Post-kolon türevlendirme işlemi ile de karbonhidrat analizi gerçekleştirilebilir. Bu sistemde
öncelikle, ilave edilen çeşitli ajanlarla renkli bileşikler oluşturulur ve bunların konsantrasyonları da
UV yada floresans dedektörlerle ölçülür.
15
3.1.2.1. Gerekli Ekipman ve Çözeltiler
Glukoz, fruktoz ve sakaroz standart çözeltileri: Glukoz, fruktoz ve sakaroz stok çözeltileri, çeşitli
konsantrasyonlarda deiyonize su içerisinde hazırlanır. Stok çözeltilerden deiyonize su ile seyreltilerek
uygun konsantrasyonlarda standart çözeltiler elde olunur. HPLC sistemine enjeksiyonun ardından elde
edilen piklerin alanları veya yükseklikleri belirlenir. Kalibrasyon eğrileri, konsantrasyona karşılık pik
alanı yada yüksekliği baz alınarak hazırlanır (Şekil 3.3).
3.1.2.2. Meyvelerde ve meyve suyunda şeker analizi
Meyveler 1:1 oranında su ile karıştırılıp homojenize ve filtre edildikten sonra, meyve suyu örnekleri
ise direkt olarak 0.45 μm filtreden geçirilerek, aynı koşullarda HPLC kolonuna enjekte edilir.
Alıkonma süreleri kıyaslanarak tanımlanan herbir şekerin pik alanları belirlenir ve pik alanı x
16
konsantrasyon grafiklerinden konsantrasyon değerleri hesaplanır (Şekil 3.3). Meyvelerdeki şeker
mikarının belirlenmesinde seyreltmeler de dikkate alınmalıdır.
A4
Pik alanı
A3
Ax
A2
C1
C2
Cx C3
Konsantrasyon (%)
C4
Şekil 3.3. Konsantrasyona karşı pik alanının grafiğe geçirilmesiyle elde edilen kalibrasyon eğrisi
17
18
Glukoz
ALAN
(konsantrasyon) glukoz
Sakaroz
(konsantrasyon) ALAN sakaroz
Fruktoz
(konsantrasyon) ALAN fruktoz
% 0,1
292009
% 0,1
113045
% 0,1
248679
% 0,05
145651
% 0,05
60062
% 0,05
122754
% 0,025
77870
% 0,025
29583
% 0,025
66178
% 0,01
31564
% 0,01
12804
% 0,01
26665
Elma Suyu 1
83766
Elma Suyu 1
12567
Elma Suyu 1
192636
Elma Suyu 2
73635
Elma Suyu 2
11309
Elma Suyu 2
170732
19
350000
y = 3E+06x + 3605,8
R² = 0,9997
300000
250000
200000
150000
100000
GLUKOZ
50000
0
0
0,02
300000
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
y = 2E+06x + 2603
R² = 0,9996
250000
200000
FRUKTOZ
150000
100000
50000
0
0
120000
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
SAKAROZ
y = 1E+06x + 2275,4
R² = 0,9991
100000
80000
60000
40000
20000
0
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
20
glukoz
0,1
0,05
0,025
0,01
Elma suyu1
Elma suyu2
0,025
*100
2,50%
glukozala
n
sakaroz
sakarozalan fruktoz
fruktozalan
292009
0,1
113045
0,1
248679
145651
0,05
60062
0,05
122754
77870
0,025
29583
0,025
66178
31564
0,01
12804
0,01
26665
83766 Elma suyu1
73635 Elma suyu2
78700,5
0,009
*100
0,90%
12567 Elma suyu1
11309 Elma suyu2
11938
0,090
*100
9%
192636
170732
181684
Sonuçlar:
SAKAROZ: % 2.5, GLUKOZ: % 0.9, FRUKTOZ: % 9.
100 g meyve suyunda 2.5 g sakaroz, 0.9 g glukoz ve 9 g fruktoz vardır.
21