digene ® HPV Genotyping PS Testi Kullanma Talimatı

Transkript

digene® HPV Genotyping PS Testi
Kullanma Talimatı
96
İnsan papillomavirüs (HPV) tipleri 16, 18 ve 45'in kalitatif olarak
saptanması için. digene HC2 High-Risk HPV DNA Testiyle
kullanılmak üzere.
613615
QIAGEN
19300 Germantown Road
Germantown, MD 20874
A.B.D.
www.qiagen.com
QIAGEN GmbH
QIAGEN Strasse 1
40724 Hilden
ALMANYA
1058098TR Rev. 02
Sample & Assay Technologies
İçindekiler
Kullanım Amacı
6
Özet ve Açıklama
6
İşlemin Prensibi
7
Denatürasyon
7
Hibridizasyon
7
Hibrid yakalama
7
Hibrid saptama
7
Yıkama
7
Sinyal amplifikasyonu
7
Sağlanan Materyal
10
Kit içeriği
10
Gereken Ama Sağlanmayan Materyal
11
QIAGEN'den sağlanabilen ekipman ve materyal
11
PreservCyt örnek hazırlama için ek ekipman ve materyal
12
Uyarılar ve Önlemler
13
Uyarılar
13
Önlemler
15
Reaktif Saklama ve Muamele
17
Kit bileşenleri
17
Hazırlanan reaktifler
17
Numune Toplama ve Hazırlama
17
STM'de servikal örnekler
18
PreservCyt Solüsyonu içinde servikal numuneler
18
İşlem 19
Reaktif hazırlama
21
Örnek hazırlama
26
digene HPV Genotyping PS Testi Kullanma Talimatı
3
Protokol 1: Denatürasyon
27
Protokol 2: Prob karışımı ekleme
29
Protokol 3: Hibridizasyon ve hibrid yakalama
32
Protokol 4: Hibrid saptama
34
Protokol 5: Yıkama
36
Protokol 6: Sinyal amplifikasyonu
39
Protokol 7: Yakalama mikroplakalarını ölçme ve sonuç
oluşturma
40
Sonuçların Yorumlanması
41
Test sonuçları
41
Sorun Giderme kılavuzu
41
Kalite Kontrol
Test kalibrasyonu doğrulama
50
Prob spesifik kalite kontroller
52
Sınırlamalar
53
Performans Özellikleri
53
digene HPV Genotyping PS Testi ve doğrulanmış bir kantitatif
PCR HPV genotipleme testi arasında anlaşma
53
Analitik özgüllük
55
Tekrar Üretilebilirlik
56
STM ve PreservCyt numuneleri için DNA geri alınması
57
Çapraz reaktivite
57
Kan ve diğer maddelerin STM numunelerine etkisi
58
Kan ve diğer maddelerin PreservCyt numunelerine etkisi
59
Referanslar
Atıfta bulunulan referanslar
4
50
59
59
Semboller
61
İrtibat Bilgisi
61
Ek A: Kontaminasyon Değerlendirme İşlemleri
62
Saptama Reaktifi 2
62
Yıkama Aygıtı ve/veya su kaynağı
62
Automated Plate Washer
63
Ek B: Test Verileri Kaydetme Çalışma Sayfası
64
Sipariş Bilgisi
65
5
Kullanım Amacı
digene HPV Genotyping PS Testi pozitif bir digene HC2 High-Risk HPV DNA
Testi (13 yüksek riskli tipin kalitatif olarak saptanması) sonucu sonrasında
yüksek riskli HPV tipleri 16, 18 ve 45'in kalitatif olarak saptanması için
kullanılması amaçlanmış bir refleks testtir. Yüksek riskli HPV tipleri 16, 18 ve
45'in tanımlanması servikal kanser tarama programlarında hastaların klinik
takibine yardımcı olmak üzere ek bilgi sağlar.
digene HPV Genotyping PS Testiyle test edilebilecek servikal örnekler
arasında şunlar vardır:
 digene HC2 DNA Collection Device ile toplanan örnekler
 Süpürge tipi bir toplama cihazı veya fırça/spatül kombinasyon toplama
cihazıyla toplanıp sonra PreservCyt® Solüsyonuna yerleştirilen örnekler
Özet ve Açıklama
Dişi genital kanalında bazı HPV tiplerinin bulunması kondiloma, Bowenoid
papulosis ve servikal, vajinal ve vulvar intraepitelyal neoplazi ve karsinom dahil
olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkilidir (1–3). Genel olarak bu virüslerin
temelde cinsel yolla geçtiği kabul edilir ve yüksek riskli HPV tipleri servikal
kanser gelişmesi için temel tanınan risk faktörüdür (4–8).
İnsan papillomavirüsleri bir protein kapsidiyle sarılı 8000 baz çiftlik, çift iplikli
dairesel bir DNA molekülü içeren ikozahedral bir viral partikülden (virion)
oluşur. Epitelyal hücrelerin enfeksiyonundan sonra viral DNA epitelin tüm
kalınlığı boyunca yerleşir ama sağlam virionlar sadece dokunun üst
tabakalarında bulunur. Viral DNA lezyonun tipi ve derecesine bağlı olarak
virionlar veya epizomal ya da entegre HPV sekansları olarak bulunabilir.
Fizik inceleme yoluyla ve Pap yayma veya biyopsi örneklerinde viral
replikasyonla ilişkili karakteristik hücresel değişikliklerin varlığıyla anogenital
HPV enfeksiyonunun dolaylı bulguları görülebilir. Alternatif olarak biyopsiler
HPV DNA varlığını doğrudan saptamak üzere nükleik asit hibridizasyonu ile
analiz edilebilir.
Normal sitolojisi olan ve HPV 16 veya 18 için aynı zamanda pozitif test veren
kadınlarda 12 yıllık takip süresinde servikal intraepitelyal neoplazi (CIN) 3 veya
daha kötüsünün gelişme olasılığı sırasıyla %26,7 ve %19,1 olarak tahmin
edilmektedir (9). Ayrıca, HPV tipleri 16, 18 ve 45 skuamöz hücreli karsinom,
adenokarsinom ve adenoskuamöz hücreli karsinomda en sık bulunan
3 genotip olmuştur. Bu 3 HPV tipi birlikte skuamöz hücre karsinomu
6
vakalarının %75'i ve adenokarsinom vakalarının %94'ünde bulunmuştur (10).
Ayrıca HPV 18 veya 45 içeren tümörlerin diğer HPV tiplerini içeren tümörlere
göre 2 kat fazla ölüme neden olma olasılığı olduğu gösterilmiştir (11).
İşlemin Prensibi
digene HPV Genotyping PS Testi, Hybrid Capture® 2 (HC2) teknolojisi
kullanarak tipe spesifik oligoribonükleotidler, antikor yakalama ve kalitatif
kemilüminesans sinyal saptama kullanan bir in vitro nükleik asit hibridizasyon
testidir. Her servikal örnekte üçlü olarak yapılan test servikal örneklerde 3
yüksek riskli HPV DNA tipi (16, 18 ve 45) için genotipleme yapar.
Denatürasyon
Servikal örnekler virüsü parçalayıp hedef DNA'yı serbest bırakan bir baz
solüsyonla muamele edilir.
Hibridizasyon
Hedef HPV DNA spesifik RNA problarıyla hibridizasyona girip DNA–RNA
hibridleri oluşturur.
Hibrid yakalama
DNA–RNA hibridlerine spesifik ve bir mikroplaka kuyusunun yüzeyine
kaplanmış antikorlar DNA–RNA hibridlerini yakalar.
Hibrid saptama
Saptama Reaktifi 1 (DR1) eklenmesiyle immobilize edilmiş DNA–RNA
hibridleri, DNA–RNA hibridlerine spesifik alkalen fosfataz konjuge antikorlarla
reaksiyona girer. Her antikora birkaç alkalen fosfataz molekülü konjuge
edilmiştir ve her immobilize edilmiş DNA-RNA hibridine çok sayıda antikor
bağlanır ve böylece önemli bir sinyal amplifikasyonu olur.
Yıkama
DNA–RNA hibrid kompleksi bağlanmamış materyali gidermek üzere yıkanır.
Saptama Reaktifi 2 (DR2) eklenmesiyle substrat bağlanmış alkalen fosfatazla
yarılırken kemilüminesan reaksiyon oluşur. Saçılan ışık bir DML aletinde bağıl
7
ışık üniteleri (RLU) olarak ölçülür. Saçılan ışığın şiddeti örnekte hedef DNA
varlığını gösterir.
8
Hibrid Yakalama İş Akışı
Denatürasyon
Hibridizasyon
RNA probu
Tek iplikli DNA
DNA-RNA hibridi
Hibrid Yakalama
Hibrid saptama
Yıkama
9
Sağlanan Materyal
Kit içeriği
digene HPV Genotyping PS Test
(96)
Katalog no.
613615
Test sayısı*
96
HPV Negative Control 1 (HPV Negatif
Kontrol 1)
1 ml
HPV Positive Control 1 (HPV Pozitif
Kontrol 1)
1 ml
HPV Negative Control 2 (HPV Negatif
Kontrol 2)
1 ml
HPV Positive Control (HPV Pozitif
Kontrol 2)
1 ml
Denaturation Reagent (Denatürasyon
Reaktifi)
12 ml
Indicator Dye (Gösterge Boya)
0,35 ml
Probe Diluent (Prob Seyreltici)
5,5 ml
Detection Reagent 1 (Saptama Reaktifi 1)
12 ml
Detection Reagent 2 (Saptama Reaktifi 2)
12 ml
Wash Buffer x15 (Yıkama Tamponu x15)
2 x 100 ml
HPV 16 Probe ASR (HPV 16 Probu ASR)
110 µl
100 µl
* Test sonucu sayısı, her test yapılması için kontroller gerektiğinden kit başına kullanım
sayısına göre değişir. Denatüre edilmiş kontroller için izin verilen dondurma/çözme
döngüsü sayısı da kit başına kullanım sayısında bir faktör olabilir. Ek bilgi için bakınız
“İsteğe bağlı durma noktası”, sayfa 28.
10
5.5% NP-40 (%5,5 NP-40)
Capture Microplate (Yakalama
Mikroplakası)
100 µl
2 x 1,5 ml
1
Gereken Ama Sağlanmayan Materyal
Kimyasallarla çalışırken daima uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık
eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanın. Daha fazla bilgi için, ürün
tedarikçisinden elde edilebilecek uygun güvenlik veri sayfalarına (SDS'ler)
başvurun.
QIAGEN'den sağlanabilen ekipman ve materyal
 digene Hybrid Capture 2 Sistemi (“digene HC2 Sistemi”), bir QIAGEN
onaylı luminometre (“DML aleti”), QIAGEN onaylı kişisel bilgisayar ve
bilgisayar periferal donanımı (monitör, klavye, fare, yazıcı ve yazıcı
kablosu), digene HC2 System Software (“digene test analiz yazılımı”),
LumiCheck Plaka Yazılımı ve digene HC2 Sistem Yazılımı Kullanıcı El
Kitabından (digene HC2 System Software User Manual) oluşur
 Hybrid Capture System Rotary Shaker I
 Hybrid Capture System Automated Plate Washer
 Hybrid Capture System Multi-Specimen Tube (MST) Vortexer 2 (isteğe
bağlı)
 Hibridizasyon mikroplakaları
 Mikroplaka kapakları
 Ekstra uzun pipet uçları
 Tek kullanımlık reaktif rezervuarları
 DuraSealTM tüp mühürleyici film
 Plaka mühürleyiciler
11
Genel Laboratuvar Kullanımı Ekipmanı ve Aksesuarlar
 55 ± 2ºC sıcaklığı devam ettirebilen ve 1100 ± 100 devir/dk hızında
sallayabilen inkübatör sallayıcı
 Mikrosantrifüj
 Kap ataşmanlı vorteksleyici
 Tek kanallı pipet, 20–200 µl ve 200–1000 µl hacimler için değişken ayarlar
 Eppendorf® Repeater® pipet gibi tekrarlayan pozitif displasman pipeti
 8 kanallı pipet (çoklu kanallı); 25–200 µl hacimler için değişken ayarlar
 Süre Ölçer
 Sodyum hipoklorür çözeltisi, %0,5 h/h
 Parafilm® veya eşdeğeri
 Tek kanallı pipet (20–200 µl ve 200–1000 µl) için tek kullanımlık aerosol
bariyerli pipet uçları
 Tekrarlayan pozitif displasman pipeti (12,5, 5, 2,5 ve 1,25 ml) için tek
kullanımlık uçlar
 8 kanallı pipet (25–200 µl) için tek kullanımlık uçlar
 KimTowels® kağıt havluları veya eşdeğeri az tiftikli kağıt havlular
 Alkollü mendiller
 Tek kullanımlık tezgah örtüsü
 Pudrasız tek kullanımlık eldivenler
 1,5 ml ve/veya 5 ml yuvarlak altlı polipropilen tüpler
 Yüzen mikrosantrifüj tüp askısı
PreservCyt örnek hazırlama için ek ekipman ve materyal
digene HC2 Sample Conversion Kiti kullanma talimatına bakınız.
12
Uyarılar ve Önlemler
İn vitro diagnostik kullanım için.
Uyarılar
Kimyasallarla çalışırken daima uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık
eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanın. Daha fazla bilgi için, lütfen uygun
güvenlik veri sayfalarına (SDS'ler) başvurun. Bunlar çevrim içi olarak PDF
halinde www.qiagen.com/safety adresinde yer almaktadır ve kullanıcılar
burada her QIAGEN kiti ve kit bileşeni için SDS'yi bulabilir, okuyabilir ve
yazdırabilir.
Numuneler
DİKKAT: Numuneler enfeksiyöz ajanlar içerebilir ve uygun
şekilde muamele edilmelidir. Tüm numuneleri enfeksiyöz
olabilir olarak kabul edin.
Bilinen hiçbir test yöntemi numunelerin enfeksiyon bulaştırmayacağı
konusunda tam güvence veremez. İnsan numunelerine, uygun ulusal ve yerel
biyogüvenlik uygulamalarına göre muamele edilmesi önerilir. Enfeksiyöz
ajanlar içeren veya içermesinden şüphelenilen materyal ile bu biyogüvenlik
uygulamalarını kullanın.
Bu önlemler arasında verilenlerle sınırlı olmamak üzere şunlar vardır:
 Ağızla pipetlemeyin.
 Reaktifler veya numunelerin kullanıldığı yerlerde sigara içmeyin ve bir şey
yiyip içmeyin.
 Reaktifler veya numuneleri kullanırken tek kullanımlık, pudrasız eldivenler
giyin. Testi yaptıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın.
 Tüm numune döküntülerini %0,5 h/h sodyum hipoklorür gibi tüberkülosit
bir dezenfektan veya başka uygun bir dezenfektanla temizleyin ve
dezenfekte edin (12, 13).
 Numuneler, reaktifler ve diğer kontamine olmuş olabilecek materyali yerel
ve ulusal düzenlemelerle uyumlu olarak dekontamine edin ve atın.
Denatürasyon ve inkübasyon sonrasında numuneler artık enfeksiyöz kabul
edilmez (14); ancak laboratuvar personeli halen ulusal ve yerel önlemlere
uymalıdır.
13
Sodyum azit
Bazı reaktifler sodyum azit içerir. Sodyum azitin laboratuvar su borularında
kurşun veya bakır azid oluşturduğu bildirilmiştir. Bu azitler çekiçle vurma gibi
perküsyon durumunda patlayabilir. Kurşun veya bakır azit oluşumunu önlemek
için sodyum azit içeren solüsyonları attıktan sonra lavabolardan iyice su akıtın.
Azit biriktiğinden şüphelenilen eski lavabolardan kontaminasyonu gidermek
için A.B.D. Mesleki Güvenlik Sağlık İdaresi şunları önerir:
1. Alt kısımdan sıvıyı bir lastik veya plastik hortum kullanarak boşaltın.
2. %10 h/h sodyum hidroksit solüsyonuyla doldurun.
3. 16 saat bekleyin.
4. İyice su akıtın.
Bileşenler için güvenlik ve risk ifadeleri
digene HPV Genotyping PS Test kiti bileşenleri için aşağıdaki risk ve güvenlik
ifadeleri geçerlidir:
5.5% NP-40
Içerir: Ethoxylated nonylphenol. Uyarı! Hafif derecede deri tahrişine neden
olur. Uzun süreli etkilerle sudaki yaşam için zararlıdır. Çevreye yayılmasını
önleyiniz. İçerik/ kabı onaylanmış atık atım tesisine atınız.
Denaturation Reagent
Içerir: sodium hydroxide. Tehlike! Ciddi derecede deri yanıkları ve
göz hasarına neden olur. Metaller için aşındırıcı olabilir. İçerik/ kabı
onaylanmış atık atım tesisine atınız. GÖZE KAÇMIŞSA: Birkaç
dakika iyice suyla durulayınız. Eğer mevcut ve kolaysa kontak
lensleri çıkarınız. Durulamaya devam ediniz. DERİYE BULAMIŞSA
(ya da saça): Hemen tüm bulaşmış giyisileri çıkarınız. Deriyi suyla
yıkayınız. Hemen ZEHİR MERKEZİ veya doktora başvurunuz. Kilit
altında saklayınız. Koruma eldiveni/ koruyucu giysi/ göz koruması/
yüz koruması kullanınız.
Detection Reagent 1
Uzun süreli etkilerle sudaki yaşam için zararlıdır. Çevreye yayılmasını
önleyiniz.
HPV Negative Control 1
Uyarı! Hafif derecede deri tahrişine neden olur. Deride tahriş olursa: Tıbbi
yardım alınız.
HPV Positive Control 1
14
yardım alınız.
HPV Positive Control 2
yardım alınız.
HPV PS Negative Control
yardım alınız.
Probe Diluent
Içerir: acetic acid; Polyacrylic acid. Tehlike! Ciddi derecede deri
yanıkları ve göz hasarına neden olur. İçerik/ kabı onaylanmış atık
atım tesisine atınız. GÖZE KAÇMIŞSA: Birkaç dakika iyice suyla
durulayınız. Eğer mevcut ve kolaysa kontak lensleri çıkarınız.
Durulamaya devam ediniz. DERİYE BULAMIŞSA (ya da saça):
Hemen tüm bulaşmış giyisileri çıkarınız. Deriyi suyla yıkayınız.
Hemen ZEHİR MERKEZİ veya doktora başvurunuz. Kilit altında
saklayınız. Koruma eldiveni/ koruyucu giysi/ göz koruması/ yüz
koruması kullanınız.
Wash Buffer, 15x
Içerir: Sodium azide. Uyarı! Yutulması halinde zararlıdır. Hafif
derecede deri tahrişine neden olur. Uzun süreli etkilerle sudaki
yaşam için zararlıdır. Çevreye yayılmasını önleyiniz. İçerik/ kabı
onaylanmış atık atım tesisine atınız. Deride tahriş olursa: Tıbbi
yardım alınız. YUTULMASI HALİNDE: Hemen ZEHİR MERKEZİ
veya doktora başvurunuz. Koruma eldiveni/ koruyucu giysi/ göz
koruması/ yüz koruması kullanınız.
Ek bilgi
Güvenlik Veri Sayfaları: www.qiagen.com/safety
Önlemler
Kullanıcı digene HPV Genotyping PS Testini yaparken şu önlemlere daima
uymalıdır:
 Reaktifleri dış kutu etiketinde sembolü yanında belirtilen son kullanma
tarihi veya hazırlanmış reaktiflerin son kullanma tarihinden sonra
kullanmayın.
 Testi süre ve sıcaklık aralıklarının dışında gerçekleştirmek geçersiz
sonuçlara neden olabilir. Belirlenmiş süre ve sıcaklık aralıklarına girmeyen
testler geçersizdir ve tekrarlanmalıdır.
15
 digene HPV Genotyping PS Testi işlemi, test kalibrasyonu, kalite kontrol
ve sonuçların yorumlanmasına güvenilir test sonuçları elde etmek
açısından kesin olarak uyulmalıdır.
 Tam reaktif hacmini pipetlemek ve her reaktif eklendikten sonra iyice
karıştırmak önemlidir. Aksi halde hatalı test sonuçları oluşabilir. Belirtilen
renk değişikliklerinin olmasını sağlamak bu koşulların karşılandığını
doğrular.
 Kit bileşenleri bir ünite olarak test edilmiştir. Başka kaynaklardan veya
farklı lotlardan bileşenleri birbirleriyle değiştirmeyin.
 Nükleik asitler çevresel nükleaz degradasyonuna çok duyarlıdır. İnsan
cildinde ve insanların kullandığı materyal yüzeylerinde nükleazlar bulunur.
Tüm test adımlarını gerçekleştirirken çalışma yüzeylerini temizleyin tek
kullanımlık bir tezgah örtüsüyle örtün ve tek kullanımlık, pudrasız
eldivenler giyin.
 Servikal örnekler, numunelerdeki renk değişikliğini maskeleyebilen kan
veya başka biyolojik materyal içerebilir. Koyu renk gösteren numuneler
belirtilen renk değişikliğini vermeyebilir. Bu durumda renk değişikliğinin
görülmemesi test sonuçlarını etkilemez. Kontrollerde renk değişikliğini
gözleyerek uygun karıştırmayı doğrulayın.
 Test yapılırken yakalama mikroplakası ve DR2'nin eksojen alkalen
fosfatazla kontaminasyonunu önlediğinizden emin olun. Alkalen fosfataz
içerebilen maddeler arasında DR1, bakteriler, tükürük, saç ve ciltten yağlar
vardır. Yakalama mikroplakasını yıkama adımından sonra ve DR2
inkübasyonu sırasında örtmek, eksojen alkalen fosfataz DR2 ile
reaksiyona girebilip yalancı pozitif sonuçlar verebileceğinden özellikle
önemlidir.
 DR2'yi doğrudan ışığa uzun süreli maruz kalmadan koruyun. DR2'yi
bölüntü oluşturmadan hemen sonra kullanın ve doğrudan güneş ışığından
kaçının.
 Tekrarlayan pozitif displasman pipetinden reaktif iletiminden önce sıvı
geçirin ve düzenli olarak büyük hava kabarcıkları açısından kontrol yapın.
Pipet ucunda fazla miktarda büyük hava kabarcığı hatalı iletime neden
olabilir ve pipeti doldurup tüm sıvıyı dışarı verip tekrar doldurmakla bundan
kaçınılabilir. Spesifik kullanma talimatı için pipet kullanıcı el kitabına
başvurun.
 DR1 ve DR2 vermek için ters pipetleme tekniğini kullanarak çoklu kanal
pipetleme yapın (bakınız “Protokol 4: Hibrid saptama”, sayfa 34). Çoklu
16
kanal pipetinde her pipet ucunu uygun oturma ve dolma açısından kontrol
edin.
 Her yakalama mikroplakası kuyusunun iyice yıkandığından emin olun
(bakınız “Protokol 5: Yıkama”, sayfa 36). Yetersiz yıkama artmış arka alan
bulgularına yol açar ve yalancı pozitif sonuçlara neden olabilir. Yakalama
mikroplakası kuyularında kalan yıkama tamponu azalmış sinyal veya zayıf
tekrar üretilebilirliğe yol açabilir.
Reaktif Saklama ve Muamele
Kit bileşenleri
Alındığında kiti 2–8ºC'de saklayın. Yıkama Tamponu x15, Denatürasyon
Reaktifi ve Gösterge Boyası istenirse oda sıcaklığında (15–30ºC) saklanabilir.
Denatürasyon reaktifi (DNR) prob karışımları ve yıkama tamponu hariç tüm
reaktifler kullanıma hazır bir şekilde sağlanır.
Hazırlanan reaktifler
Hazırlandıktan sonra DNR 2–8ºC'de 3 ay stabildir.
Hazırlandıktan sonra yıkama tamponu 2–30ºC'de 3 ay stabildir.
Numune Toplama ve Hazırlama
digene HPV Genotyping PS Testi için test yapılmak üzere servikal örnekleri
aşağıdaki numune toplama cihazlarından birini kullanarak toplayın ve nakledin:
 digene HC2 DNA Collection Device [bir servikal fırça ve Örnek Taşıma
Ortamından (Sample Transport Medium, STM) oluşur]
 PreservCyt Solüsyonuna yerleştirilen süpürge tipi bir toplama cihazı veya
fırça/spatül kombinasyon toplama cihazı
Diğer toplama cihazlarıyla toplanan numuneler veya başka taşıma
ortamlarında taşınan numuneler bu testte kullanılmak üzere doğrulanmamıştır.
Bu testin performans özellikleri sadece belirtilen toplama cihazlarıyla
belirlenmiştir.
Ek numune toplama ve muamele işlemleri için digene HC2 DNA Collection
Device kullanma talimatına başvurun.
17
STM'de servikal örnekler
STM içinde toplanan servikal örnekler için digene HPV Genotyping PS Testiyle
test yapılması öncesinde örnek hazırlığı gerekmez.
digene HPV Genotyping PS Testi, digene HC2 High-Risk HPV DNA Testi için
bir refleks olduğundan STM örnekleri daha önce denatüre edilmiş olacaktır ve
testte “Protokol 2: Prob karışımı ekleme” kısmına ilerlemeye hazırdır. digene
HPV Genotyping PS Testini yapmak her denatüre STM numunesinden en az
225 µl bulunmalıdır.
PreservCyt Solüsyonu içinde servikal numuneler
PreservCyt örnekler için digene HPV Genotyping PS Testiyle test yapılması
öncesinde örnek hazırlığı gerekir.
Numuneleri rutin şekilde alın ve ThinPrep® Pap Testi lamlarını üretici
tarafından sağlanan talimata göre hazırlayın. Toplama sonrasında PreservCyt
numunelerini digene HPV Genotyping PS Testi için örnek hazırlama
öncesinde 2–30ºC'de 3 aya kadar saklayın. PreservCyt numuneleri
dondurulamaz.
digene HC2 Sample Conversion Kiti kullanarak örnek hazırlamanın sonucu
testte “Protokol 2: Prob karışımı ekleme” kısmına ilerlemeye hazır bir denatüre
örnektir.
18
İşlem
Başlamadan önce yapılacaklar
 İnkübatör sallayıcının soğuk başlangıçtan 55°C ± 2ºC'ye dengelenmesi
için en az 60 dakika bekleyin. Bu ısınma süresini beklememek hatalı test
sonuçlarına neden olabilir.
 Su banyosunun 65ºC'de olduğundan ve su düzeyinin tüplerdeki tüm sıvı
hacmini batırmaya yeterli olduğundan emin olun.
 Yeni bir “Test Verileri Kayıt Çalışma Sayfası” yazdırın ve şu bilgileri
kaydedin (bakınız “Ek B: Test Verileri Kaydetme Çalışma Sayfası”,
sayfa 64):
 Test yeri
 Test tarihi
 Kullanıcı Kimliği
 Çevre sıcaklığı
 digene HPV Genotyping PS Test kiti lot numarası
 Kontroller ve örnekler bir 8 mikroplaka kuyusu sütun konfigürasyonunda
çalışılır. “Test Verileri Kayıt Çalışma Sayfasını” mikroplaka kuyusu
konumlarındaki tüm gerekli kontroller ve örneklerin kimliklerini kaydederek
doldurun. Her test için kontroller mikroplakada şu pozisyonlarda test
edilmelidir (bakınız aşağıda Şekil 1):
 Negatif Kontrol 1 (NC1) replikatları mikroplaka kuyuları A1, B1 ve C1
içinde
 Pozitif Kontrol 1 (PC1) replikatları mikroplaka kuyuları D1, E1 ve F1
içinde
 Negatif Kontrol 2 (NC2) ve prob karışımı 16 mikroplaka kuyusu G1
içinde
 NC2 ve prob karışımı 18 mikroplaka kuyusu H1 içinde
 NC2 ve prob karışımı 45 mikroplaka kuyusu A2 içinde
 Pozitif Kontrol 2 (PC2) ve prob karışımı 16 mikroplaka kuyusu B2
içinde
 PC2 ve prob karışımı 18 mikroplaka kuyusu C2 içinde
 PC2 ve prob karışımı 45 mikroplaka kuyusu D2 içinde
19
Örnek
Şekil 1. Mikroplakada kontroller ve örneklerin pozisyonu.
20
Reaktif hazırlama
Başlamadan önce önemli noktalar
 Herhangi bir önceden denatüre edilmiş numuneler ve reaktifleri oda
sıcaklığına dengelemeden önce PreservCyt numunelerini hazırlayın.
 Numuneleri ve tüm gereken reaktifleri depodan teste başlamadan önce
çıkarın. 15–30 dakika boyunca 20–25ºC'ye gelmelerini bekleyin.
 Tüm hazırlanmış reaktifleri (aksi belirtilmedikçe) ve reaktif bölüntülerini test
sonunda atın.
 Test sayısına bağlı olarak her reaktif için gerekli hacmi belirlemek için
aşağıda Tablo 1 kısmını kullanın.
Tablo 1. Hazırlanan ve kullanıma hazır reaktiflerin gereken hacimleri
Test/strip
sayısı*
HPV 16
prob
karışımı
HPV 18
prob
karışımı
HPV 45
prob
Yıkama
karışımı tamponu
4/5
0,77 ml
0,56 ml
0,56 ml
8/5
0,91 ml
0,70 ml
12/8
1,05 ml
16/8
DR1
DR2
>1 litre
2,55 ml
2,55 ml
0,70 ml
>1 litre
3,45 ml
3,45 ml
0,84 ml
0,84 ml
>1 litre
4,35 ml
4,35 ml
1,19 ml
0,98 ml
0,98 ml
>1 litre
5,25 ml
5,25 ml
20/11
1,33 ml
1,12 ml
1,12 ml
>1 litre
6,15 ml
6,15 ml
24/11
1,47 ml
1,26 ml
1,26 ml
>1 litre
7,05 ml
7,05 ml
28/12
1,61 ml
1,40 ml
1,40 ml
>1 litre
7,95 ml
7,95 ml
* Test/strip sayısı HPV tip 16, 18 ve 45 için bir numunenin test edilmesini temel alır ve
kontroller için gerekli reaktif miktarını içerir.
21
Yakalama Mikroplakası
Yakalama mikroplakası bir plaka çerçevesinde 12 adet sekiz kuyulu yakalama
kuyusu stripi içerir. Test sırasında kullanılmayan her yakalama mikroplakası
kuyusunun plaka çerçevesinden çıkarılıp tekrar folyo ambalaja konması ve ek
testlerde kullanılabilmek üzere saklanması gerekir.
1. Bir gazlı kalemle yakalama mikroplakasını uygun bir tanımlayıcıyla
etiketleyin.
2. Doldurulmuş Test Verileri Kayıt Çalışma Sayfasına göre gereken
yakalama mikroplaka kuyusu sayısını belirleyin.
3. Yakalama mikroplakasını temiz KimTowels kağıt havluları veya
eşdeğer az tiftikli kağıt havlu üzerine yerleştirin.
4. Eldivenli bir parmak veya kalem üzerindeki silgiyi kullanarak
kullanılmayacak yakalama mikroplaka kuyusu striplerini plaka
çerçevesinden itin.
5. Çıkarılmış yakalama mikroplaka kuyusu striplerini tekrar folyo
ambalaja koyun, kapatın ve saklayın.
Not: Yakalama mikroplakası 2–8ºC'de saklanır.
Denatürasyon reaktifi
Denatürasyon Reaktifini kullanırken dikkatli olun. Uyarılar ve önlemler için
bakınız sayfa 13.
1. Denatürasyon Reaktifi şişesine 2 damla Gösterge Boyası ekleyin.
2. DNR'yi iyice karıştırın.
DNR homojen bir koyu mor renge sahip olmalıdır.
3. DNR'yi yeni son kullanma tarihiyle etiketleyin.
Notlar:
 Hazırlandıktan sonra DNR 2–8ºC'de 3 ay stabildir.
 Renk solarsa, 1 damla daha Gösterge Boyası ekleyin ve kullanmadan
önce iyice karıştırın.
Prob karışımları
Her numuneyi HPV tip 16, 18 ve 45 için test etmek her tip için belirli bir prob
karışımı ve numune başına toplam 3 prob karışımı gerektirir. 8 kontrol
mikroplaka kuyusu için kullanıldığından ek HPV 16 prob karışımı miktarı
22
gerekir. Her biri 2 kontrol mikroplaka kuyusu için kullanıldığından ek HPV 18
ve HPV 45 prob karışımları gerekir.
Her prob karışımını aşağıda tanımlandığı şekilde ayrı olarak hazırlayın.
 Prob karışımlarını “Protokol 1: Denatürasyon” sırasında hazırlayın (bakınız
sayfa 27).
 RNaz kontaminasyonunu önlemek için çok dikkatli olun. Probu pipetlerken
aerosol bariyeri pipet uçları kullanın.
 Prob Seyreltici visközdür. Prob karışımlarını hazırlarken görünür bir
vorteks elde edildiğinden emin olun; tam olmayan karıştırma azalmış
sinyale neden olabilir.
1. Probun flakon şişesine sıkışmasını önlemek için her prob flakonunu
flakon alt kısmına sıvı getirmek üzere kısa süre santrifüje edin.
2. Karıştırmak için flakona hafifçe vurun.
3. 1:24:10 prob seyreltme için gereken hacimleri belirleyin: Prob
Seyreltici: %5,5 NP-40, prob karışımını hazırlamak için.
Not: Mikroplaka kuyusu başına 35 µl prob karışımı gereklidir.
Öneri: Flakon yanında veya pipet uçlarında kaybedilebilecek hacim için
ekstra prob karışımı hazırlayın. Önerilen ekstra hacmi içeren önerilen
hacimleri (bakınız Tablo 1, sayfa 21) kullanın.
4. Yeni, tek kullanımlık bir kabı uygun şekilde etiketleyin.
Test sayısına bağlı olarak 1,5 ml veya 5 ml yuvarlak altlı bir polipropilen
tüp önerilir.
5. Gereken miktarda Prob Seyrelticiyi (bakınız aşağıda Tablo 2)
etiketlenen tüpe pipetleyin.
6. Gereken miktarda probu Prob Seyrelticiye (bakınız aşağıda Tablo 2)
pipet ucunu tüpün iç duvarına karşı menisküsün hemen üzerine
yerleştirip içindekileri dışarı vererek pipetleyin.
Önemli: Pipet ucunu Prob Seyreltici içine batırmayın.
23
7. Gereken %5,5 NP-40 miktarını (bakınız aşağıda Tablo 2) etiketlenen
tüpe pipetleyin.
Tablo 2. Prob karışımı hazırlama
Gereken prob
karışımı hacmi
Prob Seyreltici
Hacmi
Prob hacmi
%5,5 NP-40
hacmi
0,56 ml
384 µl
16 µl
160 µl
0,70 ml
480 µl
20 µl
200 µl
0,77 ml
528 µl
22 µl
220 µl
0,84 ml
576 µl
24 µl
240 µl
0,91 ml
624 µl
26 µl
260 µl
0,98 ml
672 µl
28 µl
280 µl
1,05 ml
720 µl
30 µl
300 µl
1,12 ml
768 µl
32 µl
320 µl
1,19 ml
816 µl
34 µl
340 µl
1,26 ml
864 µl
36 µl
360 µl
1,33 ml
912 µl
38 µl
380 µl
1,40 ml
960 µl
40 µl
400 µl
1,47 ml
1008 µl
42 µl
420 µl
1,61 ml
1056 µl
44 µl
440 µl
8. İyice karıştırmak için maksimum hızda en az 5 saniye vorteksleyin.
Görünür bir vorteks oluşmalıdır.
24
Yıkama tamponu
 Yıkama tamponunu “Protokol 3: Hibridizasyon ve hibrid yakalama”
sırasında hazırlayın (bakınız sayfa 32).
 Manuel mikroplaka yıkama yöntemi için Yıkama Aygıtında 3 litre yıkama
tamponu hazırlayın.
Öneri: Bakteri ve küflerde bulunan alkalen fosfatazla olası
kontaminasyonu önlemek için 3 ayda bir Yıkama Aygıtı ve tüpü %0,5
sodyum hipoklorür solüsyonuyla yıkayın ve distile veya deiyonize suyla
iyice durulayın.
 Automated Plate Washer için yıkama tamponunu hazırlayıp kapaklı bir
kapta saklayın veya 1 litre hazırlayıp Automated Plate Washer yıkama
rezervuarına yerleştirin.
1. Yıkama Tamponu x15 kuyusunu karıştırın ve gerekli Yıkama
Tamponu x15 hacmini (bakınız aşağıda Tablo 3) belirtilen kaba
ekleyin.
2. Gerekli distile veya deiyonize su hacmini (bakınız aşağıda Tablo 3)
belirtilen kaba ekleyin.
Tablo 3. Yıkama tamponu hazırlama
Gerekli yıkama
tamponu hacmi
Yıkama Tamponu x15
Hacmi
Distile veya deiyonize
su hacmi
1 litre
67 ml
933 ml
1,5 litre
100 ml
1400 ml
2 litre
133 ml
1867 ml
3 litre
200 ml
2800 ml
3. Kabın herhangi bir açıklığı üzerine temiz, az tiftikli kağıt havlu
yerleştirin ve iyice karıştırın.
4. Kabı uygun olduğu şekilde mühürleyin veya ilgili alete yerleştirin.
5. Yıkama tamponunu yeni son kullanma tarihiyle etiketleyin.
Not: Hazırlandıktan sonra yıkama tamponu 2–30ºC'de 3 ay stabildir.
25
Örnek hazırlama
PreservCyt örnekler için digene HPV Genotyping PS Testiyle test yapılması
öncesinde örnek hazırlığı gerekir. digene HPV Genotyping PS Testi HPV
tip 16, 18 ve 45 testi yapmak için 225 µl hazırlanmış örnek gerektirir. Bu testi
yapmak için uygun şekilde saklanmış ve daha önce hazırlanmış PreservCyt
örnekleri kullanılabilir. Yetersiz miktarda hazırlanmış PreservCyt örneği varsa
testi yapmak için minimum 6 ml PreservCyt numunesi hazırlanmalıdır.
PreservCyt numuneleri için manuel örnek hazırlama açısından digene
HC2 Sample Conversion Kiti kullanma talimatına başvurun.
digene HC2 Sample Conversion Kiti kullanarak örnek hazırlamanın sonucu
testte “Protokol 2: Prob karışımı ekleme” kısmına ilerlemeye hazır bir denatüre
örnektir (bakınız sayfa 29). Kontrolleri “Protokol 1: Denatürasyon” uyarınca
ayrı olarak hazırlayın (bakınız sayfa 27).
26
Protokol 1: Denatürasyon
digene HPV Genotyping PS Testi için gerekli kontroller aşağıdaki talimata göre
denatüre edilir.
 STM numunelerini “Protokol 1: Denatürasyon” uyarınca denatüre etmeyin.
STM numuneleri daha önce digene HC2 High-Risk HPV DNA Testiyle test
yapılmasının sonucu olarak denatüre edilmiştir ve testte “Protokol 2: Prob
karışımı ekleme” kısmına ilerlemeye hazırdır.
 PreservCyt numuneleri veya örneklerini “Protokol 1: Denatürasyon”
uyarınca denatüre etmeyin. PreservCyt numunelerinin denatürasyonu
örnek hazırlamanın bir parçası olarak yapılır. Hazırlanmış PreservCyt
örnekleri testte “Protokol 2: Prob karışımı ekleme” kısmına ilerlemeye
hazırdır.
 Bu protokolü uygularken kontrolleri dökmemeye veya DNR'yi
sıçratmamaya dikkat edin. DNR'nin kontrol tüpüne eklenmesi sıvı en üste
yakın olacak şekilde tüpü doldurur. Uyarılar ve önlemler için bakınız sayfa
13.
 Su banyosunda tüplerin tüm hacmini batırmaya yeterli su olduğundan
emin olun.
 Yalancı pozitif sonuçlardan kaçınmak için tüm kontrol materyalinin DNR ile
temas etmesi çok önemlidir.
1. NC1, PC1, NC2 ve PC2 kapaklarını etiketleyin.
Kapaklar kontrol tüplerini kapatmak için tekrar kullanılacaktır.
2. NC1, PC1, NC2 ve PC2'den kapakları çıkarın ve kapakları olası
kontaminasyondan uzağa yerleştirin.
3. Her ekleme için yeni bir pipet ucuyla tek kanallı bir pipet kullanarak
her kontrol tüpüne 500 µl DNR'yi pipet ucunu sıvı yüzeyinin altına
yerleştirip verme yoluyla verin.
4. Her ilgili kontrole kapağı tekrar takın ve tüpü kapatın.
Kontaminasyon veya dökülmeden kaçınmak için kapakların çevrilerek
sıkıca kapatıldığından emin olun.
27
5. Her tüpü puls vorteksleme ile ayrı ayrı yüksek hızda en az 30 saniye
iyice karıştırın.
Önemli: DNR eklemekten sonra karıştırma kritik bir adımdır.
6. Tüpleri 65 ± 2ºC su banyosunda 45 ± 5 dakika yüzen bir mikrosantrifüj
tüp askısı içinde inkübe edin.
Bu inkübasyon sırasında gereken prob karışımlarını hazırlayın (bakınız
“Reaktif hazırlama” sayfa 21).
7. İnkübasyondan sonra tüpleri su banyosundan çıkarın.
Denatüre edilmiş kontrollere şunlar yapılabilir:
 Hemen test edilebilirler (“Protokol 2: Prob karışımı ekleme” sayfa 29
kısmına ilerleyin)
 Saklanabilirler (bakınız “İsteğe bağlı durma noktası” sayfa 28)
İsteğe bağlı durma noktası
Önemli: Denatüre numuneler veya kontrolleri kuru buzda saklamayın veya
göndermeyin.
Denatüre edilmiş kontroller 2–8ºC'de gece boyunca veya aşağıdakilere göre
–20ºC'de saklanabilir:
 4 haftaya kadar saklama için maksimum bir dondurma/çözme döngüsü
yapılabilir.
 9 güne kadar saklama için maksimum 3 dondurma/çözme döngüsü
yapılabilir.
Her dondurma/çözme döngüsü için çözme döngüsü sırasında oda sıcaklığında
maksimum 2 saat beklenebilir.
28
Protokol 2: Prob karışımı ekleme
 Prob karışımı visközdür. Prob karışımının iyice karıştırıldığından ve her
hibridizasyon mikroplaka kuyusuna gerekli miktarın tamamen verildiğinden
emin olun.
 Kontroller ve örnekleri hibridizasyon mikroplakasına aktarırken şunlara
uyun:
 Örnekler dikkatli şekilde aktarılmazsa yalancı pozitif sonuçlar
oluşabileceğinden hibridizasyon mikroplakası kenarlarına
dokunmaktan kaçının.

Hava kabarcıklarının oluşumunu sınırlayın.
 Çapraz kontaminasyondan kaçınmak açısından her aktarma için
temiz, ekstra uzun bir pipet ucu kullanın.
 Denatüre edilmiş kontroller veya örnekler saklanmışsa 20–25ºC'ye
dengelenmelerini bekleyin.
 STM veya PreservCyt örnekleri bir örnek askısında saklanmışsa ve
vorteksleme için MST Vortexer 2 kullanılacaksa tüplerden kapakları çıkarın
ve atın.
1. Bir hibridizasyon mikroplakası alıp etiketleyin.
2. Kontrol ve örnek tiplerini aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak
vorteksleyin:
Vorteksleyici ile herhangi bir örnek tüpü
Her tüpü ayrı olarak maksimum hız ayarında en az 5 saniye vorteksleyin.
MST Vortexer 2 ile STM örnekleri
a. Geçerli olduğu şekilde tüpleri DuraSeal tüp mühürleyici filmle kapatın
ve askı kapağını numune askısında sabitleyin.
b. Numune askısını maksimum hız ayarında en az 5 saniye vorteksleyin.
c. Numune askısını hemen tezgah üstüne koyun ve sürgüleri serbest
bırakın. Askı kapağını yaklaşık 1 cm kaldırın ve DuraSeal tüp
mühürleyici filme yapışmış olabilecek herhangi bir tüpü serbest
bırakmak üzere hafifçe sola ve sağa hareket ettirin. Askı kapağını
29
numune askısından açıkta oluncaya kadar düz yukarı kaldırarak
çıkarın.
d. DuraSeal tüp mühürleyici filmi askı kapağından dikkatle soyarak
çıkarın ve atın.
MST Vortexer 2 ile PreservCyt örnekleri
a. Geçerli olduğu şekilde tüpleri DuraSeal tüp mühürleyici filmle kapatın
ve askı kapağını numune askısında sabitleyin.
b. Numune askısını maksimum hız ayarında en az 10 saniye
vorteksleyin.
c.
Numune askısını hemen tezgah üstüne koyun ve sürgüleri serbest
bırakın. Askı kapağını yaklaşık 1 cm kaldırın ve DuraSeal tüp
mühürleyici filme yapışmış olabilecek herhangi bir tüpü serbest
bırakmak üzere hafifçe sola ve sağa hareket ettirin. Askı kapağını
numune askısından açıkta oluncaya kadar düz yukarı kaldırarak
çıkarın.
d. DuraSeal tüp mühürleyici filmi askı kapağından dikkatle soyarak
çıkarın ve atın.
3. Ekstra uzun pipet uçlu tek kanallı bir pipet kullanarak her kontrol
veya örnekten 75 µl miktarını Test Verileri Kayıt Çalışma Sayfasına
göre boş hibridizasyon mikroplakasının altına aktarın.
Geçerli olduğu şekilde kalan hacmi aşağıdaki talimata göre saklayın:
 Denatüre edilmiş kontrollere orijinal kapakları tekrar takın ve “İsteğe
bağlı durma noktası”, sayfa 28 içinde ayrıntıları verilen sınırlara göre
saklayın.
 STM örneklerine yeni numune toplama tüpü vidalı kapakları takın ve
digene HC2 High-Risk HPV DNA Testi kullanma talimatındaki talimata
göre saklayın.
 PreservCyt örneklerine yeni bir kapak takın ve digene HC2 Sample
Conversion Kiti kullanma talimatındaki talimata göre saklayın.
4. Son örneği aktardıktan sonra hibridizasyon mikroplakasını bir
mikroplaka kapağıyla örtün ve 20–25ºC'de 10 dakika inkübe edin.
5. Prob karışımlarını iyice vorteksleyin.
30
6. Uygun prob karışımından 35 µl miktarını tek kanallı veya tekrarlayan
pozitif displasman pipeti ve her prob karışımı ekleme için yeni bir uç
kullanarak her hibridizasyon mikroplaka kuyusuna dikkatle
pipetleyin.
Geriye sıçramadan ve hibridizasyon mikroplaka kuyularının kenarlarına
dokunmaktan kaçının.
7. Hibridizasyon mikroplakasını bir mikroplaka kapağı veya plaka
mühürleyici ile örtün ve Rotary Shaker I aletinde 800 ± 100 devir/dk
hızında 3 ± 2 dakika sallayın.
8. Hibridizasyon mikroplakasını Rotary Shaker I aletinden çıkarın.
Mikroplaka kapağını çıkarın ve temiz bir yüzeye koyun.
Salladıktan sonra kontroller ve STM örnekleri sarıya dönmeli ve
PreservCyt örnekleri pembeye dönmelidir.
Mor kalan örnekler uygun miktarda prob karışımı olmamış olabilir. Mor
kalan örneklere uygun prob karışımından 35 µl daha ekleyin ve Rotary
Shaker I aletinde 800 ± 100 devir/dk hızında 3 ± 2 dakika daha sallayın.
Bir örnek bu işlemden sonra mor kalırsa numuneyi tekrar test edin.
9. “Protokol 3: Hibridizasyon ve hibrid yakalama”, sayfa 32 kısmına
ilerleyin.
31
Protokol 3: Hibridizasyon ve hibrid yakalama
1. Hibridizasyon mikroplakasını yakalama mikroplakasının yanına
yerleştirin.
2. 8 kanallı bir pipet kullanarak hibridizasyon plaka kuyularının tüm
içeriğini (yaklaşık 110 µl) karşılık gelen yakalama mikroplakası
kuyularının altına aktarın.
Her transfer için yeni pipet uçları kullanın ve tam örnek transferi sağlamak
üzere her pipet ucunun boşalmasını bekleyin. İsterseniz pipeti pipet
uçlarının ortasını yakalama mikroplaka kuyularının üst kenarına dayayarak
sabitleyin (bakınız aşağıda Şekil 2)
Not: Az miktarda örnek için 8 kanallı pipet yerine 20–200 µl pipet uçlu tek
kanallı bir pipet kullanılabilir. Her transfer için yeni pipet uçları kullanın.
Doğru
Geriye
sıçramadan
kaçınmak
için dikey
pipetlemeyin.
Pipet ucunun
mikroplaka
kuyusunun
yanına
dokunmasına
izin vermeyin.
Şekil 2. Doğru pipetleme tekniği.
3. Yakalama mikroplakasını yeni bir plaka mühürleyici ile örtün ve
yakalama mikroplakasını 1100 ± 100 devir/dk hızıyla 120 ± 5 dakika
55 ± 2ºC'ye dengelenmiş bir inkübatör sallayıcıda inkübe edin.
4. İnkübasyon tamamlandığında yakalama mikroplakasını inkübatör
sallayıcıdan çıkarın ve plaka mühürleyiciyi dikkatle çıkarın.
32
5. Sıvıyı yakalama mikroplaka kuyularından bir lavaboya dökerek
giderin; yakalama mikroplakasını lavabo üzerinde tamamen ters
çevirin ve aşağıya doğru bir hareketle iyice sallayın.
Önemli: Plakayı tekrar düz çevirmeyin.
Lavabonun altına çok yakından dökerek geri sıçramaya neden
olmadığınızdan emin olun.
6. Temiz KimTowels kağıt havluları veya eşdeğer az tiftikli kağıt havlu
ile 2–3 kez sıkıca dokunarak sıvıyı giderin.
Yakalama mikroplaka kuyularından tüm sıvının giderildiğinden ve
yakalama mikroplakasının üstünün kuru olduğundan emin olun.
7. “Protokol 4: Hibrid saptama”, sayfa 34 kısmına ilerleyin.
33
Protokol 4: Hibrid saptama
 8 kanallı bir pipet kullanarak soldan sağa yönde yakalama mikroplakası
boyunca reaktif eklemelerini yapın. Yakalama mikroplakasına iletmeden
önce fazla reaktifi gidermek için pipet uçlarını tek kullanımlık reaktif
rezervuarında silin.
 8 kanallı pipet kullanılmıyorsa, uygun bir tekrarlayan pozitif displasman
pipeti onun yerine kullanılabilir. DR1'i gerekli hacmi tutmaya yetecek
büyüklükte bir polipropilen tüp içine bölüntüleyin.
 Reaktif iletme tutarlılığını arttırmak üzere ters pipetleme tekniğinin
kullanılması önerilir. İşlem aşağıda tanımlanmıştır.
 İsterseniz pipeti pipet uçlarının ortasını yakalama mikroplaka kuyularının
üst kenarına dayayarak sabitleyin. Numunelerin çapraz kontaminasyonu
oluşabileceğinden yakalama mikroplaka kuyularının yanlarına
dokunmadığınızdan emin olun (bakınız Şekil 2, sayfa 32).
1. DR1'i iyice karıştırın ve uygun hacmi (bakınız Tablo 1, sayfa 21) temiz,
tek kullanımlık bir reaktif rezervuarına dikkatle ölçüp koyun.
2. Her yakalama mikroplaka kuyusuna ters pipetleme tekniğini
kullanarak aşağıdaki gibi 75 µl DR1'i dikkatle pipetleyin:
a. 8 kanallı pipete uçları takın; tüm uçların sıkıca oturduğundan emin
olun.
b. Pipet pistonunu birinci durma noktasının ötesine ikinci durma
noktasına itin.
c.
Uçları reaktife batırın.
d. Pistonu yavaşça serbest bırakın ve reaktifin uçları doldurmasını
bekleyin.
e. Reaktifi mikroplaka kuyularına pistonu birinci durma noktasına iterek
verin. Pistonu pipet uçları tekrar reaktif içine batmadan serbest
bırakmayın.
f.
Tüm mikroplaka kuyuları doluncaya kadar uçları tekrar doldurun ve
tekrarlayın.
Pembe renk şiddetini gözleyerek tüm yakalama mikroplaka kuyularının
dolduğunu doğrulayın. Tüm yakalama mikroplaka kuyularında benzer bir
pembelik şiddeti olmalıdır.
34
3. Yakalama mikroplakasını bir mikroplaka kapağı, temiz Parafilm veya
eşdeğeriyle örtün ve 20–25ºC'de 30–35 dakika inkübe edin.
4. “Protokol 5: Yıkama”, sayfa 36 kısmına ilerleyin.
35
Protokol 5: Yıkama
Yakama mikroplakasını aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak yıkayın.
Automated Plate Washer yöntemi
Automated Plate Washer'ın gücünü daima AÇIK olarak tutun. Automated Plate
Washer sistemi temizlemek için rutin olarak durular. Daha ileri talimat için
Otomatik Plaka Yıkayıcı Kullanıcı El Kitabına (Automated Plate Washer User
Manual) başvurun.
 Yıkama rezervuarının en az 1 litre yıkama tamponuyla doldurulmuş
olduğunu doğrulayın. Değilse, yıkama tamponunu hazırlayın (bakınız
“Reaktif hazırlama”, sayfa 21).
 Durulama rezervuarının deiyonize veya distile suyla doldurulmuş olduğunu
doğrulayın.
 Atık rezervuarının boş ve kapağın sıkıca takılmış olduğunu doğrulayın.
 Automated Plate Washer her yıkamadan önce otomatik olarak sıvı
doldurur ve her yıkamadan sonra durulama yapar.
 Automated Plate Washer sadece tam stripleri yıkar ve kuyuları veya
stripleri atlayamaz. Sadece kısmi bir yakalama mikroplaka kuyusu stripi
kullanılıyorsa, yıkama öncesinde stripi tamamlamak için boş mikroplaka
kuyularını plaka çerçevesine yerleştirin. Yıkanan tüm striplerde mikroplaka
kuyuları bulunmalıdır.
1. Yakalama mikroplaka kapağı, temiz Parafilm veya eşdeğerini çıkarın
ve yakalama mikroplakasını Automated Plate Washer platformuna
yerleştirin.
2. Automated Plate Washer'ın AÇIK olduğunu ve ekranın “Digene Wash
Ready” (Digene Yıkamaya Hazır) veya “P1” gösterdiğini doğrulayın.
3. Yıkanacak strip sayısını “Rows” (Sıralar) sütununa basıp ayarlamak
için seçin ve “+” veya “–” kullanın.
4. “Digene Wash Ready” veya “P1” kısmına dönmek için “Rows”
tuşuna basın.
36
5. Başlamak için “Start/Stop” (Başlat/Durdur) kısmına basın.
Automated Plate Washer her döngü yaklaşık 10 dakika sürecek şekilde 6
doldurma ve aspirasyon döngüsü gerçekleştirecektir. Program sırasında
kısa süre duraklama olacaktır; yakalama mikroplakasını erken çıkarmayın.
Automated Plate Washer yıkaması bittiğinde “Digene Wash Ready” veya
“P1” gösterecektir.
6. Program bittiğinde yakalama mikroplakasını Automated Plate Washer
platformundan çıkarın.
Yakalama mikroplaka kuyuları beyaz kalmalı ve yakalama mikroplaka
kuyularında kalan pembe sıvı bulunmamalıdır.
7. “Protokol 6: Sinyal amplifikasyonu”, sayfa 39 kısmına ilerleyin.
Manuel Plaka Yıkama
Başlamadan önce yapılacaklar: Yıkama Aygıtının en az 1 litre yıkama
tamponuyla doldurulmuş olduğunu doğrulayın.
1. Yakalama mikroplakası kapağı, temiz Parafilm veya eşdeğerini
çıkarın.
2. Yakalama mikroplakasının üstüne temiz KimTowels kağıt havluları
veya eşdeğer az tiftikli kağıt havlu üzerine yerleştirin.
3. Kağıt havluların yakalama mikroplakasının tüm yüzey alanına temas
ettiğinden emin olun ve yakalama mikroplakasını dikkatle ters çevirin.
4. Yakalama mikroplakasının 1–2 dakika boşalmasını bekleyin.
5. Yakalama mikroplakasını temiz KimTowels kağıt havluları veya
eşdeğer az tiftikli kağıt havlu üzerinde dokunarak sıvıyı giderin.
Alkalen fosfataz kontaminasyonundan kaçınmak için kullanılmış kağıt
havluları dikkatle atın.
37
6. Yıkama Aygıtını kullanarak yakalama mikroplakasını manuel olarak 6
kez yıkayın.
Uygun şekilde yıkamak için her yakalama mikroplakası kuyusunu yıkama
tamponuyla taşacak şekilde doldurun. Bu işlem yakalama mikroplaka
kuyularının üstlerinden DR1'i giderecektir. Yıkama yakalama mikroplakası
A1'de başlar ve sağa ve aşağıya olmak üzere yılan şeklinde devam eder.
Tüm yakalama mikroplaka kuyuları dolduğunda sıvıyı lavaboya kuvvetli
aşağıya doğru hareketle boşaltın. İkinci yıkama yakalama mikroplaka
kuyusu H12'de başlar ve sola ve yukarıya yılan gibi hareketle devam eder.
Bu 2 yıkama dizisi 2 kez daha tekrarlanarak tolam 6 yakalama
mikroplakası yıkanması yapılır.
7. Yıkanma sonrasında yakalama mikroplakasını temiz KimTowels kağıt
havluları veya eşdeğer az tiftikli kağıt havlu üzerine ters çevirerek ve
3–4 kez kuvvetle vurarak sıvıyı giderin. Kağıt havluları değiştirip
tekrar sıvıyı giderin.
8. Yakalama mikroplakası ters çevrilmiş olarak 5 dakika boşalmasını
bekleyin. Kağıt havluları değiştirip tekrar sıvıyı giderin.
Yakalama mikroplakası beyaz görünmeli ve yakalama mikroplaka
kuyularında kalan pembe sıvı bulunmamalıdır.
9. “Protokol 6: Sinyal amplifikasyonu”, sayfa 39 kısmına ilerleyin.
38
Protokol 6: Sinyal amplifikasyonu
 DR2 kullanmak için yeni bir pudrasız, tek kullanımlık eldiven çifti kullanın.
 8 kanallı bir pipet kullanarak soldan sağa yönde yakalama mikroplakası
boyunca reaktif eklemelerini yapın.
 8 kanallı pipet kullanılmıyorsa, uygun bir tekrarlayan pozitif displasman
pipeti onun yerine kullanılabilir. DR2'yi gerekli hacmi tutmaya yetecek
büyüklükte bir polipropilen tüp içine bölüntüleyin.
 DR2'yi kesintisiz olarak ekleyin. Tüm yakalama mikroplaka kuyularının
inkübasyon süresi mümkün olduğunca aynı olmalıdır.
 Numunelerin çapraz kontaminasyonu oluşabileceğinden yakalama
mikroplaka kuyularının yanlarına dokunmamaya veya pipet uçlarına reaktif
sıçratmamaya dikkat edin (bakınız Şekil 2, sayfa 32).
1. DR2'yi iyice karıştırın ve uygun hacmi (bakınız Tablo 1, sayfa 21)
temiz, tek kullanımlık bir reaktif rezervuarına ölçüp koyun.
2. Her mikroplaka kuyusuna daha önce tanımlanan ters pipetleme
tekniğini kullanarak 75 µl DR2 pipetleyin (bakınız “Protokol 4: Hibrid
saptama”, sayfa 34).
Sarı renk şiddetini gözleyerek tüm yakalama mikroplaka kuyularının doğru
şekilde doldurulduğunu doğrulayın; tüm yakalama mikroplaka kuyularının
benzer bir sarılık şiddeti olmalıdır.
3. Yakalama mikroplakasını bir mikroplaka kapağıyla örtün ve
20–25ºC'de 15 dakika inkübe edin (en fazla 30 dakika inkübasyon).
Doğrudan güneş ışığından kaçının.
4. “Protokol 7: Yakalama mikroplakalarını ölçme ve sonuç oluşturma”,
sayfa 40 kısmına ilerleyin.
39
Protokol 7: Yakalama mikroplakalarını ölçme ve sonuç
oluşturma
1. İnkübasyon tamamlandıktan sonra yakalama mikroplakasını DML
aletinin ham veri ölçme işlemini kullanarak ölçün.
Bir yakalama mikroplakasını ölçmenin ayrıntıları için ilgili yazılım kullanıcı
el kitabına başvurun.
2. Ham veri raporunu yazdırın.
Önemli: Ham veri raporu ölçümden sonra yazdırılmalıdır. Ham veri raporu
digene test analiz yazılımı kullanılarak kaydedilemez.
3. Ham veri raporunu Test Verileri Kayıt Çalışma Sayfası içinde belirtilen
bilgiyi kullanarak uygun şekilde etiketleyin.
4. Bir ham yakalama mikroplakası kullanılmadıysa, kullanılmış yakalama
mikroplaka kuyularını plaka çerçevesinden çıkarın, plaka çerçevesini
distile veya deiyonize suyla iyice durulayın, kurutun ve sonraki test
için ayırın.
5. Tüm kullanılmış bölüntüler ve hazırlanmış reaktifleri aksi
belirtilmedikçe atın.
40
Sonuçların Yorumlanması
digene HPV Genotyping PS Testi kesme noktası (CO) HPV 16, 18, 45
plasmidlerinin 5.000 kopyasına karşılık gelir.
Önemli: Test sonuçları yorumlanmadan önce tüm kalite kontrol ve test
kalibrasyonu doğrulama gerekliliklerini tamamlayın (bakınız “Kalite Kontrol”,
sayfa 50).
Test sonuçları
Pozitif numuneleri belirlemek için CO, PC1 ortalamasıdır. Test kalibrasyonu
doğrulama sırasında hesaplanmış PC1 ortalamasını kullanarak her numune
için RLU/CO değerini belirleyin. Test sonuçları şöyle belirlenir:
 RLU/CO değeri ≥2,0 olan örnekler o HPV tipi için “pozitif” kabul edilir.
 RLU/CO değeri <2,0 olan örnekler o HPV tipi için “negatif” veya “no HPV
DNA detected” (HPV DNA saptanmadı) kabul edilir. HPV DNA sekansları
yoktur veya HPV DNA düzeyleri testin saptama sınırının altındadır.
Sorun Giderme kılavuzu
Açıklama ve öneriler
Kontrollerin denatürasyonu sırasında uygun renk değişikliği
gözlenmemesi veya hiç renk değişikliği olmaması
a) DNR yanlış
hazırlanmıştır
DNR'nin Gösterge Boyayı içerdiğinden ve
koyu mor renkte olduğundan emin olun.
b) DNR kontrolleri
eklenmemiştir
DNR'nin kontrollere eklendiğini
mikroplakadaki hacmi ölçerek doğrulayın.
Hacim 75 µl olmalıdır.
Hacim DNR'nin eklenmediğine işaret
ederse, uygun DNR eklemesini yapın,
karıştırın ve uygun renk değişikliği
gözlenirse teste devam edin.
41
Kalite kontroller hatalı sonuçlar verir
Kontrollerin mikroplakaya
hatalı yerleştirilmesi
“Test Verileri Kayıt Çalışma Sayfasıyla”
eşleştiğinden emin olmak için test
kalibrasyon doğrulama işlemini ayarlayın.
Sonuçları uygun test kalibrasyonu
doğrulama kriterleriyle eşleştirdiğinizden
emin olun.
Prob karışımı ekleme sırasında uygun olmayan renk değişikliği
gözlenmesi
a) Prob karışımının
kontroller ve/veya
örneklerle uygun
olmayan şekilde
karışması veya hatalı
prob karışımı hacminin
eklenmesi
Hibridizasyon mikroplakasını 2 dakika
daha sallayın.
b) Numune, renk
değişimini maskeleyen
kan veya başka
materyal içermektedir
Tarif edilen renk değişikliği bu
numunelerde beklenmez; test sonuçlarının
olumsuz etkilenmemesi gerekir.
Halen mor kalan örnekler varsa uygun prob
karışımından 35 µl daha ekleyin ve
800 ± 100 devir/dk hızında 3 dakika
sallayarak iyice karıştırın.
Prob karışımı eklenmesi ve tekrar
karıştırma sonrasında uygun renk değişimi
olmaz ve numunede kan veya başka
materyal varsa numuneyi tekrar test edin.
Test, test kalibrasyonu doğrulamayı geçemez; kontroller veya
örneklerde sinyal yok
a) Prob karışımı probsuz
hazırlanmıştır
Prob karışımı hazırlama talimatı için
“Reaktif hazırlama”, sayfa 21, kısmına
bakınız.
b) Hazırlama sırasında prob Probu ve prob karışımını pipetlerken tek
karışımının RNaz ile
kullanımlık pudrasız eldivenler giyin ve
aerosol bariyeri pipet uçları kullanın.
kontaminasyonu
Prob karışımını steril kaplarda hazırlayın.
42
c) Prob karışımının
hazırlanması sırasında
yetersiz karıştırma
Probu prob karışımına ekledikten sonra
en az 5 saniye yüksek hızda iyice
vorteksleyin. Görünür bir vorteks
oluşmalıdır.
d) “Protokol 3: Hibridizasyon
ve hibrid yakalama”
sırasında hatalı süre
veya sıcaklık
Numuneleri tekrar test edin.
e) Doğru DR1 miktarını
eklememe veya belirtilen
süre boyunca inkübe
etmeme
8 kanallı bir pipet kullanarak her
mikroplaka kuyusuna 75 µl DR1
pipetleyin. 20–25ºC'de 30–35 dakika
inkübe edin.
f)
8 kanallı bir pipet kullanarak her
mikroplaka kuyusuna 75 µl DR2
pipetleyin.
20–25ºC'de 15–30 dakika inkübe edin.
Doğru DR2 miktarını
eklememe veya belirtilen
süre boyunca inkübe
etmeme
g) DML aleti arızalı
Daha fazla talimat için uygun kullanıcı el
kitabında bakım, servis ve sorun giderme
kısımlarına başvurun veya QIAGEN
Teknik Servisi ile irtibat kurun.
Kontroller ve/veya örneklerde artmış RLU (≥200 RLU) test; test
kalibrasyon doğrulama kriterlerini geçemeyebilir
a) Hatalı DNR hacmi
eklenmiş veya yetersiz
karıştırma
DNR eklemeden önce tekrarlayan pozitif
displasman pipetinin doğru iletim yaptığını
doğrulayın. Kalibre edilmiş pipetler şarttır.
Her mikroplaka kuyusuna yarım hacim
DNR ekleyin ve iyice karıştırın. Yalancı
pozitif sonuçlardan kaçınmak için sıvının
mikroplaka kuyusunun tüm iç yüzeyini
yıkadığından emin olun. Kontroller DNR
eklenmesinden sonra mora dönmelidir.
43
b) DML aletinde ışık
sızıntısı
Boş bir mikroplaka okuyarak DML aletinde
bir arka alan okuması yapın (ham veri
ölçümü). 50 RLU üzerinde bir ölçüm ışık
sızıntısının olabileceğine işaret eder.
Daha fazla talimat için uygun kullanıcı el
kitabında bakım, servis ve sorun giderme
kısımlarına başvurun veya QIAGEN Teknik
Servisi ile irtibat kurun.
c) DR2 veya negatif
kontrollerin DR1 veya
eksojen alkalen
fosfatazla
kontaminasyonu
Bakınız “Ek A: Kontaminasyon
Değerlendirme İşlemleri”, sayfa 62.
d) Yıkama tamponunun
kontaminasyonu
e) Automated Plate
Washer'ın
kontaminasyonu
f)
Mikroplaka kuyularını yıkama tamponuyla
6 kez, her seferinde mikroplaka kuyularını
taşırarak yıkayın veya Automated Plate
Washer'ı kullanın. Yıkamadan sonra
mikroplaka kuyularında görünür pembe sıvı
kalmamalıdır. Testlerde kontaminasyon
veya arızalar için Otomatik Plaka Yıkayıcı
Kullanıcı El Kitabına başvurun.
DR1 inkübasyonundan
sonra yakalama
mikroplaka kuyularının
yetersiz yıkanması
g) Negatif kontrollerin
DR1 ile
kontaminasyonu
44
Tüm çalışma yüzeylerinin temiz ve kuru
olduğundan emin olun. DR1 kullanırken
dikkatli olun. Aerosol oluşturmaktan
kaçının.
h) Yakalama
mikroplakasının
boşaltma ve dokunarak
sıvı giderme sırasında
kontaminasyonu
Mikroplakayı daima yeni, temiz KimTowels
kağıt havluları veya eşdeğer az tiftikli kağıt
havlu üzerine dokunarak sıvıyı giderin.
i)
Hatalı dokunarak sıvı
giderme kağıt havluları
kullanılması
Dokunarak sıvıyı gidermek için KimTowels
kağıt havluları veya eşdeğeri az tiftikli kağıt
havlular kullanın
j)
PC1 olarak PC2
materyali kullanılmış
veya test PC1/NC1
oranı test
doğrulamasını
geçemez.
Testi tekrarlayın ve uygun kontrollerin
kullanıldığından emin olun.
Yakalama mikroplakasını çapraz
kontaminasyon olabileceğinden daha önce
kullanılmış kağıt havlular üzerine
dokunarak sıvısını gidermeyin.
Düşük PC/NC oranı veya yüksek sayıda (>%20) düşük pozitif
numune; test, test kalibrasyonu doğrulama kriterlerini
geçemeyebilir
a) Yetersiz örnek
hazırlama
Denatürasyon sırasında her örneğe doğru
DNR hacmi eklediğinizden emin olun.
Vortekslemeyle iyice karıştırın. Yalancı
pozitif sonuçlardan kaçınmak için sıvının
tüpün tüm iç yüzeyini yıkadığından emin
olun.
PreservCyt numuneleriyle örnek hazırlama
sırasında örneğin iyice karıştırıldığından ve
denatürasyon inkübasyonu öncesinde
hücre peleti tekrar süspansiyonunun tam
olduğundan emin olun. Ek bilgi için digene
HC2 Sample Conversion Kiti kullanma
talimatına başvurun.
Örnekte koyu mora belirgin bir renk
değişikliği olmalıdır. 65 ± 2ºC'de
45 ± 5 dakika inkübe edin.
45
b) Kontrollerin yetersiz
denatürasyonu
Su banyosunun sıcaklığının yeterli
olduğundan ve su banyosunda tüm tüp
hacmini batırmaya yeterli su olduğundan
emin olun.
Kontrollerin DNR eklenmesi sonrasında
iyice karıştırıldığından emin olun.
c) Prob karışımının
yetersiz karıştırılması
veya kontroller ve/veya
örneklere yetersiz prob
karışımı eklenmiş
Prob karışımı hazırlama sırasında prob
karışımını iyice karıştırın ve bir vorteksin
görünür olduğundan emin olun. Prob
karışımı doğru iletimden emin olunması
için mikroplaka kuyularına bir tekrarlayan
pozitif displasman pipeti veya çoklu kanallı
pipetle eklenmelidir.
Ek bilgi için bakınız “Reaktif hazırlama,”
sayfa 21.
46
d) Kontroller ve/veya
örneklere yetersiz prob
karışımı hacmi
eklenmesi
Kontroller ve/veya örneklere prob
karışımını eklemeden önce pipetin doğru
iletim yaptığından emin olun.
e) DR1 aktivitesi kaybı
DR1'i belirtilen sıcaklıkta sakladığınızdan
emin olun (bakınız “Reaktif Saklama ve
Muamele”, sayfa 17).
f)
İnkübatör sallayıcının doğru çalıştığından
ve kalibrasyon dahilinde olduğundan emin
olun.
Yetersiz DNA–RNA
hibridleri yakalama
g) Yetersiz yıkama
Washer kullanın.
h) Yıkama tamponunun
kontaminasyonu
RLU değerleri yaklaşık aynı olan bir dizi pozitif örnek
a) Yakalama mikroplaka
kuyularının
kontaminasyonu
Tüm inkübasyonlar sırasında yakalama
mikroplakasını örtün. Testi yaparken
reaktiflerin ve yakalama mikroplakasının
aerosol kontaminasyonuna maruz
kalmasından kaçının.
Testi yaparken pudrasız eldivenler giyin.
b) DR2 Kontaminasyonu
DR2'yi yakalama mikroplaka kuyularına
pipetlerken DR2'yi kontamine
etmediğinizden emin olun. DR2'nin
aerosollerden kontaminasyonundan
kaçının.
c) Automated Plate
Washer Arızası
Testlerde kontaminasyon veya arızalar için
Otomatik Plaka Yıkayıcı Kullanıcı El
Kitabına başvurun.
Kontrol replikatlarında Büyük CV
a) Test yapılması
sırasında hatalı
pipetleme
Pipetin doğru ilettiğinden emin olun.
Kullanılan pipetleri rutin olarak kalibre edin.
b) Test yapılması
sırasında yetersiz
karıştırma
Özellikle denatürasyon sırasında ve prob
karışımını ekledikten sonra olmak üzere
tüm adımlarda iyice karıştırdığınızdan emin
olun.
c) Sıvının hibridizasyon
mikroplaka
kuyularından yakalama
mikroplaka kuyularına
tam olmayan transferi
Hibridizasyon mikroplaka kuyularından
yakalama mikroplaka kuyularına tam sıvı
transferi olduğundan emin olun.
d) Mikroplaka kuyularının
uygun olmayan
yıkanması
Washer'ı kullanın.
Yıkamadan sonra mikroplaka kuyularında
görünür pembe sıvı kalmamalıdır.
47
e) Mikroplaka kuyularının
DR1 ile
kontaminasyonu
Tüm çalışma yüzeylerinin temiz ve kuru
olduğundan emin olun. DR1 kullanırken
dikkatli olun. Aerosol oluşturmaktan
kaçının.
Bilinen negatif numunelerden elde edilen yalancı pozitif sonuçlar
a) Yetersiz örnek
hazırlama
Her kontrol ve örneğe doğru DNR hacmi
eklediğinizden emin olun. Vortekslemeyle
iyice karıştırın. Yalancı pozitif sonuçlardan
kaçınmak için sıvının tüpün tüm iç yüzeyini
yıkadığından emin olun.
PreservCyt numuneleriyle örnek hazırlama
sırasında örneğin iyice karıştırıldığından ve
denatürasyon inkübasyonu öncesinde
hücre peleti tekrar süspansiyonunun tam
olduğundan emin olun. Ek bilgi için digene
HC2 Sample Conversion Kiti kullanma
talimatına başvurun.
Koyu mora belirgin bir renk değişikliği
gözlenmelidir. 65 ± 2ºC'de 45 ± 5 dakika
inkübe edin.
b) Örneğin hibridizasyon
mikroplaka kuyusuna
aktarılması sırasında
pipet ucunun denatüre
olmamış materyallerle
kontaminasyonu
48
Yetersiz karıştırma servikal numunelere
endojen spesifik olmayan DNA–RNA
hibridlerinin tam olmayan
denatürasyonuyla sonuçlanabilir.
Özellikler PreservCyt numunelerinde bu
hibridlerin numune tüpü duvarlarında
bulunması olasıdır. Bu denatüre olmamış
hücresel materyali olası bulaşmasını
önlemek için pipet ucunun örneğin
hibridizasyon mikroplakası kuyusuna
aktarılması sırasında numune tüpünün
kenarlarına dokunmasına izin vermeyin.
c) Mikroplaka kuyularının
DR1 ile
kontaminasyonu
d) Yakalama
mikroplakasının
boşaltma ve dokunarak
sıvı giderme sırasında
kontaminasyonu
Mikroplakayı daima yeni, temiz KimTowels
kağıt havluları veya eşdeğer az tiftikli kağıt
havlu üzerine dokunarak sıvıyı giderin.
e) Yakalama mikroplaka
kuyularının uygun
olmayan yıkanması
Yakalama mikroplakasını çapraz
kontaminasyon olabileceğinden daha önce
kullanılmış kağıt havlular üzerine
dokunarak sıvısını gidermeyin.
f)
DR2 Kontaminasyonu
Örneklere DR2 eklerken numunelerde
çapraz kontaminasyon
oluşturmadığınızdan emin olun.
Bir kitin bir parçasını kullanıyorsunuz, o
test için gerekli DR2 hacmini pipeti
doldurmadan önce temiz, tek kullanımlık
bir reaktif rezervuarına bölüntüleyin.
Testin beklendiği şekilde çalışmasıyla artmış NC1 RLU değerleri
(>150 RLU)
a) DR2'nin belirlenmiş
süre veya belirlenmiş
sıcaklık aralığı dışında
yapılmasıyla yakalama
mikroplakası
inkübasyonu
Test sonuçları geçersizdir. Testi tekrarlayın
ve yakalama mikroplakasının belirtilen
sıcaklıkta uygun süreyle inkübe
edildiğinden emin olun.
49
b) DR2 veya yıkama
tamponunun alkalen
fosfataz veya DR1 ile
kontaminasyonu
Değerlendirme İşlemleri,” sayfa 62.
Kalite Kontrol
Test kalibrasyonu doğrulama
Test kalibrasyonu doğrulama reaktifler, kalibratörler ve kalite kontrollerin doğru
çalıştığından ve test CO'sunun doğru şekilde saptanmasını mümkün
kıldığından emin olmak için yapılır. digene HPV Genotyping PS Testi her testle
test kalibrasyonu gerektirir; bu nedenle her testin doğrulanması gerekir. Bu
test kalibrasyonu doğrulama işleminin dahili kalite kontrol testinin yerini alması
amaçlanmamıştır. Test kalibrasyonunun doğrulanması için kabul edilebilir
aralıklar sadece QIAGEN tarafından onaylanmış DML aletleri için
belirlenmiştir.
Test belirlenmiş test kalibrasyonu doğrulama kriterlerini karşılamalıdır.
Aşağıdaki kriterlerden herhangi biri geçersizse test sonuçları geçersizdir.
Negatif Kontrol 1
NC1, HPV 16 prob karışımını kullanan her testte üç kopya olarak test
edilmelidir. NC1 replikatlarının test kalibrasyonunu doğrulamak için şu adımları
gerçekleştirin.
1. 3 NC1 replikatının ortalaması ve varyasyon katsayısını (CV)
hesaplayın.
Geçerli bir NC1 ortalaması ≥10 ve ≤185 RLU şeklindedir ve CV ≤%35'tir.
Şu şekilde devam edin:
 NC1 için gereken test kalibrasyon doğrulama kriteri karşılanmazsa
PC1 test kalibrasyonu doğrulamaya geçin.
 Gereken test kalibrasyonu doğrulama kriterleri NC1 için karşılanırsa bu
işlemle devam edin.
Not: CV hesaplama formülü şöyledir: (standart
sapma/ortalama) x 100 = %CV
50
2. Önceden hesaplanmış ortalamadan en uzakta RLU değerine sahip
NC1 replikatını bir dışarıda kalan olarak çıkarın.
3. Ortalama ve CV değerini kalan 2 NC1 replikatıyla hesaplayın.
Ortalama ve CV, NC1 için gerekli test kalibrasyon doğrulama kriterlerini
karşılarsa PC1 test kalibrasyonu doğrulamaya ilerleyin.
NC1 için gerekli test kalibrasyonu doğrulama kriterleri karşılanmazsa test
kalibrasyonu geçersizdir ve test tüm numuneler için tekrarlanmalıdır. Bu
nedenle digene HPV Genotyping PS Testi sonuçlarını bildirmeyin.
Pozitif Kontrol 1
PC1, HPV 16 prob karışımını kullanan her testte üç kopya olarak test
edilmelidir. PC1 replikatlarının test kalibrasyonunu doğrulamak için şu adımları
gerçekleştirin.
1. Ortalama ve CV değerini 3 PC1 replikatıyla hesaplayın.
Geçerli bir PC1 CV ≤%25. Şu şekilde devam edin:
 PC1 için gereken test kalibrasyon doğrulama kriteri karşılanırsa
PC1/NC1 ortalaması test kalibrasyonu doğrulamaya geçin.
 Gereken test kalibrasyonu doğrulama kriterleri NPC1 için
karşılanmazsa bu işlemle devam edin.
2. Önceden hesaplanmış ortalamadan en uzakta RLU değerine sahip
PC1 replikatını bir dışarıda kalan olarak çıkarın.
3. Ortalama ve CV değerini kalan 2 PC1 replikatıyla hesaplayın.
CV, PC1 için gereken test kalibrasyon doğrulama kriterini karşılarsa
PC1/NC1 ortalaması test kalibrasyonu doğrulamaya geçin.
PC1 için gerekli test kalibrasyonu doğrulama kriterleri karşılanmazsa test
kalibrasyonu geçersizdir ve test tüm numuneler için tekrarlanmalıdır. Bu
nedenle digene HPV Genotyping PS Testi sonuçlarını bildirmeyin.
51
Positif kontrol 1 ortalaması / negatif kontrol 1 ortalaması
Önceden hesaplanmış PC1 ortalaması ve NC1 ortalamasını kullanarak
PC1/NC1 oranını hesaplayın.
Geçerli bir PC1/NC1 oranı ≥2,0 ve ≤15,0 şeklindedir. Şu şekilde devam edin:
 PC1/NC1 oranı için gereken test kalibrasyon doğrulama kriteri
karşılanmışsa prob spesifik kalite kontroller için test kalibrasyonu
doğrulamaya geçin.
 PC1/NC1 oranı için gereken test kalibrasyon doğrulama kriteri
karşılanmamışsa test kalibrasyonu geçersizdir ve test tüm numuneler için
tekrarlanmalıdır. Bu nedenle digene HPV Genotyping PS Testi sonuçlarını
bildirmeyin.
Prob spesifik kalite kontroller
digene HPV Genotyping PS Testiyle kalite kontrol örnekleri sağlanmıştır ve her
test yapıldığında dahili kalite kontrol için kullanılmaları gerekir. Sağlanan kalite
kontroller klonlanmış HPV DNA hedefleridir ve vahşi tip HPV'den
türetilmemiştir. Bu, NC1 ve PC1 için kullanılan materyal tipiyle aynıdır. Ulusal
veya yerel düzenlemeler veya akreditasyon organizasyonlarının kılavuz ilkeleri
veya gerekliliklerine göre ek kalite kontroller test edilebilir. Sağlanan kalite
kontroller PreservCyt Solüsyonu işlenmesi için uygun bir kalite kontrol görevi
görmez.
Testin geçerli olabilmesi için her kalite kontrol RLU/CO değeri aşağıda Tablo
4'te belirtildiği gibi tanımlanmış kriterlere uymalıdır.
Kalite kontrollerin herhangi biri bu aralıklar dahilinde değilse test geçersizdir ve
tüm numuneler için tekrarlanmalıdır. Bu nedenle digene HPV Genotyping PS
Testi sonuçlarını bildirmeyin.
Tablo 4. Kalite kontrol testi geçerlilik kriterleri
Kalite kontrol
52
Minimum (RLU/CO)
Maksimum (RLU/CO)
NC2
0,001
0,999
PC2
2,0
10,0
Sınırlamalar
 digene HPV Genotyping PS Testi kullanarak HPV saptanması birden fazla
HPV tipi ile enfeksiyon olasılığını ortadan kaldırmaz.
 Bu test sadece yüksek riskli HPV tip 16, 18 ve 45 saptar. Numunede diğer
yüksek riskli ve düşük riskli HPV tipleri bulunabilir.
 %1,25'ten (h/h) fazla kan içeren numuneler yalancı negatif test sonucu
verebilir.
 HPV enfeksiyonu yüksek dereceli servikal hastalık varlığının kesin bir
göstergesi değildir ve ayrıca tüm durumlarda yüksek dereceli servikal
hastalık veya kanser gelişeceği anlamına gelmez.
Performans Özellikleri
digene HPV Genotyping PS Testi ve doğrulanmış bir
kantitatif PCR HPV genotipleme testi arasında anlaşma
QIAGEN'de digene HPV Genotyping PS Testi ile HPV tip 16, 18 ve 45
tanımlanması açısından test sonuçlarının doğrulanmış bir qPCR testiyle
karşılaştırıldığında anlaşmasını belirlemek üzere bir performans
değerlendirmesi yapılmıştır.
Rutin bir tarama popülasyonundan toplam 287 PreservCyt ve 290 STM
arşivlenmiş servikal numunesi elde edilmiştir. digene HC2 High-Risk HPV DNA
Testi sonucu her numune için çalışmaya katılmadan önce belirlenmiştir.
digene HC2 High-Risk HPV DNA Testi sonuçları şöyledir:
 238 pozitif STM numunesi
 52 negatif STM numunesi
 237 pozitif PreservCyt numunesi
 50 negatif PreservCyt numunesi
Her HPV tipi için (16, 18 ve 45), her numune ilgili HPV tipinin saptanması için
hem digene HPV Genotyping PS Testi hem qPCR test yöntemi ile üç kopyalı
olarak çalışılmış ve böylece her test yöntemi için toplam 1731 test sonucu elde
edilmiştir. Uyumsuzların çözümlenmesi sonrasında, 11 uyumsuz sonuç
kalmıştır (bakınız aşağıda Tablo 5).
digene HPV Genotyping PS Testinin qPCR ile anlaşması %99,4 (1720/1731)
ve %95 güven aralığı (GCI) %98,9–99,6 olmuştur.
53
Tablo 5. digene HPV Genotyping PS Test sonucunun qPCR test
sonucuyla sonuç anlaşması
digene HPV Genotyping PS Testi sonucu
qPCR test
sonucu
+
–
+
110
4
–
7
1610
Spesifik HPV genotiplerinin saptanmasında anlaşma
digene HPV Genotyping PS Testinin qPCR testiyle test sonucu anlaşması
HPV genotipi temelinde belirlenmiştir (bakınız aşağıda Tablo 6).
Tablo 6. digene HPV Genotyping PS Test sonucunun qPCR HPV genotip
test sonucuyla sonuç anlaşması
Anlaşma (%)
(n/N)
Genotip
%95 CI
HPV 16
99,1
(572/577)
98,0–99,6
HPV 18
99,7
(575/577)
98,7–99,9
HPV 45
99,3
(573/577)
98,2–99,7
54
Numune tipine bağlı olarak test sonuçlarında anlaşma
digene HPV Genotyping PS Testinin qPCR testiyle test sonucu anlaşması
numune tipi temelinde belirlenmiştir (bakınız aşağıda Tablo 7).
Tablo 7. digene HPV Genotyping PS Test sonucunun qPCR numune tipi
test sonucuyla sonuç anlaşması
Anlaşma (%)
(n/N)
Numune tipi
STM numuneleri
%95 CI
99,8
(868/870)
99,2–99,9
PreservCyt numuneleri
99.0
(852/861)
98,0–99,4%
Analitik özgüllük
digene HPV Genotyping PS Testinde kullanılan 3 HPV prob karışımının (16,
18 ve 45) her biri ile test başına 1E+7 kopya konsantrasyonuyla klinik olmayan
bir klonlanmış HPV plasmid DNA paneli test edilmiştir. Testler 3 HPV prob
karışımı ile şu HPV plasmid DNA'lar arasında çapraz reaksiyon bulunmadığını
belirlemiştir:
 Yüksek riskli HPV tipleri 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58,
59, 66, 68, 73 ve 82
 Düşük riskli HPV tipleri 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 30, 34, 34, 40, 42, 43, 44,
67, 69, 70 ve 71
55
Tekrar Üretilebilirlik
digene HPV Genotyping PS Testinin genel tekrar üretilebilirliği belirlenmiştir.
QIAGEN tesislerinde 3 farklı laboratuvarda 3 farklı kullanıcının, testi 3 farklı kit
lotu kullanarak yapmasıyla testler gerçekleştirilmiştir. Her kullanıcı aynı panel
üyelerini üç kopya olarak minimum 5 gün boyunca test etmiştir.
STM numunesi tekrar üretilebilirliği
STM numunesi tekrar üretilebilirlik paneli test edilen her HPV tipi için (HPV 16,
18 ve 45) şu konsantrasyonlarda plasmid solüsyonlarından oluşmuştur:
 0 pg/ml (negatif)
 0,5 pg/ml (yüksek negatif)
 1,5 pg/ml (düşük pozitif)
 10 pg/ml (yüksek pozitif)
Gözlenen test sonuçları beklenen test sonuçlarıyla %100 anlaşmıştır. STM
tekrar üretilebilirlik testi sonuçları temelinde digene HPV Genotyping PS Testi
STM numunelerinde yüksek ölçüde tekrar üretilebilir.
PreservCyt numunesi tekrar üretilebilirliği
PreservCyt numunesi paneli tekrar üretilebilirliği şu konsantrasyonlarda HPV
16 için pozitif SiHa hücrelerinden oluşmuştur:
 0 hücre/test (negatif)
 250–750 hücre/test (yüksek negatif)
 1000–5000 hücre/test (düşük pozitif)
 >5000 hücre/test (yüksek pozitif)
Gözlenen test sonuçları beklenen test sonuçlarıyla %95,3 (103/108)
anlaşmıştır. PreservCyt numunesi tekrar üretilebilirlik testi sonuçları temelinde
digene HPV Genotyping PS Testi PreservCyt numunelerinde yüksek ölçüde
tekrar üretilebilir.
56
STM ve PreservCyt numuneleri için DNA geri alınması
STM ve PreservCyt numuneleri HPV 16 DNA geri alınması için incelenmiştir.
SiHa hücreleri STM ve PreservCyt Solüsyonuna şu konsantrasyonlarda
eklenmiştir:
 500 hücre/test (yüksek negatif)
 2000 hücre/test (düşük pozitif)
 5000 hücre/test (yüksek pozitif)
Her numune tipi geçerli kullanma talimatında tanımlandığı şekilde ilgili örnek
hazırlama ve denatürasyon işlemlerine göre işlenmiş ve HPV 16 prob karışımı
kullanılarak digene HPV Genotyping PS Testi ile test edilmiştir.
Sonuçlar insan karsinom hücrelerinden HPV 16 DNA geri alınmasının 2 ortam
için eşdeğer olduğunu ve PreservCyt örnek hazırlamanın digene HPV
Genotyping PS Testinin analitik hassasiyetini etkilemediğini göstermiştir.
Çapraz reaktivite
Çapraz reaktivite paneli
Dişi anogenital kanalında sık olarak bulunan organizmaların bir paneli digene
HPV Genotyping PS Testi ile çapraz reaktivite oluşup oluşmayacağını
belirlemek üzere test edilmiştir. Tüm mikroorganizmalar 105 ve
107 organizma/ml konsantrasyonlarında test edilmiştir.
Aşağıdaki organizmalar test edilmiş ve digene HPV Genotyping PS Testi ile
çapraz reaksiyon göstermemiştir:
 Acinetobacter anitratus (ATCC 49139)
 Acinetobacter lwoffi (ATCC 17925)
 Bacteroides fragilis (ATCC 25285)
 Bacteroides melaninogenicus (ATCC 25845)
 Candida albicans (ATCC 10231)
 Chlamydia trachomatis (ATCC VR-878)
 Enterobacter cloacae (ATCC 13047)
 Escherichia coli HB101 (ATCC 33694)
 Escherichia coli (ATCC 25922)
 Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586)
57
 Gardnerella vaginalis (ATCC 49145)
 Haemophilus ducreyi (ATCC 700724)
 Klebsiella pneumonia (ATCC 13883)
 Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356)
 Mobiluncus curtisii (ATCC 35241)
 Mobiluncus mulieris (ATCC 35243)
Sekans analizi ile belirlendiği şekilde çapraz reaktivite
digene HPV Genotyping PS Testi prob karışımlarında kullanılan
oligonükleotidlerle herhangi bir örtüşen sekansın çapraz reaksiyon
göstermeyeceğinden emin olmak için şu virüslerle bir sekans analizi (blast)
yapılmıştır:
 Adenovirüs 2
 Sitomegalovirüs
 Epstein-Barr Virüsü
 Hepatit B yüzey antijeni pozitif serum
 Herpes simplex 1
 Herpes simplex 2
 İnsan immünyetmezlik virüsü (HIV, RT DNA)
 pBR322
 Simian virüsü tip 40 (SV40)
Sekans analizi sonuçları digene HPV Genotyping PS Testi prob karışımlarının
listedeki virüslerle çapraz hibridizasyon yapıp bir yalancı pozitif test sonucuna
neden olma olasılığının düşük olduğunu göstermiştir.
Kan ve diğer maddelerin STM numunelerine etkisi
Kan ve diğer olası enterferans yapıcı tanımlanmış maddelerin etkisi digene
HPV Genotyping PS Testinde değerlendirilmiştir. Tam kan, kontraseptif jöle,
spermisid, nemlendirici, hemoroid anesteziği, vücut yağı, antifungal krem ve
vajinal yağlayıcılar (servikal numunelerde sıklıkla bulunabilen ajanlar) servikal
numunelerde bulunabilecek konsantrasyonlarda STM'ye eklenmiştir.
Ajanların hiçbiriyle herhangi bir konsantrasyonda yalancı pozitif sonuç elde
edilmemiştir. Ancak en düşük hedef giriş konsantrasyonu olan 2 pg/ml kan test
edilirken yalancı negatif sonuçlar gözlenmiştir. 2 pg/ml hedef
58
konsantrasyonuyla 17,5 μl/ml (%1,75 h/h) değerine eşit veya üstünde kan
konsantrasyonuyla saptama enterferansı gözlenmiştir. 12,5 μl/ml (%1,25 h/h)
kan konsantrasyonuyla enterferans gözlenmemıştır. Test edilen diğer ajanların
hiçbiriyle herhangi bir yalancı negatif sonuç gözlenmemıştır.
Kan ve diğer maddelerin PreservCyt numunelerine etkisi
Kan ve diğer olası enterferans yapıcı tanımlanmış maddelerin etkisi digene
HPV Genotyping PS Testinde değerlendirilmiştir. Tam kan, kontraseptif jöle,
spermisid, nemlendirici, hemoroid anesteziği, vücut yağı, antifungal krem ve
vajinal yağlayıcılar (servikal numunelerde sıklıkla bulunabilen ajanlar) servikal
numunelerde bulunabilecek konsantrasyonlarda PreservCyt Solüsyonuna
eklenmiştir. Ajanların hiçbiriyle herhangi bir test edilen konsantrasyonda
yalancı pozitif veya yalancı negatif sonuç elde edilmemiştir.
Referanslar
QIAGEN, QIAGEN ürünlerini kullanan bilimsel yayınların büyük ve güncel bir
çevrimiçi veri tabanını tutmaktadır. Kapsamlı araştırma seçenekleri gereksinim
duyduğunuz makaleleri basit bir anahtar kelime arama veya uygulama,
araştırma alanı, başlık, vs. belirterek bulmanızı mümkün kılar.
Tam referans listesi için www.qiagen. com/RefDB/search.asp adresindeki
QIAGEN Referans Veri Tabanını ziyaret edin veya QIAGEN Teknik Servis ya
da yerel distribütörünüzle irtibat kurun.
Atıfta bulunulan referanslar
1.
Broker, T. R. and Botchan, M. (1986) Papillomaviruses: retrospectives
and prospectives. In: Botchan, M., Grodzicker, T., and Sharp, P., eds.
DNA Tumor Viruses: Control of Gene Expression and Replication. Cold
Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 17-36.
From the 1985 Cancer Cells Conference at Cold Spring Harbor.
2.
Lorincz, A.T. and Reid, R. (1989) Association of human papillomavirus
with gynecologic cancer. Curr. Opin. Oncol. 1, 123.
3.
Jenson, A.B., Kurman, R.J., and Lancaster, W.D. (1984) Human
papillomaviruses. In: Belshe, R.B. Textbook of Human Virology.
Littleton, MA: PSG-Wright, p 951.
4.
Becker, T.M., Stone, K.M., and Alexander, E.R. (1987) Genital human
papillomavirus infection: a growing concern. Obstet. Gynecol. Clin. North
Am. 14(2), 389.
59
60
5.
McCance, D.J., Walker, P.G., Dyson, J.L., Coleman, D.V., and Singer,
A. (1983) Presence of human papillomavirus DNA sequences in cervical
intraepithelial neoplasia. Br. Med. J. 287, 784.
6.
Naghashfar, Z. et. al. (1985) Identification of genital tract
papillomaviruses HPV-6 and HPV-16 in warts of the oral cavity. J. Med.
Virol. 17, 313.
7.
Gissmann, L., Wolnik, L., Ikenberg, H., Koldovsky, U., Schnurch, H.G.,
and zur Hausen, H. (1983) Human papillomavirus types 6 and 11 DNA
sequences in genital and laryngeal papillomas and in some cervical
cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 560.
8.
Munoz, N., Bosch, F.X., Shah, K.V., and Meheus, A., eds. (1992) IARC
Scientific Publications no. 119: The Epidemiology of Cervical Cancer
and Human Papillomavirus. Lyon, France: International Agency for
Research on Cancer.
9.
Kjaer, S.K., Frederiksen, K., Munk, C., and Iftner, T. (2010) Long-term
absolute risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 or worse
following human papillomavirus infection: role of persistence. J. Natl.
Cancer Inst. 102, 1478.
10.
de Sanjose, S. et al. (2010) Human papillomavirus genotype attribution
in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide
study. Lancet Oncol. 11, 1048.
11.
Wright J.D. et al. (2005) Human papillomavirus type and tobacco use as
predictors of survival in early stage cervical carcinoma. Gynecol. Oncol.
98(1), 84.
12.
Centers for Disease Control (1987) Recommendations for prevention of
HIV transmission in health-care settings. MMWR Morb. Mortal. Wkly.
Rep. 36(Suppl 2), 3S.
13.
Sehulster, L.M., Hollinger, F.B., Dreesman, G.R., and Melnick, J.L.
(1981) Immunological and biophysical alteration of hepatitis B virus
antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl. Environ. Microbiol.
42(5), 762
14.
Martin, L.S., McDougal, J.S., and Loskoski, S.L. (1985) Disinfection and
inactivation of the human T lymphotropic virus
type III/lymphadenopathy-associated virus. J. Infect. Dis. 152(2), 400.
Semboller
Bu kullanma talimatında şu semboller kullanılmıştır:
Sembol
Sembol tanımı
< n > test için yeterli içerik
İn vitro diagnostik tıbbi cihaz
Katalog numarası
Küresel Ticaret Parça Numarası
Üretici
Avrupa Topluluğunda yetkili temsilci
Son kullanma tarihi
Kullanma talimatına başvurun
İrtibat Bilgisi
Teknik yardım ve daha fazla bilgi için lütfen www.qiagen.com/Support
adresindeki Teknik Destek Merkezimize gidin veya QIAGEN Teknik Servis
Bölümlerinden ya da yerel distribütörlerden birini arayın (arka kapağa bakın
veya www.qiagen.com adresini ziyaret edin).
61
Ek A: Kontaminasyon Değerlendirme İşlemleri
Test beklendiği şekilde performans göstermezse, nedeni kontaminasyon
olabilir. Kontaminasyonun bir olasılık olup olmadığını değerlendirmek üzere
her reaktif için aşağıdaki değerlendirme işlemini yapın.
Saptama Reaktifi 2
Notlar:
 DR2 kontaminasyonunu önlemek için tek kullanımlık, pudrasız eldivenler
giyin ve pipet uçlarını herhangi bir çalışma yüzeyine dokundurmayın.
 DR2 ile çalışırken doğrudan güneş ışığında çalışmaktan kaçının.
1. Temiz bir yakalama mikroplakası kuyu stripi alın ve bir plaka
çerçevesine yerleştirin.
2. Bölüntülenmiş, kalan veya orijinal DR2 flakonundan 75 µl miktarını bir
yakalama mikroplakası kuyusuna pipetleyin.
Not: Performansın optimum değerlendirilmesi için DR2'yi 3 kopya halinde
test edin.
3. 20–25ºC'de 15 dakika inkübe edin. Doğrudan güneş ışığından kaçının.
4. Yakalama mikroplakasını bir DML aleti kullanarak ölçün.
DR2 kontrolü <50 RLU olmalıdır.
DR2 değerleri <50 RLU ise testi tekrarlamak için DR2 kullanılabilir.
DR2 kontamineyse (>50 RLU), yeni bir kit alın ve testi tekrarlayın.
Yıkama Aygıtı ve/veya su kaynağı
2. Kuyuları 1–4 olarak işaretleyin. 4 ayrı yakalama mikroplaka kuyusuna
75 µl DR2 pipetleyin.
Kuyu 1, DR2 kontrolü görevi yapar.
3. Yıkama Şişesinden 10 µl yıkama tamponunu mikroplaka kuyusu 2'ye
pipetleyin.
4. Yıkama tamponunun yıkayıcı tüpü içinden akmasını bekleyin. Tüpten
10 µl yıkama tamponunu yıkama mikroplakası kuyusu 3'e pipetleyin.
5. Yıkama tamponunu hazırlamak için kullanılan sudan bir bölüntü alın.
10 µl suyu yıkama mikroplakası kuyusu 4'e pipetleyin.
62
6. 20–25ºC'de 15 dakika inkübe edin. Doğrudan güneş ışığından kaçının.
DR2 kontrolü (kuyu 1) <50 RLU olmalıdır.
Kuyu 2, 3 ve 4'ten RLU'yu DR2 kontrol RLU'suyla karşılaştırın. Kuyu 2, 3
ve 4 için ayrı RLU değerleri DR2 kontrol RLU'sunu 50 RLU geçmemelidir.
DR2 kontrolden 50 RLU üzerinde değerler kontaminasyona işaret eder.
Yıkama Aygıtını temizleme ve bakımını yapma talimatı için bakınız
“Yıkama tamponu”, sayfa 25.
2. Kuyuları 1–5 olarak işaretleyin. 5 yakalama mikroplaka kuyusuna
75 µl DR2 pipetleyin.
Kuyu 1, DR2 kontrolü görevi yapar.
3. Plaka Yıkayıcı Yıkama Şişesinden 10 µl yıkama tamponunu
mikroplaka kuyusu 2'ye pipetleyin.
4. Plaka Yıkayıcı Durulama Şişesinden 10 µl yıkama tamponunu
mikroplaka kuyusu 3'e pipetleyin.
5. Plaka Yıkayıcı tuş takımında “Prime” (Sıvı Geçir) tuşuna basıp
Yıkama Tamponunun hatlardan akmasını bekleyin. Oluktan 10 µl
yıkama tamponunu mikroplakası kuyusu 4'e pipetleyin.
6. Plaka Yıkayıcı tuş takımında “Rinse” (Durula) tuşuna basıp duruma
sıvısının hatlardan akmasını bekleyin. Oluktan 10 µl yıkama
tamponunu mikroplakası kuyusu 5'e pipetleyin.
7. Örtün ve 20–25ºC'de 15 dakika inkübe edin. Doğrudan güneş
ışığından kaçının.
DR2 kontrolü (kuyu 1) <50 RLU olmalıdır.
Kuyu 2, 3 ve 4 ve 5'ten RLU'yu DR2 kontrol RLU'suyla karşılaştırın.
Kuyu 2, 3, 4 ve 5 için ayrı RLU değerleri DR2 kontrol RLU'sunu 50 RLU
geçmemelidir.
Plaka Yıkayıcıdan, DR2 kontrolden 50 RLU üzerinde değerler
kontaminasyona işaret eder.
Dekontaminasyon işlemi için Otomatik Plaka Yıkayıcı Kullanıcı El Kitabına
başvurun.
63
64
Çevre sıcaklığı: °C
Test Yeri:
Kullanıcı Kimliği:
digene HPV Genotyping PS Testi lot numarası:
Test Tarihi:
Ek B: Test Verileri Kaydetme Çalışma Sayfası
Sipariş Bilgisi
Ürün
İçindekiler
digene HPV Genotyping PS
Testi
96 reaksiyon için:
Reaktifler, Tamponlar,
4 Kontrol ve Yakalama
Mikroplakası
Kat. no.
613615
Hybrid Capture 2 Modular System
DML 2000
Mikroplaka luminometresi,
240 V
5000-1020
DML 3000
Mikroplaka luminometresi,
120V/240 V
5000-00031
LumiCheck Plate User
Package
DML 2000 veya
DML 3000 ile kullanılmak
üzere plaka ve yazılım
6000-5023
Rotary Shaker I
Dönen sallayıcı, 240 V
6000-2240E
96 kuyucuklu plaka
yıkayıcı, 240 V
6000-00175
MST Vortexer 2
Çoklu örnekli tüp
vorteksleyici, 240 V
6000-5022
Hybridization Microplates
Saydam polistiren 96
kuyulu
mikroplakalar (100)
6000-1203
Microplate Lids
Saydam polistiren
mikroplaka
kapakları (100)
6000-5001
Extra-long Pipet Tips
Pipet uçları, 6 kutu/çanta
5075-1011
Disposable Reagent
Reservoirs
25 ml kapasiteli plastik
reaktif saklama üniteleri
(100)
5090-1010
Aksesuarlar
65
DuraSeal tube sealer film
Mühürleyici film
6000-5003
Plate sealers
Yapışkan plaka
mühürleyiciler (100)
5070-1010
250 adede kadar
PreservCyt numunesinde
örnek dönüştürme için:
Örnek Dönüştürme
Tamponu, Örnek Taşıma
Ortamı, Denatürasyon
Reaktifi ve Gösterge
Boyası
5127-1220
Örnek hazırlama
digene HC2 Sample
Conversion Kit
Güncel lisanslama bilgisi ve ürüne spesifik red beyanları için ilgili QIAGEN kiti
kullanma talimatı veya kullanıcı el kitabına bakınız. QIAGEN kiti kullanma
talimatı ve kullanıcı el kitapları www.qiagen.com adresinde bulunmaktadır
veya QIAGEN Teknik Servis ya da yerel distribütörünüzden istenebilir.
66
®
®
®
TM
Ticari markalar: QIAGEN , digene , Hybrid Capture , (QIAGEN); DuraSeal (Diversified Biotech);
®
®
®
®
Eppendorf , Repeater (Eppendorf AG); KimTowels (Kimberly-Clark Corporation); Parafilm (BEMIS
®
®
Company, Inc.); ThinPrep , PreservCyt (Hologic, Inc.).
Sınırlı Lisans Sözleşmesi
Bu ürünün kullanılması digene HPV Genotyping PS Testini herhangi bir satın alanın veya
kullanıcısının şu şartları kabul ettiğini belirtir:
1. digene HPV Genotyping PS Testi sadece sağlanan kullanma talimatıyla uyumlu olarak ve digene
HPV Genotyping PS Testinde bulunan bileşenlerle kullanılmak üzeredir. QIAGEN herhangi bir fikri
mülkiyeti altında digene HPV Genotyping PS Testinin sağlanan bileşenlerini bu digene HPV
Genotyping PS Testine dahil edilmemiş herhangi bir bileşenle, digene HPV Genotyping PS Testi
kullanma talimatı ve www.qiagen.com adresinde bulunan ek protokollerde tanımlanan şekiller
dışında kullanma veya birleştirme lisansı vermemektedir.
2. Açık olarak belirtilen lisanslar dışında QIAGEN bu digene HPV Genotyping PS Testi ve/veya
kullanımının üçüncü tarafların haklarını ihlal etmediği konusunda garanti vermez.
3. digene HPV Genotyping PS Testi ve bileşenleri tek kullanım için lisanslanmıştır ve tekrar
kullanılamaz, yenilenemez veya tekrar satılamaz.
4. QIAGEN açık olarak belirtilenler dışında açık veya zımni herhangi bir başka lisansı özellikle
reddeder.
5. digene HPV Genotyping PS Testinin satın alıcısı ve kullanıcısı yukarıda yasaklanan herhangi bir
eyleme neden olabilecek veya bunları kolaylaştırabilecek herhangi bir adım atmamayı veya
başkasının atmasına izin vermemeyi kabul eder. QIAGEN bu Sınırlı Lisans Sözleşmesinin
yasaklarını herhangi bir mahkemede yürürlüğe koyabilir ve digene HPV Genotyping PS Testi
ve/veya bileşenleriyle ilişkili herhangi bir fikri mülkiyet hakkı veya bu Sınırlı Lisans Sözleşmesini
yürürlüğe koymak için tüm araştırma ve mahkeme masraflarını avukat masrafları dahil olmak üzere
geri alacaktır.
Güncellenmiş lisans şartları için bakınız www.qiagen.com.
© 2012 – 2015 QIAGEN, tüm hakları saklıdır.
67
www.qiagen.com
Australia  [email protected]
Austria  [email protected]
Belgium  [email protected]
Brazil  [email protected]
Canada  [email protected]
China  [email protected]
Denmark  [email protected]
Finland  [email protected]
France  [email protected]
Germany  [email protected]
Hong Kong  [email protected]
India  [email protected]
Ireland  [email protected]
Italy  [email protected]
Japan  [email protected]
Korea (South)  [email protected]
Luxembourg  [email protected]
Mexico  [email protected]
The Netherlands  [email protected]
Norway  [email protected]
Singapore  [email protected]
Sweden  [email protected]
Switzerland  [email protected]
UK  [email protected]
USA  [email protected]
Sample & Assay Technologies

digene ® HPV Genotyping PS Testi Kullanma Talimatı

Transkript

Benzer belgeler

HPV Human Papilloma Virus Enfeksiyonları

S15-Anormal Servikal Sitoloji Sonucu Olan Hastalarda Servikal

Epidermodisplazya Verrusiformis: İki Olgu

Game Broadcaster HD 1080p`ye kadar Oyun Kaydetme ve Yayınlama

Screenings Washer Monster

Bidvoice issue 2_Turkish.indd

Hız Ölçüm Deneyi - Enerji Sistemleri Mühendisliği Bölümü

daha sağlıklı olmak ellerinizde

EcoCCompact - Dürr in Brazil