vıbrıo cholerae izolasyonu ve identifikasyonu standart laboratuvar

VIBRIO CHOLERAE
İZOLASYONU VE
İDENTİFİKASYONU
STANDART LABORATUVAR
PROSEDÜRLERİ
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları Daire Başkanlığı
Ulusal Enterik Patojenler Referans Laboratuvarı
Ankara, 2012
2
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
İÇİNDEKİLER
SAYFA
GİRİŞ
5
1.1
Kolera Tanısında Laboratuvarın Rolü
5
1.2
Laboratuvar Rehberinin Oluşturulma Amacı
6
VIBRIO’LARIN İZOLASYONU, İDENTİFİKASYONU VE RAPOR
EDİLMESİ İÇİN PROSEDÜRLER
6
2.1
Giriş
6
2.2
Örneklerin Toplanması ve Gönderilmesi
7
2.2.1
Örnekleme İçin Gerekli Materyal
7
2.2.2
Örneklerin Alınmasında ve Saklanmasında Dikkat Edilecek
Noktalar
7
2.2.3
Örneklerin Gönderilmesinde Dikkat Edilecek Noktalar
8
2.2.4
Örneklerin Kabul Edilmesi İçin Gerekli Minimum Klinik ve
Epidemiyolojik Bilgiler
8
Primer İzolasyon İçin Laboratuvar Prosedürleri
8
2.3.1
Zenginleştirme Besiyerleri
8
2.3.2
Primer Kültür Besiyerleri
9
2.3.3
Koloni Görünümleri
9
2.3.4
V. cholerae şüpheli izolatlarda tarama testleri
12
V. CHOLERAE O1 VE O139’UN SEROLOJİK
İDENTİFİKASYONU
13
3.1
01 ve O139 antiserumları ile ön identifikasyon
13
3.2
Ogawa ve Inaba antiserumları ile V. cholerae O1’in doğrulanması
13
3.3
V. cholerae O139’un doğrulanması
14
3.4
V. cholerae O1 Biyotiplerinin Tanımlanması
14
VIBRIO’LARDA ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTLERİ
15
Disk Difüzyon Yöntemi
15
4.1.1
İnokulumun hazırlanması
15
4.1.2
İnokülasyon
15
4.1.3
Antimikrobiyal diskler
15
4.1.4
İnkübasyon
16
4.1.5
Okuma ve rapor etme
16
4.1.6
V. cholerae’da duyarlılık testlerinde özel durumlar
16
4.1.7
Metodun kalite kontrolü
16
1
2
2.3
3
4
4.1
3
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
SAYFA
İZOLATLARIN SAKLANMASI
18
Kısa Süreli Saklama
18
5.1.1
Yatık Nutrient Agar
18
5.1.2
Suşların Saklanması
18
Uzun Süreli Saklama
19
5.2.1
Dondurarak saklama
19
5.2.2
Liyofilizasyon
20
6
V. CHOLERAE’NIN RAPOR EDİLMESİNDE LABORATUVARIN
SORUMLULUĞU
21
7
23
7.1
V. CHOLERAE İZOLASYON VE İDENTİFİKASYONUNDA
KULLANILAN BESİYERLERİ VE REAJENLER
Alkali peptonlu Su
7.2
Kligler Iron Agar
23
7.3
Aminoasit dekarboksilaz-dihidrolaz tesleri için besiyeri
24
7.4
Oksidaz reajeni
25
7.5
String Test için %0.5’lik sodyum deoksikolat reajeni
25
7.6
Alkalen Taurocholate Tellurite Gelatin (Monsur) Agar
25
7.7
Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) Agar
26
7.8
Alkış Besiyeri
27
8
KOLERA İÇİN STANDART VAKA TANIMI
28
9
KAYNAKLAR
29
ŞEKİLLER
31
5
5.1
5.2
10
23
4
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
1. GİRİŞ
Vibrio cholerae epidemik ve pandemik koleranın etkenidir. Kolera tarih boyunca en çok
korkulan hastalıklardan biri olmuştur. Kayıtlara göre 1817’den günümüze kadar yedi kolera
pandemisi olmuştur. 1992’den önce epidemik koleranın etkeni V.cholerae O1
serogruplarıydı. Ancak 1993 yılında Hindistan ve Bangladeş’te yeni tanımlanan O139
serogrubuna bağlı salgınlar bildirildi. O139, V.cholerae O1 gibi enterotoksin oluşturmaktadır.
Kültür ve biyokimyasal karakterleri aynı olan bu iki serogrup O spesifik antiserumlarla ayırt
edilebilmektedir. 1993’te Bengal’de başlayan bu, O139 serotipi ise sekizinci pandeminin
başlangıcı olarak görülmektedir. Epidemiyolojisi ve etken ile ilgili oldukça detaylı bilgiler
bulunmasına rağmen, bugün bile yeni bir kolera epidemisinin ne zaman ve nerede patlak
vereceğini kestirmemiz neredeyse imkansızdır.
Vibrio cinsi, Vibrionaceae ailesinin büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu cins içinde en az 34
tür tanımlanmıştır. Bunlardan sadece 12’si insanlar için patojen olup diğerleri çevresel
izolatlardır ve deniz Vibrio’ları olarak adlandırılır. Hücre duvarlarında bulunan O somatik
antijenindeki farklılıklara göre 150’nin üstünde farklı serogruba ayrılırlar. Sadece toksijenik
serogrup O1 ve O139 epidemik koleraya neden olur. Diğer serogruplarla nontoksijenik
O1/O139 serogrupları genellikle sporadik özellikteki ishal olgularından sorumludur, koleraya
neden olmazlar. V.cholerae O1, Ogawa, İnaba ve Hikojima serotipleriyle, klasik ve El Tor
biyotiplerine ayrılmaktadır.
Vibrio’lar arasında en önemli iki patojen olan V.cholerae ve V.parahaemolyticus başlıca ishal
etkenleri olarak karşımıza çıkmaktadır. Çoğunluğu son yıllarda tanımlanan yeni Vibrio türleri
ishale ilaveten yara yeri infeksiyonu, septisemi gibi çeşitli barsak dışı infeksiyonlara neden
olurlar. İnsanda Vibrio infeksiyonları, Vibrio’larla kontamine su, su ürünleri ve besin
maddelerinin alımı ya da bunlarla temas sonucu gelişmektedir.
İnsanda hastalığa neden olan Vibrio türleri şunlardır:
V.alginolyticus
V.harveyi/ V.carchariae
V.cholerae
V.cincinnatiensis
V.damsela
V.fluvialis
V.furnissii
V.hollisae
V.metschnikovii
V.mimicus
V.parahaemolyticus
V.vulnificus
1.1 KOLERA TANISINDA LABORATUVARIN ROLÜ
Özellikle salgın durumlarında etkenin izolasyonu, uygun tedavi programlarının
geliştirilebilmesi ve gerekli bilgilerin elde edilebilmesinde laboratuvarlar kritik önem arz
etmektedir. Bir salgın sırasında laboratuvarların yapması gerekenler şu şekilde özetlenebilir:
-
Salgına neden olan organizmanın identifikasyonu,
-
Antimikrobiyal duyarlılık paterninin saptanması,
Antimikrobiyal duyarlılık paterninde meydana gelen değişikliklerin saptanması,
-
Salgının coğrafik dağılımı ve süresinin belirlenmesi.
5
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Dünya Sağlık Örgütü epidemilerde riskin belirlenebilmesi için, bir epidemi kontrol komitesinin
bulunması gerektiğini; ve bu komitede epidemilerin kontrolü ve etken identifikasyonunda
laboratuvarın önemli rol oynamasından dolayı bir mikrobiyoloji uzmanının bulundurulması
gerektiğini önermektedir.
Koleraya bağlı salgın durumlarında salgının sona erdiği süreyi belirlemek de laboratuvarın bir
görevidir. Laboratuvarlar akut sulu diaresi olan hastaların gayta örneklerinin düzenli olarak
incelenmesiyle salgının gerçekten sona erip ermediği hakkında bilgi verirler.
1.2 LABORATUVAR REHBERİNİN OLUŞTURULMA AMACI
Koleranın epidemik risk olduğu ülkelerde salgın durumunda laboratuvarlar ilk plana
çıkmaktadır. Bu anlamda V.cholerae O1-O139 identifikasyonunun yapılabiliyor olması
gerekmektedir. Periferideki laboratuvarlar Vibrio spp. olarak ilk izolatın tanısını koyabilmeli,
sonra da izolatları hem doğrulama hem de antimikrobiyal duyarlılık için Referans
Laboratuvara göndermelidir.
Ülkemizde mikrobiyolojik tanıda standardizasyonun önemine dikkatleri çeken bir referans
laboratuvarı olarak; bir kaynağa duyulan gereksinimden yola çıkılarak bu rehber
hazırlanmıştır. Amacı; Vibrio’ların izolasyonu ve identifikasyonunda kullanılan mikrobiyolojik
prosedürleri tanımlamak; Vibrio infeksiyonlarının tanısı, tedavisi ve hastalıktan korunmada
laboratuvarın klinisyene yardımcı olmasını sağlamaktır.
Kolera; Uluslararası Sağlık Düzenlemeleri (DSÖ, 1969) gereğince uluslararası bildirimi
zorunlu hastalıklar arasında yer almaktaydı. Haziran 2007’den itibaren uygulamaya giren
Uluslararası Sağlık Tüzüğü kapsamında ülkeler her türlü biyolojik, kimyasal ya da nükleer
olaylar dahil olmak üzere halk sağlığı risklerini ve acillerini tespit edip değerlendirmek ve
DSÖ’ye bildirmekle yükümlüdür. Böylece sadece kolera değil salgın oluşturan her türlü
enfeksiyon hastalığının DSÖ’ye bildiilmesi zorunludur.
Bildirimler ülke genelinde hizmet veren bütün sağlık kurumlarından yapılacaktır. Olası bir
kolera vakası telefon ile İl Sağlık Müdürlüğüne bildirilecektir. Poliklinikte saptanan vakalar
Form 016’ya günlük olarak kaydedilecek ve ay sonunda Form 017/A ile İl Sağlık
Müdürlüğüne bildirim yapılacaktır. Ay sonunda sağlık ocaklarından gelen Form 017/A’ların
icmali İl Sağlık Müdürlüklerince yapılıp aylık olarak Sağlık Bakanlığı Temel Sağlık Hizmetleri
Genel Müdürlüğü’ne (TSHGM) gönderilecektir.
2.
VİBRİO’LARIN İZOLASYONU, İDENTİFİKASYONU VE RAPOR
EDİLMESİ İÇİN PROSEDÜRLER
2.1 GİRİŞ
Laboratuvar çalışmasında tanının olabildiğince hızlı konulması kadar, sonucun doğruluğu da
önemlidir. Bununla birlikte araştırmaların kapsamı elde bulunan laboratuvar olanaklarına,
laboratuvar personelinin deneyimine ve kuşkusuz mali kaynaklara bağlıdır. Şekil 1’deki akış
diyagramı Vibrio’ların laboratuvar tanısında önerilen son prosedürleri özetlemektedir.
6
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
2.2 ÖRNEKLERİN TOPLANMASI VE GÖNDERİLMESİ
Vibrio’ların başarılı bir şekilde izolasyonu için öncelikle gerekli klinik örneklerin uygun bir
şekilde alınması ve uygun şartlarda laboratuvara iletilmesi gereklidir. Bu ise iyi bir kurumlar
arası koordinasyonla gerçekleştirilebilir.
Vibrio infeksiyonlarının esasen bir gastrointestinal sistem hastalığı olduğu düşünüldüğünde
başta gayta, rektal sürüntü örnekleri; salgın şüpheli gıda maddelerinden ve sulardan
örneklerin alınması uygundur. Alınan örneklerin spesifik besiyerlerine ekilmek üzere mümkün
olduğunca çabuk laboratuvara iletilmesi önem taşır. Aynı zamanda klinisyen ön tanı
açısından laboratuvarı bilgilendirmelidir.
2.2.1 Örnekleme için gerekli materyal
-
Pamuk uçlu eküvyonlar
-
Gayta kültür kabı
-
Taşıma besiyeri (Cary-Blair)
-
Buz kabı
-
Hasta bilgi ve laboratuvar istek formları
2.2.2 Örneklerin alınmasında ve saklanmasında dikkat edilecek noktalar
Sulu ishali olan hastalardan örnekler özellikle hastalığın başladığı ilk 4 gün içinde ve
antibiyotik tedavisi başlanmadan alınmalıdır. Örneklerin alınacağı kabın temiz olması,
deterjan ve dezenfektanla kontamine olmaması gereklidir. Gayta örneklerinin sürgülerden
alınmaması gereklidir. Rektal swablarla örnek alınacasaksa swablar rektal sfinkterden 2-3
cm içeri sokularak rotasyon yaptırılmalı, swablarda gözle görülebilir fekal örnek olmalıdır.
Gayta örnekleri 2 saat içinde incelenecek ise buzdolabında saklanabilir. Rektal swablar nem
kaybını önlemek için hemen bir taşıma besiyerine (Cary-Blair) alınmalıdır. Örnekler
alındıktan sonra 48 saat içinde laboratuvara ulaştırılamayacak ise 4C’de korunmalıdır.
Kolera şüpheli örnekler eğer soğukta saklama olanakları mevcut değilse 22C-25C’de
transport edilebilirse de soğukta saklamak her zaman tercih edilmelidir. Swab sayısı inoküle
edilecek plate sayısına bağlı olarak değişmektedir. Genellikle birden fazla patojen
incelenecek ise en az iki gayta ya da rektal swab her hastadan alınmalıdır. Swablar aynı
taşıma besiyerine beraber konulabilir.
Cary-Blair bir çok patojen için kullanılan yarı katı bir taşıma besiyeridir. Üretici firmanın
önerileri doğrultusunda hazırlandıktan sonra 13X100 mm’lik tüplere 5-6 mL olacak şekilde
dağıtılır. 100C’de 15 dakika sterilize edildikten sonra kullanıma hazırdır. Soğukta ve
karanlıkta saklanmalıdır. Volüm kaybı, kontaminasyon ya da renk değişikliği olmadığı sürece
bir yıldan uzun süre kullanılabilir.
Amies, Stuart besiyerleri de taşıma besiyeri olarak kulllanılabilir. Ancak V.cholerae için CaryBlair taşıma besiyeri daha üstündür. Buffer gliserol salin Vibrio’lar için uygun değildir. Alkali
peptonlu su (APS) V.cholerae için transportta kullanılabilir ama bunun da Cary-Blair
besiyerine üstünlüğü yoktur. Eğer Cary-Blair taşıma besiyeri mevcut değilse kullanılabilir.
Diğer organizmaların aşırı üremesinden dolayı altı saati aşan nakil durumlarında subkültürler
APS’den yapılmamalıdır. Acil durumlarda (salgın) herhangi bir taşıma besiyeri mevcut
değilse örnekler 3X5 cm’lik filtre kağıdı, gazlı bez ya da pamuk gibi maddelere emdirilerek
nemli ortamlarda kurumaya engel olacak şekilde laboratuvara iletilmelidir.
7
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
2.2.3. Örneklerin gönderilmesinde dikkat edilecek noktalar
Vibrio’ların başarılı bir şekilde izolasyonu; klinik örneklerin uygun bir şekilde alınması ve
uygun şartlarda laboratuvara iletilmesi ile yakından ilgilidir. Bu amaçla hastaya antibiyotik
başlanmadan önce örnek alınmalıdır. Örnekleme ve transport prosedürlerine tam olarak
uyulması gereklidir.
Eğer örnekler hemen ekilemeyecek ise uygun taşıma besiyerine konmalıdır. Transport
esnasında örnekler +4C’de korunmalı 48 saat içinde laboratuvara iletilmelidir.
Toplanan örnekler laboratuvara gönderilmek üzere GÜVENLİ bir şekilde ambalajlanmalıdır.
Kullanılan taşıma besiyerinde agar oranı düşük olduğu için tüpler yatık veya gelişigüzel
ambalajlandığında besiyeri parçalanır ve eküvyonlar pamuklu kısmından ayrılarak koruma
görevi yapmaz. Bunun için tüpler aşağıda tarif edildiği gibi ambalajlanmalıdır:
Öncelikle kutunun tabanı ve yan duvarları naylonla kaplanmalı veya sızdırmaz nitelikte bir
taşıma kabı kullanılmalıdır. Taban kısmına 3-4 kat süzgeç kağıdı yerleştirilmelidir.
Onun üzerine tüplerin dik kalmasını sağlayacak bir tüp standı (supor) konulmalı ve tüpler bu
supora dizilmelidir. Tüp suporunun kenarları ve üst kısmı da süzgeç kağıdı ile desteklenmeli
ve hasta bilgi formları kutuya konduktan sonra kapak sıkıca kapatılmalıdır.
2.2.4 Örneklerin kabul edilmesi için gerekli minimum klinik ve epidemiyolojik bilgiler
Vibrio enfeksiyonlarının izlenmesinde ve mikrobiyolojik- epidemiyolojik sürveyansın başarılı
şekilde yürütülebilmesi için alınan her örnekle beraber hastaya ait klinik ve epidemiyolojik
bilgilerin alınması önemlidir.
2.3 PRİMER İZOLASYON İÇİN LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ
Öncelikle Vibrio türlerinin laboratuvar güvenliği açısından hangi risk grubuna girdiğinin
bilinmesi önemlidir. Vibrio türleri Risk Grubu 2’ye girmektedir. Bu türlerle yapılan
çalışmalarda P2 düzeyinde laboratuvar koşulları sağlanmalıdır.
2.3.1 Zenginleştirme besiyerleri
Alkali peptonlu su (APS) zenginleştirme, Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar (TCBS)
selektif agar olarak tavsiye edilmektedir. Bununla birlikte fekal örneklerden V.cholerae
izolasyonunda zenginleştirme besiyerleri gerekli değildir. Konvelasan dönemdeki hasta
örneklerinde, asemptomatik infeksiyonlarda ve çevresel örneklerde zenginleştirme besiyeri
olarak APS tavsiye edilmektedir.
APS’ye alınan gayta örneğinin besiyerinin volümünün %10’undan fazla olmaması gerekir.
Örnekler 35-37 C’de 6-8 saat inkübasyonun ardından TCBS besiyerine APS’den bir öze
dolusu ve özellikle buyyonun yüzeyinden olacak şekilde ekimler yapılmalıdır. Subkültür
öncesi buyyon vortekslenmemelidir. Eğer TCBS agara ekim 6-8 saatten daha geç
yapılıyorsa, ikinci bir APS buyyona ekim yapılarak 6-8 saat inkübasyonun ardından bu ikinci
buyyondan subkültür yapılması gerekmektedir.
8
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
2.3.2 Primer kültür besiyerleri
Kanlı agar 35-37 C’de 18-24 saat inkübe edilir.
TCBS agar 35-37 C’de 18-24 saat inkübe edilir.
Monsur agar 35-37 C’de 18-24 saat inkübe edilir.
Alkış besiyeri 35-37 C’de 18-24 saat inkübe edilir.
2.3.3 Koloni görünümleri
Kanlı agarda 2-3 mm çapında hemolotik koloniler izlenir.
TCBS besiyerinde 2-4 mm çapında, V.cholerae’da sukroz fermentasyonuna bağlı sarı-parlak,
sukrozu fermente etmeyen Vibrio’larda ise yeşil koloniler izlenir. Kültürler inkübatörden
alındıktan sonra hızlıca incelenmelidir. Çünkü oda ısısında bekletilecek olursa sarı renkli
görünüm yeşil renge dönüşebilmektedir. TCBS’de Vibrio türlerinin koloni renkleri aşağıda
belirtilmektedir (Tablo 1).
Vibrio ve fenotipik olarak benzer diğer cinslerin ayrımında kullanılan özellikler Tablo 2’de
özetlenmiştir.
V.cholerae serogrup O1 ve O139’un izolasyon ve identifikasyonunda kullanılan akış şeması
Şekil 1’de özetlenmiştir.
Tablo 1: Vibrio türlerinin TCBS besiyerindeki koloni görünümleri
Organizmalar
TCBS’deki koloni görünümü
V.cholerae
Sarı
V.alginolyticus
Sarı
V.cincinnatiensis
sarı
V.damsela
Yeşil
V.carchariae
Sarı /yeşil
V.fluvialis
Sarı
V.furnissii
Sarı
V.hollisae
Yeşil
V.parahaemolyticus
Yeşil
V.metschnikovii
Sarı
V.vulnificus
Yeşil
V.mimicus
Yeşil
Aeromonas species
Sarı
Pseudomonas türleri
Mavi /yeşil*
Proteus
Sarı /yeşil*
Sarı
Enterococcus species
*Bu koloniler Vibrio’ların oluşturdukları kolonilerden daha küçüktür.
9
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Klinik Örnekler (gaita, rektal sürüntü, kusmuk)
APS*
(isteğe bağlı)
370C’de 6-8 saat ink.
TCBS
Agar1
Kanlı
Agar
370C’de 24 saat
ink.
370C’de 24 saat
ink.
Şüpheli koloniler
TCBS-sarı koloniler
Kanlı agar-Hemolitik kol.
oksidaz
Biyokimyasal testler;KIA ekim, glukozdan gaz ve
asit oluşumu, indol testi, sitrat kullanımı,Voges
Proskauer reaksiyonu, üreaz aktivitesi, hareket testi,
lizin-ornitin dekarboksilasyonu, arginin
dihidrolasyonu,sukroz fermentasyonu, CAMP testi
Aglütinasyon yapıldıktan sonra
Referans Lab.a gönder
(konfirmasyon ve moleküler
epidemiyolojik çalışmalar için)
Polivalan Antiserumlarla aglütinasyon
REFERANS LABORATUVAR
Antibiyotik duyarlılık
Serotiplendirme (O1 ve O139)
O129 (10 ve 150µg) duyarlılığı
Moleküler tiplendirme
Toksin varlığının gösterilmesi
1
TCBS: Thiosülfate citrate bile salts sucrose Agar;
Şekil 1: V.cholerae serogrup O1 ve O139’un izolasyon ve identifikasyon şeması
10
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Tablo 2: Vibrio ve fenotipik olarak benzer diğer cinslerin ayrımında kullanılan özellikler
Reaksiyon veya özellik a
Test veya Özellik
Vibrio
Photobacterium
Aeromonas
Plesiomonas
Enterobacteriaceae
İnsanda ishal veya barsak dışı enfeksiyona yol açma
+
-d
+
+
+
Oksidaz reaksiyonu
+
+
+
+
-
Üreme için Na+’a ihtiyaç gösterme veya stimüle olma
+
+
-
-
-
+
+
-
+
-
D-Mannitol fermentasyonu
+
-
+
-
+
TCBS’de üreme c
+
+
+
-
-
Vibriyostatik bileşik O/129’a duyarlılık
b
a
Semboller:
b
2, 4-diamino-6, 7-diisopropylpteridine phosphate (150 g’lık diskler); O/129’a direnç Hindistan ve Bangladeş’teki V. cholerae suşlarında yaygındır.
c
TCBS’te Aeromonas üremesi ticari üretici firmanın ürününe bağlıdır.
d
Photobacterium damselae bu sınıflandırmanın dışındadır.
+, çoğu tür ya da suş pozitif;
-, çoğu tür ya da suş negatif
11
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
2.3.4 V.cholerae şüpheli izolatlarda tarama testleri
Fekal örneklerde V.cholerae şüphesi varsa O1 ve O139 serumları ile test öncesi
biyokimyasal testlerin uygulanması gerekli değildir. Eğer antiserumların sağlanmasında
sorun varsa antiserumlarla test öncesi oksidaz bakılması önerilmektedir.
Tablo 3: V.cholerae tanısında kullanılan tarama testleri
Tarama testleri
V.cholerae’da izlenen reaksiyon
Oksidaz testi
Pozitif
String test
Pozitif
KIA
Dip sarı, yüzey kırmızı (Asit/alkali), gaz yok
TSI
Dip sarı, yüzey sarı (Asit/Asit), gaz yok
Lizin dekarboksilasyonu
Pozitif
Gram boyama
Küçük, Gram negatif kıvrık basiller
Direkt preparat
Küçük, kıvrık, hareketli basiller
O129 diskine duyarlılık
150 g’lık diske Vibrio türlerinin çoğu duyarlıdır
2.3.4.1 Oksidaz testi: Vibrio türleri oksidaz pozitiftir. Oksidaz testi karbonhidrat içeren
besiyerlerindan (TCBS) yapılacak olursa yanlış negatif ya da yanlış pozitif sonuçlar
alınabileceğinden test öncesi nutrient veya kanlı agara subkültürlerin yapılması
gerekmektedir.
2-3 damla oksidaz reajeni (%1 N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine) filtre kağıdına
damlatılır. Koloniden platin özelerle alınan örnek oksidaz reajeni ile incelendiğinde pozitif
reaksiyonda 10 saniye içinde mor bir renk ortaya çıkar. Test 10 saniyeden sonra pozitiflik
veriyorsa değerlendirilmemelidir. Aynı zamanda pozitif ve negatif kontroller mutlaka
kullanılmalıdır.
2.3.4.2 String test: Bu test genellikle V.cholerae’nın Aeromonas türlerinden ayrımı için
kullanılmaktadır. Heart infüzyon agar gibi selektif olmayan bir besiyerinden alınan kolonilerin
bir damla %0.5’lik sodyum deoksikolat ile aköz bir süspansiyonu elde edilir. Hücrelerde
türbidite kaybına bağlı olarak DNA ortaya çıkmakta ve visköz bir hal almaktadır. Karışım öze
ile kaldırıldığında ip şeklinde uzama görülmektedir ki pozitif reaksiyonu işaret etmektedir.
V.cholerae pozitif, Aeromonas türleri negatiftir. Diğer Vibrio türleri pozitif ya da zayıf pozitiflik
vermektedir.
2.3.4.3 KIA ve TSI agar : V.cholerae KIA’da dip sarı, yüzey kırmızı (Asit/alkali), gaz ve H2S
oluşturmaz. TSI agarda ise dip sarı, yüzey sarı (Asit/asit), gaz ve H2S oluşturmaz.
2.3.4.4 Lizin dekarboksilasyonu: Vibrio türlerinin Aeromonas türlerinden ayrımında
kullanılır. V.cholerae lizini dekarboksile eder.
2.3.4.5 Gram boyama: Gramla boyandığında koloniler karakteristik olarak virgül şeklinde
izlenir.
2.3.4.6 Direkt preparat: Karanlık alan ya da faz kontrast mikroskobuyla incelendiğinde tipik
olarak virgül şeklinde, hareketli kıvrık basiller izlenir.
12
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
2.3.4.7 Pteridin O129 diskine duyarlılık ( 10 ve 150 g’lık diskler ): Vibrio türlerinin çoğu
150 g’lık diske duyarlıdır. Ancak 10 g’lık diske duyarlılık farklılık göstermektedir.
V.cholerae O1 ve O139’un bazı suşları her iki diske de dirençli olabilir. Vibriostatik bir ajan
lan O129 (2,4-Diamino-6,7-di-iso-propylpteridine phosphate) Vibrio’ların Gram negatif
çomaklar ve özellikle Aeromonas’lardan ayrımında kullanılır.
Kanlı agar ya da Mueller Hinton agar yüzeyine incelenecek koloniler inoküle edilir. Her bir
plağa birer adet 10 g ve 150 g’lık O129 diskleri yerleştirilir. 24 saat 35C’de inkübe edilir.
İnhibisyon zonları değerlendirilir.
O129’a duyarlılık durumu:
Aeromonas sp. : Dirençli
V.cholerae: Duyarlı
V.parahaemolyticus: Kısmen duyarlı
3.
V.CHOLERAE O1 VE O139’UN SEROLOJİK İDENTİFİKASYONU
3.1. O1 ve O139 antiserumları ile ön identifikasyon
Selektif olmayan bir besiyerinde V.cholerae şüpheli taze kültürlerden polyvalan O1 ve O139
antiserumları kullanılarak lam aglutinasyonu yapılır. Öncelikle O1 antiserumu ile aglutinasyon
bakılır. Negatif ise O139 ile aglutinasyon incelenir. İkisinden biriyle pozitiflik saptanmışsa
V.cholerae O1 veya O139 ön tanısı ile rapor edilebilir. Daha sonra V.cholerae O1 pozitif
saptanan örnekler monovalan Ogawa ve İnaba antiserumlarıyla test edilir.
3.2. Ogawa ve Inaba antiserumları ile V.cholerae O1’in doğrulanması
V.cholerae O1 serogrubu Inaba, Ogawa ve Hikojima olmak üzere üç serotipe ayrılmaktadır.
Serotip identifikasyonu tipe spesifik O antijenlerini içeren monovalan antiserumlarla
yapılmaktadır. Bir V.cholerae O1 izolatının identifikasyonunun doğrulanmasında Ogawa veya
Inaba antiserumlarından biri ile pozitiflik vermesi yeterlidir. Eğer izolat Ogawa ve Inaba
antiserumlarından biriyle zayıf veya yavaş aglutinasyon veriyorsa ya da aglutinasyon
izlenmiyorsa O1 serogrubu değildir.
Serotipe spesifik antiserumun absorbe edilmesine bağlı olarak, serotipin biri diğerine göre
daha yavaş veya zayıf aglutinasyon verir. Bu nedenle Ogawa ve Inaba antiserumu ile
aglutinasyon simultane olarak incelenmeli ve daha hızlı ve güçlü reaksiyon veren kabul
edilmelidir. Her iki antiserumla da güçlü ve eşit aglutinasyon nadirdir. Bu durumda izolat
referans laboratuvara gönderilmeli ve “muhtemel Hikojima serotipi” olarak belirtilmelidir.
Aglutinasyon testlerinin yapımı için temiz bir lama iki damla steril serum fizyolojik (SF)
damlatılır. Selektif olmayan bir besiyerinden öze ile alınan koloniler SF ile emülsifiye edilir ve
homojen bir süspansiyon elde edilir. Süspansiyonlardan birine eşit miktarda antiserum
damlatılır, diğer süspansiyon kontrol olarak kullanılır. Lamlar nazikçe ve yan çevrilmeyecek
şekilde döndürülerek aglutinasyonun gelişip gelişmediği incelenir. 30 saniye-1 dakika
arasında antiserum damlattığımız damlada kümeleşme olması pozitiflik anlamına
gelmektedir. Eğer kontrol olarak kullandığımız damlada da pozitiflik saptıyorsak bu
otoaglutinasyonu gösterir ve değerlendirme yapılmaz.
13
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Tablo 4: V.cholerae serogrup O1’in serotipleri
V.cholerae O1 serotipleri
Ogawa antiserumu
Inaba antiserumu
Ogawa
+
-
Inaba
-
+
Hikojima
+
+
3.3. V.cholerae O139’un doğrulanması
V.cholerae şüpheli bir izolat, O139 antiserumu ile reaksiyon veriyor ama polyvalan O1
antiserumu ile reaksiyon vermiyorsa referans laboratuvara gönderilmelidir. V.cholerae
O139’un doğrulanmasında, enterotoksin oluşturup oluşturmadığı ve O139 antijeninin varlığı
araştırılmalıdır. O139 serogrubu serotip içermemektedir.
3.4 V.cholerae O1 biyotiplerinin tanımlanması
V.cholerae O1 suşları bazı biyolojik özelliklerine göre klasik ve El Tor biyotiplerine
ayrılmaktadır.
Tablo 5: V.cholerae O1 klasik ve El Tor biyotiplerinin ayırıcı özellikleri
KLASİK
EL TOR
String test
+
+
Koyun kanlı agarda beta hemoliz
-
+
Voges-Proskauer testi
-
+
Tavuk eritrositlerinin aglutinasyonu
-
+
Polimiksin B (50 U) duyarlılığı
S
R
Faj IV duyarlılığı
S
R
CAMP
-
+
TEST
(+): pozitif test; (-): negatif test; S: duyarlı; R: dirençli
El Tor ve non O1 suşlar CAMP pozitif, klasik suşlar CAMP negatiftir.
El Tor sosis şeklindeki hemoliz zonu ile daha dar hemoliz yapan non O1 izolatlardan ayrılır.
14
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
4.
VIBRIO’LARDA ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTLERİ
Günümüzde antimikrobiyal ilaçlara direnç sorunu dünya çapında artmaktadır. Dolayısıyla
V.cholerae O1 ve O139 suşlarında antimikrobiyal duyarlılığın monitorizasyonu kaçınılmaz hal
almaktadır. V.cholerae’da antimikrobiyal duyarlılık testlerindeki bazı özel konular aşağıda
belirtilmektedir.
4.1 Disk-difüzyon yöntemi
Bu testte Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) tarafından önerilen agar besiyeri
Mueller Hinton Agar (MHA) besiyeridir. Bu besiyeri ticari olarak elde edilebilmekte olup,
önerilere uygun olarak hazırlanmalı, otoklavlandıktan sonra su banyosunda 45-50C’ye
soğutulup 4 mm kalınlığında olmak üzere petrilere (15X150 mm’lik plaklara yaklaşık 25-30
mL ) dökülmelidir. Agarın kalınlığı 4 mm’den fazla olursa yanlış dirençli, az olduğunda ise
yanlış duyarlı sonuçların alınmasına neden olur. Besiyerleri nem kaybını önlemek için plastik
torbada saklanmalıdır, hazırlandıktan sonra 7 gün içinde kullanılmalıdır. Besiyerinin pH’sı
oda ısısında 7.2-7.4 olmalıdır.
Kullanımdan hemen önce besiyerinin yüzeyinde fazla nem olduğunda inokülasyon
yapılmamasına dikkat edilmelidir. Besiyerleri etüvde kapakları açık olmamak kaydıyla 10-30
dakika tutulduktan sonra kullanılmalıdır.
4.1.1 İnokulumun hazırlanması
İnokulumun yoğunluğunun standardize edilmesi önemlidir. Yoğun hazırlanan durumlarda
yanlış dirençli sonuçların alınması mümkündür. Standart McFarland 0.5 baryum sülfat
bulanıklığına göre ayarlanır. Bu süspansiyonda yaklaşık 108 cfu/mL yoğunluğunda bakteri
vardır ve hazırlandıktan sonra 15 dakika içinde kullanılmalıdır. Kullanımdan önce vorteksle
karıştırılmalıdır. Karanlıkta ve oda ısısında saklanmalıdır. Hazırlandıktan 6 ay sonra standart
kontrol edilip bozulma saptanırsa yeni bir standart hazırlanmalıdır. Bu bulanıklığa ulaşmak
için bir gecelik selektif olmayan bir besiyerinden benzer morfolojiye sahip 4-5 koloni yine 4-5
mL Mueller Hinton Broth’a (MHB) aktarılır. 2-8 saat 35-37C’de inkübe edilip McFarland 0.5
bulanıklığına ayarlanır.
4.1.2 İnokülasyon
İnokulum süspansiyonu hazırlandıktan sonra 15 dakika içinde MHA’a inoküle edilmelidir.
Steril pamuklu eküvyonun tüpe batırılıp fazla sıvının bırakılmasından sonra inokülasyona
geçilir. Tüm agar yüzeyine yaklaşık 60 derecelik açılarla 3 kez yayıldıktan sonra eküvyon son
olarak plağın çevresinde gezdirilir.diskler bundan sonra 15 dakika içinde konmalıdır. Diskler
konmadan önce nemin absorbe olması için 3-5 dakika beklenmelidir.
4.1.3 Antimikrobiyal diskler
Antimikrobiyal diskler ışıktan korunmalıdır. Bu durum özellikle ışığa duyarlı olan
metranidazol, kloramfenikol, ve kinolonlar için önemlidir. Dondurucudan ya da buzdolabından
çıkarılan diskler oda ısısına geldikten sonra steril bir pens veya iğne ucu ile agar yüzeyine
yerleştirilir. Üzerlerine hafifçe bastırılarak besiyerine tamamen temas etmeleri sağlanmalıdır.
Diskler merkezinden merkezine 24 mm olacak şekilde yerleştirilmelidir. 150 mm’lik plakta 12,
15
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
100 mm’lik plakta ise 4’den fazla disk olmamalıdır. Bazı diskler agar yüzeyine temas eder
etmez diffüze olmaya başlar bu nedenle diskin yeri değiştirilmemelidir. Hazır olarak elde
edilen diskler uzun süre saklanacaksa ilaca bağlı olarak buzdolabında ya da dondurularak
saklanmalıdır. Hemen kullanılacak miktarda diskler 1 hafta kadar buzdolabında saklanabilir.
Kutuların kapakları sıkıca kapanmalı ve nemli ortamda tutulmamalıdır.
V.cholerae izolatlarının duyarlılık testlerinde önerilen antimikrobiyal ajanlar trimetoprimsülfametaksazol, kloramfenikol, furazolidon ve tetrasiklin’dir. Tetrasiklin disklerine duyarlılık
aynı zamanda doksisikline de duyarlılığı göstermektedir.
4.1.4 İnkübasyon
Diskler yerleştirildikten sonra en fazla 15 dakika içinde plaklar ters çevrilerek 35-37C’lik
inkübatöre kaldırılır. Bu sürenin uzaması antimikrobiyal ajanın daha fazla diffüze olmasına
neden olacaktır.
4.1.5 Okuma ve rapor etme
Plakların inkübasyonu 16-18 saattir. İnokülasyon işlemi doğru yapılırsa ve inokulumun
yoğunluğu tam ayarlanmışsa inhibisyon zonlarının tam yuvarlak olduğu ve plakta yoğun bir
üreme olduğu gözlenir. Tek tek düşen kolonilerin varlığı inokulumun yeterince yoğun
olmadığını gösterir ki testin tekrarını gerektiren bir durumdur. Zon çapları cetvelle ölçülerek
değerlendirilmelidir.
4.1.6 V.cholerae’da duyarlılık testlerinde özel durumlar
Disk difüzyon tekniği en sık kullanılan metod olsa da V.cholerae O1 ve O139 için sadece
ampisilin, kloramfenikol, sülfonamidler, tetrasiklin ve trimetoprim-sülfametaksazol için zon
çapları belirlenmiştir. Eritromisin ve doksisiklin V.cholerae’da disk difüzyonla doğru sonuç
vermeyeceğinden bu metot uygun değildir. Tetrasiklin diskine duyarlılık doksisikline de
duyarlılığı düşündürür.
Siprofloksasin, furazolidon ve nalidiksik asit için disk difüzyon sonuçlarının güvenilirliği
onaylanmamıştır. V.cholerae için uygun bir yöntem bulunana kadar deneysel olarak
Enterobactericeae için belirlenmiş kriterler kullanılarak siprofloksasin’e direnci saptamak için
disk difüzyon kullanılabilir. Bu yöntem furazolidon ve nalidiksik asit için de uygulanabilir
ancak sonuçlar yorumlanırken dikkat edilecek nokta; bu ajanlar intermediate ise dirençli
olarak rapor edilmesidir.
4.1.7 Metodun kalite kontrolü
Kalite kontrolünde amaç testin doğruluk ve katiliğinin, vasatların ve disklerin çalışmasının
izlenmesi, testi yapan ve okuyan kişilerin takibidir. Bu amaçla genetik stabilitelerine ve bu
teste uygunluklarına göre referans suşlar tespit edilmiştir.
Kontrol organizma
E.coli
ATCC 25922
16
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Her disk difüzyon testi yapılan gün kontrol suşlarda denenmelidir. Ancak günlük kontrol
testlerinde tatminkar sonuç alınırsa bu testlerin sayısı haftada bire indirilir. Her bir ilaç –
kontrol suşu kombinasyonu için 20 zon çapından bir tanesinin kontrol sınırları dışında
olmasına müsaade edilir.
V. cholerae için disk difüzyon yöntemi ile ampisilin, tetrasiklin ve trimetoprim-sülfametoksazol
sonuçları sıvı mikrodilüsyon ile belirlenmiş sonuçlarla iyi bir korelasyon göstermektedir.
Eritromisin için disk difüzyon testi kullanılmamalıdır, çünkü MİK sonuçları ile korelasyon
zayıftır.
Tablo 7’de V.cholerae ve E.coli ATCC 25922 için antimikrobiyal disklerin zon çapları
görülmektedir.
Tablo 6: Antimikrobiyal duyarlılık testlerinde V.cholerae için kullanılan zon çapları
Zon çapları (mm)
Diskin
potensi
(g)
Dirençli
Orta Duyarlı
Duyarlı
E.coli
ATCC
25922
Ampisilin a
10
<=13
14-16
>=17
16-22
Kloramfenikol a,b
30
<=12
13-17
>=18
21-27
Furazolidonc
(V.cholerae için)
100
<18
-
>=18
22-26
Trimetoprimsülfametoksazol a
1.25 /23.75
<=10
11-15
>=16
23-29
Sülfonamidler
250 veya
300
<=12
13-16
>=17
15-23
Tetrasiklin a, c
30
<=14
15-18
>=19
18-25
Siprofloksasin a. d, e
5
<=15
16-20
>=21
30-40
Nalidiksik asit e
(V.cholerae için)
30
<19
-
>=19
22-28
Antimikrobiyal ajan
a
Kaynak: CLSI (2007) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth
Informational Supplement. CLSI document M100-S17 [ISBN 1-56238-625-5]. CLSI 940 West Valley
Road, Suite 1400,Wayne, PA 19087-1898 USA.
b
Disk difüzyon testinde okumalar yapılırken bir çok organizma için minör hatalar olabilir.
c
Tetrasiklin sonuçları izolatların doksisikline duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir; MİK sonuçları ile
zayıf korelasyon verdiğinden doksisiklin için disk difüzyon testi kullanılmaz.
d
Shigella ve Enterobactericeae için disk difüzyon sonuçları belirtilmiştir. CLSI tarafından V.cholerae
için kriterler tam olarak belirlenmemiştir.
e
Sülfizoksazol diski, mevcut sülfonamid preparatlarından herhangi birisi için kullanılabilir.
f
Multi laboratuvar çalışmalar baz alınmalıdır. NCCLS tarafından V.cholerae için kriterler tam
belirlenmemiştir.
17
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
İZOLATLARIN SAKLANMASI
5.
Vibrio izolatlarının birkaç günlük saklamaları için 22C-25C’de katı besiyerleri kullanılabilir.
Eğer kültürler daha uzun süre saklanmak isteniyorsa bu durumda seçilecek olan metod
saklama süresine ve laboratuvarın olanaklarına değişmektedir.
5.1 Kısa süreli saklama
Enterik bakteriler için kanlı agar, tryptone soy agar ve heart infusion agar saklamak için ideal
kültür vasatlarıdır. Bakterilerin metabolizmalarına bağlı oluşan asidik ürünler, hızla canlılığın
azalmasına neden olabildiğinden karbonhidrat içeren besiyerleri (KIA, TSI) önerilmemektedir.
Saklama besiyeri için tüpler otoklavdan çıktıktan sonra eğik şekilde, yatık kısım kısa olacak
şekilde hazırlanır. İnokülasyon için mediumun önce dibine batırılıp sonra yatık kısma doğru
saf kolonisi elde edilmiş bakteri kültüründen öze ile ekimler yapılır. 35-37oC’de bir gece
inkübe edilir. Tüplerin kapaklarının sıkıca kapanıyor olması, hava almaması gerekmektedir.
Bu şekilde 22-25oC’de karanlıkta saklanabilir. Mediumun kurumasını önlemek için besiyerini
kapatacak kadar steril mineral-oil kullanılabilir. Subkültür yapılması durumunda mineral-oil’ın
atılmasına gerek yoktur. Bu şekilde suşlar birkaç yıl saklanabilir.
5.1.1. Yatık Nutrient Agar*
a) Temiz bir erlen alınır. İçine bir adet manyetik bar konulur.
Meat ekstrakt
3.0 g
Pepton
5g
Agar
12-18 g**
Distile su
1000 mL
b) Yukarıdaki maddeler karıştırılır, kaynayana kadar ısıtılır. pH ölçülür ve 7.2’ye ayarlanır.
c) Burgu kapaklı tüplere 5 mL olacak şekilde dağıtılır.
d) 121oC’de 15 dakika sterilize edilir.
5.1.2. Suşların saklanması
Öncelikle saklanmak istenen suşun saf kültürü elde edilmiş olmalıdır. Ardından;
a) Nutrient agar plağının üzerine izolatın adı ve tarih yazılır.
b) İzolatın saf kültüründen, birer öze dolusu olacak şekilde yoğun ekimler yapılır.
35-37oC’de, 24 saat inkübe edilir.
*Suşların RSHMB Ulusal Enterik Patojenler Referans Laboratuvarına gönderilmesinde
yatık nutrient agar tercih edilecektir.
**Suş gönderilirken agar oranının düşürülmesi (12-15 g/L) önerilir.
18
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
c) Önceden hazırlanmış olan yatık nutrient agar besiyeri alınır. Üzerine izolatla ilgili
bilgiler kaydedilir.
d) Bir öze yardımıyla mediumun önce dibine batırılıp sonra yatık kısma doğru saf
kolonisi elde edilmiş bakteri kültüründen ekimler yapılır.
e) 35-37oC’de bir gece inkübe edilir.
f)
Bu şekilde karanlıkta +40C’de saklanır.
5.2 Uzun süreli saklama
Bakteri kültürleri dondurularak veya liyofilize edilerek saklanabilir. Bu amaçla kullanılan çeşitli
vasatlar vardır. Skim milk, kan, %15-20 gliserol içeren trypton soy broth dondurarak
saklamada; skim milk, serum bazlı besiyerleri ve polyvinylpyrrolidone ise liyofilizasyon için
kullanılabilir.
5.2.1 Dondurarak saklama
İzolatlar -70C’de ve altında saklanabilir. -20C’de saklama bazı bakterilerin canlılıklarının
kaybedebileceğinden dolayı önerilmemektedir.
Saklama besiyerinin hazırlanması
%16’lık Glycerol’lü Buyyon
a) 250 mL’lik temiz bir erlen alınır. İçine bir adet manyetik bar konulur.
Trypton soy broth w/o
dextrose (Difco 0862-01)
1.0 g
Glycerol
10 mL
Distile su
40 mL
b) Manyetik karıştırıcıda karıştırılır, eritilir. pH ölçülür ve 7.2’ye ayarlanır.
c) 115C’de 10 dakika otoklavlanır.
d) Ağzı burgu kapaklı, steril, plastik derin dondurucu tüplerine yaklaşık 1.5 mL’lik
miktarlarda biyogüvenlik kabini altında dağıtılır.
19
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Suşların saklanması
Öncelikle saklanmak istenen suşun saf kültürü elde edilmiş olmalıdır. Ardından;
a) İki adet nutrient agar plağının üzerine izolatın adı ve tarih yazılır.
b) İzolatın saf kültüründen, birer öze dolusu olacak şekilde yoğun ekimler yapılır.
c) 24 saat inkübe edilir
d) Önceden %16’lık glycerol buyyon konmuş olan iki adet derin dondurucu tüpü alınır.
e) Bir öze yardımıyla bir plaktaki yoğun üremenin tamamı bir tüpe olacak şekilde bakteri
toplanır. Tüp içindeki buyyonda homojenize edilir. Vortekslenir.
f)
Koleksiyon kayıt defterine suşun kimlik bilgileri ve tarih yazılır.
g) Tüplerden biri -20C’ye (1-2 yıl için), diğeri -70C’ye (en az 8-10 yıl için) kaldırılır
(karışıklığı önlemek için izolatların belirli bir kodlama düzeninde saklama kutularına
ve derin dondurucuya yerleştirilmesi gerektiği unutulmamalıdır).
5.2.2 Liyofilizasyon
Bir çok mikroorganizmanın saklanması için uygun bir yöntemdir. Liyofilizasyonda basıncın
azaltılması ile bakteri süspansiyonunun sublimasyonu sağlanıp içindeki su
uzaklaştırılmaktadır. Liyofilize edilmiş suşlar 4C’de saklanabilir.
20
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
6
VIBRIO
CHOLERAE’NIN
LABORATUVARIN SORUMLULUĞU
RAPOR
EDİLMESİNDE
Bilindiği üzere, Temel Sağlık Hizmetleri Genel Müdürlüğünün 2004/129 sayılı "Bulaşıcı
Hastalıkların İhbarı ve Bildirim Sistemi" genelgesi ile; 2005 yılı Ocak ayından itibaren
yürürlüğe konan "Bulaşıcı Hastalıkların İhbarı ve Bildirim Sistemi " yönergesi ve "Bulaşıcı
Hastalıkların İhbarı ve Bildirim Sistemi Standart Tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi"nde
yer alan Grup D etkenlerinin bildirimi doğrudan laboratuvarlar tarafından yapılmaktadır. Bu
şekilde güncellenen sürveyans sistemi; laboratuvarların, bulaşıcı hastalıklar sürveyans
sistemine doğrudan veri sağlamasına olanak sağlamıştır. İlgili rehberde, bildirimi istenilen
bazı mikroorganizmaların tür düzeyinde tiplendirilmesine ilişkin ise referans laboratuvarlara
suşların gönderilmesi ve bu şekilde özellikle Grup D etkenlerinin tür ve serogrup düzeyinde
tiplendirilmesi suretiyle sistemin, ülkeye özgü mikroorganizma türlerinin belirlenmesine ışık
tutması hedeflenmiştir. Bulaşıcı hastalıklar sürveyans sistemine göre hastayı gören hekim
tarafından bildirimi zorunlu bir enfeksiyon etkeni olmakla birlikte, standart vaka tanımına göre
kesin vaka bildirimi için laboratuvardan doğrulanmış olması gerekmektedir. Kolera şiddetli
dehidratasyona neden olduğundan, V. cholerae O1 ve O139’un izole ve identifiye edildiğinde
acilen hastanın doktoruna bildirilmelidir. Vaka aynı zamanda İl Sağlık Müdürlüğü’ne hemen
telefonla bildirilmelidir.
Koloni morfolojisi, üreme ve biyokimyasal özellikleri V. cholerae ile uyumlu bulunan suşlar,
ileri identifikasyon, tiplendirme, antimikrobiyal duyarlılık testleri ve toksin varlığının tespiti için
nutrient agarda Referans Laboratuvara gönderilmelidir. V. cholerae şüpheli suşlar nutrient
agara yoğun şekilde pasajlandıktan, üçlü paketleme sistemine göre (bkz. Genel Hususlar
kitapçığı, Enfeksiyöz Materyalin Paketlenmesi ve Transportu: Genel İlkeler) ve kargo ile
laboratuvara gönderilir. Nutrient agarın tercihen vidalı kapaklı plastik tüplerde hazırlanması
ve ekim yapıldıktan sonra olası bir sızmayı engelemek için kapağın etrafının parafilm ile
sarılması önerilir. Plak besiyerine pasajlanacaksa bir gece 37C’de inkübe edilip, koloniler
üredikten sonra gönderilir. Suşların beraberinde, suşlara ait bilgileri içeren suş bilgi formu da
(Şekil 2) doldurularak paketin içine yerleştirilir. Paket aşağıdaki adrese kargo ile gönderilir.
Paket gönderilmeden önce laboratuvar, telefon veya e-posta ile bilgilendirilir.
Gönderi Adresi:
Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı
Salgın Hastalıklar Araştırma Müdürlüğü
Ulusal Enter ik Patoj enler Ref erans Lab oratuvar ı
Cemal Gürsel Cad. No:18
06100 Sıhhiye-ANKARA
Tel: 0 312 458 21 65
Faks: 0 312 458 24 08
21
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı
Salgın Hastalıklar Araştırma Müdürlüğü
Ulusal Enterik Patojenl er Referans Laboratuvarı
SUŞ BİLGİ FORMU
Hastanın
Suş No
ÖRNEK
Vaka
Adı
Soyadı
Prot.
Yaşadığı Seyahat
Yaşı Cinsiyeti
Başvurusu
No
Şehir Öyküsü
Ahmet
Güven
3713 17
K
Ankara
Adana
Yatan hasta/ Hasta/
Poliklinik Taşıyıcı
Epidemiyolojik Örneğin Örneğin Suşun İzole
SONUÇ
özellik
orijini
Cinsi Edildiği Tarih
Sporadik/
Salgın
İnsan/
Gıda/
Su
Kan
16.04.2008
Not
Vibrio
cholerae
1
2
3
4
5
6
Şekil 2: Suş Bilgi Formu
22
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
7
V.CHOLERAE
İZOLASYON
VE
İDENTİFİKASYONUNDA
KULLANILAN BESİYERLERİ VE REAJENLER
7.1 Alkali peptonlu su (APS)
Pepton
10.0 g
NaCl
10.0 g
Distile su
1000.0 mL
Yukarıdaki karışım 3N NaOH ile pH’sı 8.5 olacak şekilde ayarlanır. Tüplere dağıtıldıktan
sonra 121C’de 15 dakika otoklavlanır. 4C’de pH değişimi ve buharlaşma olmadığı sürece 6
aydan uzun süre saklanabilir. Kullanım öncesi kalite kontrolü yapılmalıdır.
7.2. Kligler Iron Agar (KIA) ve TSI agar
Materyal:
Kligler Agar Base
Distile su
55 g
1000 ml
Not: TSI besiyerinin KIA ‘dan tek farklı içerisinde sukroz bulunmasıdır.
Hazırlanması:
Üretici firmanın önerileri doğrultusunda, erlen içine 55 g Kligler Agar base konur ve içine
distile su eklenir. Isıtılarak iyice eritilir. pH 7.4’e ayarlanır. 16 X 25 cm boyutundaki tüplere 5-7
mL olacak şekilde dağıldıktan sonra, 121°C de 15 dakika otoklavlanır. Tüpler yatık
pozisyonda, dip kısmı 3 cm, yüzeyi 2 cm olacak şekilde ayarlanarak dondurulur.
Etiketlenerek besiyerinin adı, hazırlanma ve son kullanma tarihleri yazılır. Kapaklı tüplerde
4C’de 6 ay saklanabilir. Kullanım öncesi kalite kontrolü yapılmalıdır.
Testin yapılışı:
Öze ile incelenecek bakteri kolonisi KIA besiyerinin ortasından dibe 1 cm kalana kadar
batırılır. Daha sonra besiyerinin yatık kısımına zigzag çizerek ekim yapılır. 35°C de 24-48
saat inkübe edilir.
Testin değerlendirmesi:
Reaksiyon besiyerinin iki ayrı bölgesinde meydana gelir. Yüzeyde oluşan reaksiyon aerobik,
dip kısımda oluşan reaksiyon ise anaerobiktir.

Yüzey asit – dip asit → Bakteri hem laktozu hem de glukozu fermente etmektedir.

Yüzey alkali - dip asit → Bakteri glukozu fermente etmekte, laktozu etmemektedir.

Yüzey alkali - dip alkali → Bakteri nonfermenterdir.
23
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE

Besiyerinde hava kabarcıkları veya çatlakların varlığı bakterilerin gaz oluşturduğunu
gösterir.

Siyah rengin oluşması ise H2S oluşumunu gösterir.
Kalite kontrol:
Her yeni besiyeri hazırlandığında kalite kontrol çalışması yapılır. Kalite kontrolunde
kullanılacak bakteriler aşağıdaki tabloda sunulmaktadır.
Tablo 7: KIA ve TSI agar besiyerlerinin kalite kontrolünde kullanılan suşlar
Sonuç
Bakteri
Dip
Yüzey
Gaz
H2S
E.coli
ATCC 25922
Asit
Asit
+
-
Salmonella Typhimurium
ATCC 14028
Asit
Alkali
+
+
Shigella flexneri
ATCC 12022
Asit
Alkali
-
-
Pseudomonas aeroginosa
ATCC 27853
Alkali
Alkali
-
-
Sınırlandırma:

Test 18-24 saat içinde okunup değerlendirilmelidir.

Erken okumalar yanlış asit- asit, geç okumalar ise yanlış alkali-alkali sonuç olarak
değerlendirilebilir.

Fazla H2S üretimi glukoz reaksiyonunu maskeleyebilir. Eğer bu durum gözlenirse
glukoz fermentasyonu vardır. Eğer gözlenmiyorsa gaz üretimi kontrol edilmelidir.

TSI ve KIA Enterobacteriaceae, non-enterik Gram negatif basiller ve çeşitli aerobik
Gram pozitif basillerin identifikasyonunda kulanılmaktadır.
7.3. Amino asit dekarboksilaz-dihidrolaz testleri için besiyeri
Bir aminoasidin dekarboksilasyonu karboksil grubunun amin ve CO2 oluşturmak üzere
enzimatik parçalanmasıdır. Bazı bakteriler aminoasidin dekarboksilasyonuna neden olan
enzimlere (dekarboksilaz) sahiptirler. Dekarboksilaz enzimleri bir indikatör varlığında renk
değişikliği ile basitçe görülebilirler.
Dekarboksilaz aktivitesini saptamak için biz laboratuvarımızda Moeller dekarboksilaz medium
kullanılmaktadır. Test edilecek aminoasit bakteri inokülasyonundan önce mediuma eklenir.
Tüpler anaerobik olarak inkübe edilir. İnkübasyonun başlangıcında bütün tüpler sarı olabilirse
de bunun nedeni ortamdaki çok az glukozun fermentasyonudur. Eğer lizin dekarboksilasyonu
oluyorsa alkali aminler oluşmakta ve besiyerindeki indikatör madde olan brom krezol moruna
bağlı olarak mor renkte bir görünüm oluşmaktadır.
24
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Moeller dekarboksilaz medium (pH: 6.8)
Bacto pepton
5g
Bacto yeast extract
3g
Bacto dekstroz
1g
Bacto brom cresol purple
0.02 g
Distile su
1000 mL
Yukarıdaki maddeler tartılıp 121C’de 15 dakika sterilize edildikten sonra test edilecek
aminoasitten 10 g filtre edilerek eklenmekte ve sonuçta %1’lik konsantrasyonda olmaktadır.
7.4. Oksidaz reajeni
N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydocholide
0.05 g
Distile su
5.0 mL
Oksidaz reajeni distile su içinde kaynatılmadan çözünür. Reajen günlük
hazırlanmalıdır. Testte pozitif ve negatif kontroller her zaman kullanılmalıdır.
olarak
7.5. String test için % 0.5’lik sodyum deoksikolat reajeni
Sodyum deoksikolat
0.5 g
Steril distile su
100.0 mL
Steril distile su içine sodyum deoksikolat eklenerek iyice karışması sağlanır. Karışım oda
ısısında 6 aydan fazla süre saklanabilir. Test öncesi pozitif (V.cholerae O1) ve negatif (E.coli)
kontroller mutlaka kullanılmalıdır.
7.6 Alkalen Taurocholate Tellurite Gelatin Agar Besiyeri (Monsur, pH: 8.5)
Trypticase
10.0 g
Sodyum klorür
10.0 g
Sodyum taurokolat
5.0 g
Sodyum karbonat
1.0 g
Gelatin
30.0 g
Agar
15.0 g
Distile su
1000 mL
25
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Öncelikle sodyum klorür ve agar eritilir. Daha sonra gelatin ve diğerleri eritilip pH 8.5’e
ayarlanır. 121C’de 15 dakika sterilize edilir. Su banyosunda 50-55C’ye soğutulduktan sonra
potasyum tellüritin son konsantrasyonundan (1/200.000-1/100.000) ilave edilir. Plaklara 20
mL olacak şekilde dağıtılır. Hazırlanan plaklar beş gün içinde kullanılmalıdır.
Bu besiyerinde 24 saatin sonunda özellikle proteus’lar V.cholerae’yı taklit ederek
üreyebilirler. Bu arada candida’lar, bazı aerop basiller, mucor’lar ve Klebsiella’larda üreyerek
yanılmalara neden olabilirler. Bunun için kolonilerin dikkatlice incelenmesi ve tamamlayıcı
testlerin uygulanması gerekmektedir.
7.7 Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS) (LAB 96, pH: 8.6)
Yeast extract
5.5 g
Pepton
10.0 g
Sodyum tiosülfat
10.0 g
Sodyum sitrat
10.0 g
Safra tuzları
9.0 g
Sukroz
17 g
Sodyum klorür
10.0 g
Ferrik sitrat
1.0 g
Bromtimol mavisi
0.04 g
Timol mavisi
0.04 g
Agar
15 g
Distile su
1000 mL
Kaynatılarak iyice çözünmesi sağlandıktan sonra su banyosunda 50-55 C’ye soğutulduktan
sonra plaklara dökülür. Petrilerin kapakları yaklaşık 20 dakika kadar aralık bırakılarak agar
yüzeyinin kuruması sağlanır. 4C’de 1 hafta kadar saklanabilir. Kullanım öncesi kalite
kontrolünün yapılması gerekmektedir. V.cholerae kolonileri parlak sarı renkte, E.coli kolonileri
ise üremez ya da translusent koloniler şeklinde görülmelidir.
26
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
7.8 Alkış besiyeri
Tryptone
10.0 g
Safra tuzları
5.0 g
Yeast ekstrakt
3.0 g
Sodyum klorür
10.0 g
Sodyum karbonat
1.5 g
Agar
17 g
Fenol red
0.025 g
Distile su
1000 mL
Yukarıda verilen maddeler su banyosunda eriyinceye kadar tutulur. PH 9’a ayarlanır.
121C’de 15 dakika sterilize edilir. Su banyosunda 70-80 C’ye soğutulduktan sonra aseptik
şartlar altında %1’lik potasyum tellüritten 2.5 mL, %30’luk sakkarozdan 150 mL ilave edilerek
plaklara dökülür. Bu besiyerinde gerek potasyum tellürit ve gerekse sakkarozun
redüksiyonundan yararlanılmıştır. Böylece tek besiyeri ile izolasyon şansı en yüksek
seviyede tutulmaya çalışılmıştır.
27
THSK U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
8. KOLERA İÇİN STANDART VAKA TANIMI
Klinik Tanımlama:
 Bir kişide şiddetli dehidratasyon bulguları ile seyreden ve/veya başka nedenlerle
açıklanamayan akut sulu ishalin görülmesi veya

Kişinin bu semptomlarla seyreden hastalıktan ölmesi.
Tanı için laboratuvar kriterleri:

Klinik örneklerden Vibrio cholerae O1 veya O139’un izole edilmesi
Vaka sınıflaması:
Olası Vaka: Klinik tanımlama ile uyumlu vaka.
Kesin Vaka:
(a) Tanı için laboratuvar kriterleri ile doğrulanmış olası vaka
(b) (Salgın esnasında) bir kesin vaka ile epidemiyolojik bağlantılı olası vaka.
[NOT: Kültürden V.cholerae izole eden, ancak O1 ve O139 tiplendirmesi yapamayan
laboratuvarlar izolatlarını bir üst laboratuvara veya Referans Laboratuvara göndermek
zorundadır! Ayrıca toksin üretiminin gösterilmesi için tüm izolatlar Referans Laboratuvarına
sevk edilmelidir! Standart Laboratuvar Prosedürlerine göre antibiyotik direnci araştırılmalıdır.]
28
RSHMB U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
9. KAYNAKLAR
1. WHO/CDS/CSR/EDC/99.8 Laboratory Methods for the Diagnosis of Epidemic
Dysentery and Cholera. Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia
1999.
2. Wells J. Salmonella serotype Typhi, Shigella, and Vibrio cholerae. Manual for the
Laboratory Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacterial
Pathogens of Public Health Importance in the Developing.World. CDC National
Center for Infectious Diseases and World Health Organization Department of
Communicable Disease Surveillance and Response, 2003: 102-162.
3. Health Protection Agency. Susceptibility testing. National Standard Method BSOP 45
Issue 2. 2006. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_bacteriology.asp.
4. Health Protection Agency (2007). Identification of Vibrio species. National Standard
Method BSOP ID 19 Issue 2. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_sops.asp.
5. Akgün Y. Vibrio cholerae ve diğer Vibrio türleri in: Topçu AW, Söyletir G, Doğanay M
(eds) İnfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi Nobel Tıp Kitabevleri 2002: s 16241635.
6. CLSI (2007) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;
Sixteenth Informational Supplement. CLSI document M100-S17 [ISBN 1-56238-6255]. CLSI 940 West Valley Road, Suite 1400,Wayne, PA 19087-1898 USA.
7. Abbott SL, Janda JM, Johnson JA, Farmer III JJ. Vibrio and Related Organisms. In:
Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA. (eds). Manual of Clinical
Microbiology 9th Edition Washington DC American Society of Microbiology 2007; 723733.
29
RSHMB U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
30
RSHMB U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
10. ŞEKİLLER
Şekil 3: Kolerada pirinç suyu şeklinde
gaita görünümü
Şekil 5: V. cholerae kolonilerinin kanlı
agardaki görünümleri
Şekil 4: Cary-Blair taşıma besiyeri
Şekil 6: V. cholerae kolonilerinin TCBS
agardaki görünümleri
31
RSHMB U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
Şekil 7: V. cholerae’nın KIA ve TSI
agardaki görünümleri
Şekil 10: Modifiye CAMP testi
Şekil 8: Pozitif oksidaz reaksiyonu
Şekil 11: String test
Şekil 9: V. cholerae’nın antiserumlarla
aglütinasyonu
Şekil 12: Antibiyogram plağı
32
RSHMB U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE
33
RSHMB U l u s a l E n t e r i k P a t o j e n l e r R e f e r a n s L a b o r a t u v a r ı
STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ-VIBRIO CHOLERAE