21 Number: 1 2010 2010_1

Transkript

I
ISSN 1016-3573
ETLİK MERKEZ VETERİNER KONTROL ve
ARAŞTIRMA ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ
ANKARA
Test
AB-0048-T
ETLİK VETERİNER
MİKROBİYOLOJİ
DERGİSİ
JOURNAL OF ETLIK VETERINARY MICROBIOLOGY
ANKARA – TURKEY
Cilt/Volume 21 ♦ Sayı/Number 1 ♦ 2010
II
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi
Cilt/Volume 21 ♦ Sayı/Number 1 ♦ 2010
Journal of Etlik Veterinary Microbiology
Yılda iki kez yayımlanır / Published two times per year
ISSN 1016-3573
Sahibi
Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Adına
Dr. Nahit Yazıcıoğlu
Enstitü Müdürü
Editörler Kurulu / Editorial Board
Baş Editör / Editor-in Chief
Dr. Nahit Yazıcıoğlu
Editör Yardımcıları / Co-Editors *
Dr. Erhan Akçay
Dr. Rauf Akkaya
Uzm. Yıldız Ayaz
Dr. Asiye Dakman
Dr. Arife Ertürk
Dr. Uğur Küçükayan
Dr. H. Kaan Müştak
Dr. Yavuz Ulusoy
Uzm. M. Kadri Yavuz
Adres / Address
Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü
06020 Etlik – Ankara / TÜRKİYE
Tel : 90 (312) 326 00 90 (10 hat)
Faks : 90 (312) 321 17 55
URL : http://www.etlikvet.gov.tr/yayinlar.htm
E-posta : [email protected] / [email protected]
III
Danışma Kurulu / Advisory Board *
Prof. Dr. Haluk Çelik Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Yrd. Doç. Dr. Alper Çiftçi Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Kamil Ekici Yüzüncüyıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Prof. Dr. İrfan Erol Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Yrd. Doç. Dr. Arzu Fındık Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Ergün Göksoy Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Doç. Dr. Semra Gümüşova Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Fatih Hatipoğlu Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Ziya İlhan Yüzüncüyıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Müjgan İzgür Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Mehmet Taner Karaoğlu Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Aylin Kasımoğlu Doğru Kırıkkale Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Prof. Dr. Haydar Özdemir Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Prof. Dr. Aykut Özkul Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Yavuz Selim Sağlam Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Tansel Şireli Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Doç. Dr. Zafer Yazıcı Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı
* İsimler soyada göre alfabetik dizilmiştir ve bu sayıda görev alanlar yazılmıştır.
ULAKBİM Yaşam Bilimleri Veritabanı kapsamında bulunan “çift hakemli” bir dergidir.
Copyright © Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi 2010, Her hakkı saklıdır / All rights reserved
Basım Tarihi / Publishing Date: Haziran / June 2010, Baskı adedi / Circulation: 500
Tasarım ve Baskı / Printing
M
MEDİSAN
Medisan Yayinevi Ltd.Şti.
Çankırı Cad. 45 / 347 Ulus - Ankara, Türkiye
Tel : +90 312 311 24 26 – 311 00 57
IV
İçindekiler / Contents
Araştırma Makaleleri / Research Articles Sayfa /Page
Prevalence and seasonal distribution of Salmonella spp. in frozen raw meats
Dondurulmuş çiğ etlerde Salmonella spp. prevalansı ve mevsimsel dağılımı
Naim Deniz Ayaz, Erdem Örmeci, Barış Öz ...................................................................................................................................... 1
Konya’da tüketime sunulan beyaz salamura, tulum ve kaşar peynirlerinin ağır metal içeriklerinin araştırılması
Investigation of heavy metal contents in white pickled, tulum and kashar cheeses consumed in Konya
Öznur Yalçın, K. Kaan Tekinşen . ....................................................................................................................................................... 5
Malathion’un ratların ince bağırsak dokusu üzerine etkisi ve vitamin C ve vitamin E’nin koruyucu rolü
Effects of malathion in small intestine tissue of rats and protective role of vitamin C and vitamin E
Fatma Gökçe Uzun, Yavuz Ulusoy, Filiz Demir, Suna Kalender ......................................................................................................11
Kuduz teşhisi için ulusal laboratuvarlar arası ring test (floresan antikor tekniği) - 2009
National inter laboratory ring test (direct fluorescent antibody test) for rabies diagnosis - 2009
Hikmet Ün, Selim Tuncer, Nil Ünal, Orhan Aylan ........................................................................................................................... 17
Vero hücrelerinde ısıya dayanıklı sığır vebası aşı üretimi
Production of a thermostable vero-cell adapted rinderpest vaccine
Özden Kabaklı, Elvin Çalışkan, A. Burak Güngör, Süreyya Yöndem, İlkay Demirhan .................................................................. 23
Ege Bölgesi kültür balıklarında Gram pozitif bakteri infeksiyonlarının incelenmesi
Investigation of Gram positive bacterial infections in culture fisheries in the Aegean Region
Saadet Gürpınar, Serap Savaşan ....................................................................................................................................................... 31
Derleme / Review
Bir gıda patojeni: Cronobacter sakazakii
A food pathogen: Cronobacter sakazakii
Aylin Kasımoğlu Doğru .................................................................................................................................................................... 37
Etlik Vet Mikrobiyol Derg,
1 - Örmeci
4, 2010E, Öz B. Etlik Vet Mikrobiyol Derg,Araştırma
Makalesi / Research Article
1
Ayaz21,
ND,
21, 1 - 4, 2010
Prevalence and seasonal distribution of Salmonella spp. in frozen raw meats
Naim Deniz AYAZ1, Erdem ÖRMECİ2, Barış ÖZ2
Department of Food Hygiene and Technology, School of Veterinary Medicine, Kırıkkale University, Kırıkkale;
2
B Type Food Control Detachment Command, Ağrı, Turkey
1
Geliş Tarihi / Received: 03.03.2010, Kabul Tarihi / Accepted: 16.06.2010
Abstract: The objectives of this study were to find out the prevalence and seasonal distribution of Salmonella spp. in
frozen raw meats in Ağrı. Salmonella spp. were detected from 37 (17.3%) of the 214 frozen raw meat samples. Out of
70 chicken, 74 turkey, and 70 beef samples, 19 (27.1%), 17 (23.0%), and 1 (1.4%) were contaminated with Salmonella
spp., respectively. Chicken meat samples were the most prevalent among all other analyzed meat species for Salmonella
spp. In general 10.7% (6/56), 28.1% (16/57), 12.0% (6/50), and 17.6% (9/51) of the meat samples were found to be
contaminated with Salmonella spp. during the spring, summer, autumn, and winter, respectively. These results showed
that the prevalence of Salmonella spp. were higher in raw poultry meat and beef in the summer than other seasons. In
the study, high contamination levels in chicken and turkey meats with Salmonella spp. were detected. The presence
of Salmonella spp. in raw poultry meat is an important risk for food hygiene. Poultry meat should be prepared under
hygienic conditions in the kitchen to avoid cross contaminations to ready to eat foods and should be cooked well before
consumption.
Key words: Beef, chicken meat, Salmonella, seasonal distribution, turkey meat.
Dondurulmuş çiğ etlerde Salmonella spp. prevalansı ve mevsimsel dağılımı
Özet: Bu çalışmada, Ağrı ilinde tüketime sunulan dondurulmuş çiğ etlerdeki Salmonella prevalansının ve mevsimsel
dağılımının belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada analiz edilen 214 dondurulmuş çiğ etin 37’sinden (%17.3) Salmonella tespit edilmiştir. Buna göre, 70 tavuk, 74 hindi ve 70 sığır eti örneğinin sırasıyla 19 (%27.1), 17 (%23.0), ve 1’inin
(%1.4) Salmonella ile kontamine olduğu belirlenmiştir. Analiz edilen et türlerinden Salmonella prevalansının en yüksek
olduğu tür tavuk eti olarak belirlenmiştir. Çalışmada genel olarak, et türlerinin ilkbahar, yaz, sonbahar ve kış mevsimlerinde sırasıyla %10.7 (6/56), %28.1 (16/57), %12.0 (6/50) ve %17.6 (9/51) düzeyinde Salmonella ile kontamine
olduğu tespit edilmiştir. Çalışma neticesinde, çiğ kanatlı ve sığır etlerinin Salmonella’lar ile yaz aylarında diğer aylara
göre daha sıklıkla kontamine olduğu gözlenmiştir. Çalışmada, tavuk ve hindi etlerinin Salmonella ile yüksek oranda
kontamine olduğu ve çiğ kanatlı etlerinde Salmonella varlığının gıda hijyeni açısından önemli bir risk teşkil ettiği ortaya
konmuştur. Buna göre, çiğ kanatlı etleri, mutfakta işlenmeleri esnasında gerekli hijyenik koşullar sağlanarak, tüketime
hazır gıdaların kontaminasyonları önlenmeli ve iyi pişirildikten sonra tüketilmelidir.
Anahtar sözcükler: Salmonella, mevsimsel dağılım, tavuk eti, hindi eti, sığır eti.
Introduction
Meat can be contaminated with pathogenic microorganisms through farm-to-table stages if hygienic
precautions are not taken (9). Gastrointestinal flora
is a possible source of foodborne pathogens and
during slaughtering and processing, raw meats are
often contaminated with feces of animals (12).
Mead et al. (15) reported that, pathogens cause
76 million cases of foodborne illnesses, 325.000
hospitalizations, and 5.000 deaths in the USA annually. Among these, 31% of food-related deaths
have been caused by Salmonella spp. (15). In Italy
between 1991 and 1994, approximately 81% of the
1699 food-borne outbreaks were caused by Salmo-
nella spp. (19). Contaminated raw or undercooked
poultry and red meats are particularly important
in transmission of foodborne pathogens (20). In a
study, prevalence of Salmonella ranged from 23.3 to
47.7% in three poultry processing plants in Ankara
(18). It was reported that, due to the cross contaminations in slaughtering Salmonella prevalence in
poultry meat can reach to 50-100% (8).
Salmonella, an important foodborne pathogen
of human salmonellosis, has been generally associated with foods of animal origin. Beef and poultry
meat plays a significant role in transmission of Salmonella spp. to humans throughout the food-chain
(4, 10, 16, 17) causing several clinical conditions
Yazışma adresi / Correspondance: Naim Deniz Ayaz, Kırıkkale Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi
Anabilim Dalı, 71450, Yahşihan, Kırıkkale, Türkiye E-posta: [email protected]
2
Ayaz ND, Örmeci E, Öz B. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 1 - 4, 2010
such as, enteric fever, enterocolitis, and systemic
infections (5).
The aims of this study were to find out the prevalence and seasonal distribution of Salmonella spp.
in frozen raw turkey meat, chicken meat, and beef
in Ağrı.
Material and Method
Sample collection: A total of 214 frozen raw meat
samples including 74 turkey meat, 70 chicken meat
and 70 beef cuts (approximately 2x3 cm cubic
parts), produced by national producers, were collected in Ağrı between June 2008 and May 2009.
Frozen raw meat samples were transported to the
laboratory in an ice bag and analyzed in the same
day for the detection of Salmonella spp.
Isolation of Salmonella spp.: ISO 6579 conventional cultivation method was used to determine the
presence of Salmonella spp. in meat samples (1).
Twenty-five grams of meat samples were weighted
into sterile bags and enriched with 225 ml Buffered
Peptone Water (BPW, Oxoid CM1049, Hampshire,
UK) and incubated at 37°C for 24 hours. Afterwards,
aliquots of 0.1 ml were transferred to 10 ml of Rappaport-Vasilliadis Broth (RVB, Oxoid CM669), and
incubated at 42°C for 24 hours. Following the incubation, broths were streak onto both Brilliant-green
Phenol-red Lactose Sucrose Agar (BPLS, Merck
1.07237, Hohenbrunn, Germany) and Xylose Lysine
Desoxycholate Agar (XLD, Oxoid CM0469). The
plates were then incubated at 37°C for 24-48 hours.
Up to five of the typical colonies grown were picked
from each medium and inoculated into Triple Sugar Iron Agar (TSIA, Oxoid CM0277), Lysine Iron
Agar (LIA, Oxoid CM0381) and Urea Broth Base
(Merck 1.08483) supplemented with 40% of urea
solution (Oxoid SR0020). The mediums were incubated at 37°C for 24-48 hours. TSIA positive, LIA
positive and urease negative colonies were considered as suspected Salmonella spp.
The agglutination test was done with Salmonella latex test (Oxoid FT0201A). Suspected Salmonella colonies were separately mixed with a drop
of antiserum on a slide and incubated up to two
minutes at room temperature. Agglutination with
antiserum was accepted as a positive reaction for
Salmonella spp.
Findings
In the study, a total of 214 frozen raw meat samples,
including 74 turkey meats, 70 chicken meats and 70
beef were tested for the presence of Salmonella spp.
As far as Salmonella spp. prevalence was concerned,
37 (17.3%) of the 214 meat samples were detected
as positive. Out of 70 chicken meat, 74 turkey meat,
and 70 beef samples; 19 (27.1%), 17 (23.0%), and
1 (1.4%) were found to be contaminated with Salmonella spp., respectively. Chicken meat samples
showed the highest prevalence for Salmonella spp.
among all the other analyzed meat species.
It was found that during the spring, 21.1% of the
chicken (4/19), and 13.3% (2/15) of the turkey meat
samples; during the summer, 50.0% (8/16) of the
chicken, 29.2% (7/24) of the turkey, and 5.9% (1/17)
of the beef samples were contaminated with Salmonella spp. It was revealed that, 21.1% (4/19), and
11.8% (2/17) of turkey, and chicken meat samples
of the autumn were contaminated with Salmonella
spp., respectively, while in the winter, 5 (27.8%) of
the 18 chicken, and 4 (25.0%) of the 16 turkey meat
samples were positive for Salmonella spp. In general, 10.7% (6/56), 28.1% (16/57), 12.0% (6/50),
and 17.6% (9/51) of the meat samples were found
to be contaminated with Salmonella spp. during the
spring, summer, autumn, and winter, respectively
(Table 1). These results showed that the prevalence
of Salmonella spp. was higher in frozen raw poultry
meats and beef in the summer.
3
Table 1. Prevalence and seasonal distribution of Salmonella spp. in frozen raw meats in Ağrı.
Number of Samples
Date
Chicken meat
Season
Turkey meat
Beef
Analyzed
Salmonella
positive
Analyzed
Salmonella
positive
Analyzed
Salmonella
positive
5
2
9
3
6
1
July 2008
5
3
8
2
4
-
August 2008
6
3
7
2
7
-
5
-
7
1
5
-
October 2008
6
1
8
2
5
-
November 2008
6
1
4
1
4
-
7
2
5
1
6
-
January 2009
6
2
5
1
5
-
February 2009
5
1
6
2
6
-
7
2
4
-
9
-
April 2009
5
1
5
1
7
-
May 2009
7
1
6
1
6
-
TOTAL
70
19
74
17
70
1
June 2008
September 2008
December 2008
March 2009
Summer
Autumn
Winter
Spring
Discussion and Conclusion
In the present study, 27.1% (19/70) of the chicken
meat, 23.0% (17/74) of the turkey meat, and 1.4%
(1/70) of the beef samples were found to be contaminated with Salmonella spp. In previous studies, the
prevalence of Salmonella in poultry meat and beef
shows differences in various countries. The prevalence of Salmonella in poultry meat was reported
between the ranges of 2.6–36.0% (21, 22). Zhao et
al. (22) reported the prevalence of Salmonella in
chicken, and turkey in USA as 4.2%, and 2.6%, respectively, which was lower than the present study.
In a study performed in UK, 5.6% of the chicken
meats and 5.6% of the turkey meats were contaminated with Salmonella spp. (13). During 1997 and
1998, 19.6% of the turkey carcasses were found to
be contaminated with Salmonella (6). These data
showed that, prevalence of Salmonella in developed
countries is significantly lower than the present
study. Similar to the present study, in Canada 30%
of the chicken legs were contaminated with Salmonella (2). In England, Salmonella spp. were identified in 25% (60/241) of whole raw chicken samples
(11). This result is in accordance with our study for
Salmonella prevalence (27.1%) in chicken meat.
In a study performed in Ankara, Salmonella
spp. were isolated from 3.3% (4/100) of the ground
beef samples (7). Eblen et al. (6) found that, 1.2% of
the cattle carcasses were contaminated with Salmonella in the USA. In another study, the prevalence
of Salmonella spp. were assessed as 2.4% in raw red
meats and 1.3% in beef samples (14). Similar result
with the present study, for the presence of Salmonella spp. in beef (1.9%) was reported in the USA
(22).
The results of the present study showed that,
the prevalence of Salmonella spp. were higher in the
summer as expected, since similar to these findings,
the Centers for Disease Control Foodborne Diseases
Active Surveillance Network (FoodNet) data indicated that the outbreaks and clusters of food-borne
infections peak during the warmest months of the
year in the USA (3).
In the study, high contamination levels of chicken and turkey meats with Salmonella spp. were detected. The presence of Salmonella in raw poultry
meat is an important risk for food hygiene. Poultry
meat should be prepared under hygienic conditions
in the kitchen to avoid cross contaminations to ready
to eat foods and should be cooked adequately before
consumption.
4
References
1. Anonymous, (2002). International Organization for Standardization (ISO). Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection of Salmonella spp. ISO 6579.
2. Bohaychuk VM, Gensler GE, King RK, Manninen KI,
Sorensen O, Wu JT, Stiles ME, McMullen LM, (2006).
Occurrence of pathogens in raw and ready-to-eat meat and
poultry products collected from the retail marketplace in
Edmonton, Alberta, Canada. J Food Prot. 69, 2176-2182.
3. CDC (Centers for Disease Control and Prevention),
(2001). Preliminary FoodNet data on the incidence of foodborne illnesses–selected sites, United States, 2000. Morb
Mort Weekly Rep. 50, 241–246.
4. Chittick P, Sulka A, Tauxe RV, Fry AM, (2006). A summary of national reports of foodborne outbreaks of Salmonella
Heidelberg infections in the United States: clues for disease
prevention. J Food Prot. 69, 1150–1153.
5. D’Aoust JY, Maurer J, (2007). Salmonella species. Doyle
MP, Beuchat LR. eds. Food Microbiology: Fundamentals
and Frontiers, 3rd edition. Washington, D.C.: ASM Press.
p. 187-236.
6. Eblen DR, Levine P, Rose BE, Saini P, Mageau R, Hill
WE, (2005). Nationwide microbiological baseline data collected by sponge sampling during 1997 and 1998 for cattle,
swine, turkeys, and geese. J Food Prot. 68, 1848-1852.
7. Erol İ, (1999). Incidence and serotype distribution of Salmonella in ground beef in Ankara. Turk J Vet Anim Sci.
23, 321-325.
8. Erol İ, (2007). Gıda Hijyeni ve Mikrobiyolojisi. Ankara: Pozitif Matbaacılık Ltd. Şti., p 60-70.
9. İşeri Ö, Erol İ, (2009). Hindi etlerinden kaynaklanan başlıca bakteriyel infeksiyon ve intoksikasyonlar. Ankara Üniv
Vet Fak Derg. 56, 47-54.
10. Jay JM, Loessner MJ, Golden DA, (2005). Modern Food
Microbiology. 7th edition. New York: Springer Science and
Business Media.
11. Jorgensen F, Bailey R, Willins S, Henderson P, Warcing
DR, Bolton EJ, Frost JA, Ward L, Humphrey TJ, (2002).
Prevalence and numbers of Salmonella and Campylobacter
spp. on cow, whole chicken in relation to sampling methods.
Int J Food Microbiol. 76, 151-164.
12. Kegode RB, Doetkott DK, Khaitsa ML, Wesley IV,
(2008). Occurrence of Campylobacter species, Salmonella
species and generic Escherichia coli in meat products from
retail outlets in the fargo metropolitan area. J Food Safety.
28, 111-125.
13. Little CL, Richardson JF, Owen RJ, De Pinna E, Threlfall EJ, (2008a). Prevalence, characterization and antimicrobial resistance of Campylobacter and Salmonella in raw
poultry meat in the UK, 2003-2005. Int J Environ Health
Res. 18, 403-414.
14. Little CL, Richardson JF, Owen RJ, De Pinna E, Threlfall EJ, (2008b). Campylobacter and Salmonella in raw red
meats in the United Kingdom: prevalence, characterization
and antimicrobial resistance pattern, 2003-2005. Food Microbiol. 25, 538-543.
15. Mead PS, Slutsker L, Dietz V, McCaig LF, Bresee JS,
Shapiro C, Griffin PM, Tauxe RV, (1999). Food-related
illness and death in the United States. Emerg Infect Dis. 5,
607-625.
16. Oliveira SD, Rodenbusch CR, Ce´ MC, Rocha SLS, Canal CW, (2003). Evaluation of selective and non-selective
enrichment PCR procedures for Salmonella detection. Lett
Appl Microbiol. 36, 217–221.
17. Orji MU, Onuigbo HC, Mbata TI, (2005). Isolation of
Salmonella from poultry droppings and other environmental sources in Awka, Nigeria. Int J Infect Dis. 9, 86–89.
18. Sarımehmetoğlu B, Küplülü Ö, Erol İ, Özdemir H,
(1996). Tavuk kesimhanelerinde Salmonella kontami-nasyonu ve serotip dağılımı. Ankara Üniv Vet Fak Derg. 43,
85-90.
19. Scuderi G, Fantasia M, Filetici E, Anastasio MP, (1996).
Foodborne outbreaks caused by Salmonella in Italy, 1991–
1994. Epidemiol Infect. 116, 257–265.
20. Tauxe RV, (2002). Emerging foodborne pathogens. Int J
Food Microbiol. 78, 31-41.
21. Uyttendaele M, De Troy P, Debevere J, (1999). Incidence
of Salmonella, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli,
and Listeria monocytogenes in poultry carcasses and different types of poultry products for sale on the Belgian retail market. J Food Prot. 62, 735–740.
22. Zhao C, Ge B, Villena JD, Sudler R, Yeh E, Zhao S,
White DG, Wagner D, Meng J, (2001). Prevalence of
Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from Greater
Washington, D.C., Area. Appl Environ Microbiol. 67, 54315436.
21, 5Ö,- 10,
2010 KK. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21,
Araştırma
5
Yalçın
Tekinşen
5 - 10, 2010
Konya’da tüketime sunulan beyaz salamura, tulum ve kaşar peynirlerinin
ağır metal içeriklerinin araştırılması*
Öznur YALÇIN1, K. Kaan TEKİNŞEN2
Selçuk Üniversitesi Teknik Eğitim Fakültesi; 2Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi
Anabilim Dalı, Konya, Türkiye
1
Özet: Araştırma, Konya’da tüketime sunulan beyaz salamura, tulum ve kaşar peynirinde alüminyum, kadmiyum, kurşun, bakır, demir, nikel, krom ve çinko varlığını araştırmak amacıyla yapıldı. Bu amaçla perakende satış yerlerinden,
her bir çeşitten 30’ar adet olmak üzere, toplam 90 adet peynir numunesi toplandı. Peynir numunelerinin ağır metallerle
kontaminasyonunun varlığı ve kontaminasyon düzeyi ICP-AES atomik emisyon spektrofotometresi kullanılarak mg/
kg olarak belirlendi. Araştırmada, beyaz salamura peynirlerde ortalama alüminyum, bakır, demir, nikel, kadmiyum,
kurşun, çinko ve krom miktarları sırasıyla; 3.12 mg/kg, 1.44 mg/kg, 17.47 mg/kg, 0.49 mg/kg, 0.12 mg/kg, 0.13 mg/
kg, 15.35 mg/kg, 0.49 mg/kg; tulum peynirlerinde 0.59 mg/kg, 1.06 mg/kg, 14.18 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.10 mg/kg, 0.08
mg/kg, 15.96 mg/kg, 0.70 mg/kg; kaşar peynirlerinde ise, 0.64 mg/kg, 1.35 mg/kg, 15.42 mg/kg, 0.43 mg/kg, 0.11 mg/
kg, 0.12 mg/kg, 27.15 mg/kg, 0.50 mg/kg düzeylerinde tespit edildi. Sonuç olarak, numunelerin üretim tekniğindeki,
dolayısıyla çeşidindeki farklılıklara bağlı olarak alüminyum, bakır, demir, kadmiyum ve çinko içerikleri arasında anlamlı farklılıklar (P<0.001) olduğu ve ağır metal miktarlarının Türk Gıda Kodeksi’nin bazı gıdalarda belirlediği sınırlar
içinde bulunduğu saptandı.
Anahtar sözcükler: Ağır metal, beyaz salamura, tulum, kaşar, peynir.
Investigation of heavy metal contents in white pickled, tulum and kashar cheeses consumed
in Konya
Summary: This study was carried out to determine, aluminium, cadmium, lead, copper, iron, nickel, chromium and zinc
contamination level of white pickled, tulum and kashar cheeses consumed in Konya. For this purpose, thirty samples
from each kind, total of 90 samples were obtained randomly from retail outlets. Heavy metal presence and contamination level was detected with ICP-AES atomic emission spectrophotometer as mg/kg level. In this research, average
contamination level of aluminium, copper, iron, nickel, cadmium, lead, zinc and chromium were detected 3.12 mg/
kg, 1.44 mg/kg, 17.47 mg/kg, 0.49 mg/kg, 0.12 mg/kg, 0.13 mg/kg, 15.35 mg/kg, 0.49 mg/kg, respectively in white
pickled cheese, 0.59 mg/kg, 1.06 mg/kg, 14.18 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.10 mg/kg, 0.08 mg/kg, 15.96 mg/kg, 0.70 mg/kg
respectively in tulum cheese, 0.64 mg/kg, 1.35 mg/kg, 15.42 mg/kg, 0.43 mg/kg, 0.11 mg/kg, 0.12 mg/kg, 27.15 mg/kg,
0.50 mg/kg respectively in kashar cheese. In conclusion the results indicate that aluminium, copper, iron, cadmium and
zinc levels showed significant statistical differences (P<0.001) among the cheese samples in terms of different production technique so different kind and all of the samples for heavy metal levels were detected within Turkish Food Codex
limits.
Key words: Heavy metal, white pickled, tulum, kashar, cheese.
Giriş
Gıda maddelerinin yapısında doğal olarak bulunmayan yabancı maddeler arasında yer alan ve çeşitli
yollarla gıdalara bulaşan maddelerin bir grubunu
oluşturan metal kalıntıları, gıda maddelerinin imalatı ve depolanması sırasında temas ettiği makine
ekipman veya paketleme materyallerinden bulaşabileceği gibi, bu maddelerle kirlenmiş olan doğadan
hammaddeye bulaşması ile de ürüne taşınabilmek-
tedir. Çevrede, bazıları yağda çözünerek bitki ve
hayvanlarda da birikebilirler (2).
Başta kurşun olmak üzere, ağır metaller merkezi sinir sisteminde düzensizliklere neden olabilirler.
Bu düzensizlikler uyku bozuklukları, baş dönmesi, iştahsızlık ve hafıza yetersizliği gibi belirtilerle
ortaya çıkmaktadır. Ağır metaller, kalp ve damar
hastalıklarının ortaya çıkmasında, kan oluşum sistemlerinin bozulmasında rol oynayabildikleri gibi,
zehirlenme, kanser, anemi, erken ölüm, böbrek has-
Yazışma adresi / Correspondance: K. Kaan Tekinşen, Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim
Dalı, 42075 Kampüs, Konya, Türkiye E-posta: [email protected]
* Aynı isimli yüksek lisans tezinden özetlenmiştir.
6
Yalçın Ö, Tekinşen KK. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 5 - 10, 2010
talıkları gibi olaylara da neden olarak insan sağlığını
etkileyebilmektedirler (9). Kurşun ve kadmiyumun
önemli toksik metaller olduğu ve çocukların bu metallere karşı yetişkinlerden daha duyarlı olduğu yapılan araştırmalarla belirlenmiştir (28).
Ülkemiz gıda sanayini genel olarak ele aldığımızda; toplam 28000 adet dolayında gıda maddesi
üreten tesisin bulunduğu ve bu tesislerin yaklaşık
%18’inin süt ve ürünleri üreten tesisler olduğu bildirilmektedir (13). Ağır metal kontaminasyonlarının
kontrol altına alınabilmesi, çevre kirliliği nedeniyle
oluşan hammadde kirliliğinin önlenmesi ile süt ve
ürünlerinin üretimi sırasında uygulanan teknolojik
işlemlerin tekniğine göre yapılması; tüketime sunuluncaya kadar uygun koşullarda ve ambalajlarda
saklanmasıyla mümkün olabilir. Ayrıca sütün depolandığı kaplar ve kullanılan ekipmanların niteliği de
önemli bir metalik kontaminant kaynağı oluşturduğundan sözü edilen bu faktörlere dikkat edilmesi
gerekmektedir (34).
Çeşitli kaynaklardan bulaşan kontaminantlar,
çevreci kuruluşlar tarafından sağlık açısından risk
yaratan maddeler olarak kabul edilmektedir. Özellikle ağır metal iyonlarının gıdalara bulaşması ve
günlük tolere edilebilir miktarın üzerine çıktığında
sorun yaratması FAO/WHO’nun üzerine durduğu
konular arasındadır. Bu nedenle gerek üye ülkeler
gerekse dünya ticaretiyle ilgilenen diğer ülkeler
kendi ülkelerinde gıda ve yem maddelerinde kontaminant düzeylerinin belirlenmesi amacıyla tarama
çalışmaları yapmışlardır (9, 11).
Yapılan değişik araştırmalar gıdalar ile alınan
ağır metallerin insanlarda ciddi sağlık sorununa
neden olabileceğini göstermiştir. Bu nedenle bazı
ülkelerin gıda mevzuatlarında gıdalarda bulunabilecek ağır metallerin limit değerleri belirtilmektedir
(24). Türk Gıda Kodeksi’nin ilgili tebliğlerinde de
(29, 30), peynire ait maksimum limitler belirtilmemesine rağmen, birçok gıdada (örn., sığır, domuz,
kanatlı eti, balık eti, tahıllar, meyve suları, katı ve
sıvı yağlar, sebzeler, konserve gıdalar v.b.) bazı ağır
metallerin kabul edilebilir en yüksek değerleri belirtilmektedir. Türk Gıda Kodeksi’nin gıda maddelerinde belirli bulaşanların maksimum seviyelerinin
belirlenmesi hakkındaki tebliğde (29), bazı gıdalar
için kabul edilebilir en yüksek değerler alüminyum
için 2-15 mg/kg, kadmiyum için 0.01-1 mg/kg, kurşun için 0.02-2 mg/kg, bakır için 0.05-50 mg/kg, demir için 0.2-25 mg/kg, nikel için 0.1-0.2 mg/kg, çin-
ko için 2-50 mg/kg olarak belirtilmekte krom için
herhangi bir miktar bildirilmemektedir. Türk Gıda
Kodeksi’nin, 2008 yılında yayımladığı ilgili tebliğde (30) ise, bazı gıdalarda kurşun, kadmiyum, civa
ve kalay dışında diğer ağır metallerin (alüminyum,
bakır, demir, nikel, çinko, krom) maksimum limitleri belirtilmemekte, kadmiyum limitlerinin 0.05-1
mg/kg, kurşun limitlerinin 0.02-1.5 mg/kg düzeylerinde olması gerektiği bildirilmektedir.
Günümüzde ağır metal iyonlarının ciddi sağlık
problemlerine yol açtığı hatta bazı vakaların ölümlere kadar gittiği bilinmektedir. Bu yüzden ağır metal bulaşması konusuna gerekli önemin verilmesi,
muhtelif kaynaklarının ve gıdalardaki düzeylerinin
incelenerek etkin önlemlerin alınması gerekmektedir
(23). Bu bağlamda mevcut araştırmayla, Konya’da
tüketime sunulan ve tüketimde önemli paya sahip
olan beyaz salamura, tulum ve kaşar peynirlerinin
alüminyum, bakır, demir, nikel, kadmiyum, kurşun,
çinko ve krom düzeylerinin belirlenmesi ve Türk
Gıda Kodeksi’nde belirtilen limitlere uygunluğunun tespit edilmesi amaçlandı.
Materyal ve Metot
Numunelerin temini: Beyaz salamura (teneke ambalajlı taze), tulum (deri tulumda olgunlaştırılmış)
ve kaşar (vakum paketli taze) peyniri numuneleri,
Konya’daki çeşitli perakende satış yerlerinden (süpermarketler, bakkallar, işletme ve mandıraların
satış yerleri) 30’ar adet temin edildi. 250-400 g
miktarlarda alınan toplam 90 adet numune, analize
alınıncaya kadar buzdolabında 4ºC’de bekletildi.
Ağır metal tayini: Peynir numunelerinin alüminyum, bakır, kadmiyum, kurşun, demir, nikel, krom
ve çinko ağır metalleriyle kontaminasyonun varlığı
ve kontaminasyon düzeyi ICP-AES atomik emisyon spektrofotometresi kullanılarak mg/kg olarak
belirlendi. Analizi yapılacak örneklerdeki organik
bileşiklerin yok edilmesi ve inorganik bileşiklerin
çözünür faza geçirilmesi amacıyla yapılan çözümleme işlemlerinde Mars-5 mikrodalga kapalı sistem
yaş yakma yöntemi kullanıldı. Yakma öncesinde,
numunelerden 1 g kuru madde esasına göre peynir örnekleri teflon kaplar içersine alındı ve üzerine perklorik asit-nitrik asit karışımından (5+5) 10
ml ilave edildi. Teflon kapların ağızları kapatılarak,
örnekler Mars-5 (Cem Corporation) mikrodalga fırında (maksimum 1200 watt) maksimum 160ºC’de
yakıldı. Örnekler bidistile su ile yıkanarak kaplara
alındı ve 25 ml’ye tamamlandı. Bu işlemden sonra
S&S mavi bantlı süzgeç kağıtları kullanılarak süzüldü. Örneklerin ağır metal kalıntı düzeyleri VARIAN-CCD Simultaneous marka ICP-AES cihazıyla belirlendi (8, 17).
İstatistiksel analizler: Araştırmada elde edilen verilerin istatistiksel değerlendirilmesinde SPSS 15.0
paket programından yararlanarak varyans analizi
uygulandı. Önemli varyans kaynakları arasındaki
farklarda Duncan Testi uygulamasıyla belirlendi
(20).
7
Bulgular
Araştırmada, Konya yöresinde en çok tüketilen
peynir çeşitleri olan beyaz salamura, tulum ve kaşar
peynirlerinden 30’ar adet numune, çeşitli perakende
satış yerlerinden toplanarak, alüminyum, bakır, demir, nikel, kadmiyum, kurşun, çinko ve krom metallerinin kontaminasyonu yönünden incelendi. Peynir
numunelerinde elde edilen bulgular Tablo 1’de gösterilmektedir.
Tablo 1. Beyaz salamura, tulum ve kaşar peyniri numunelerinin ağır metal içerikleri (mg/kg).
Ağır metal
Beyaz salamura peyniri
(x ± Sx )
Tulum peyniri
(x ± Sx )
Kaşar peyniri
(x ± Sx )
P değeri
Alüminyum
3.12 ± 0.46 a
0.59 ± 0.03 b
0.64 ± 0.04 b
0.000
Bakır
1.44 ± 0.09 a
1.06 ± 0.05 b
1.35 ± 0.04 a
0.000
Demir
17.47 ± 0.59 a
14.18 ± 0.63 b
15.42 ± 0.40 b
0.000
Nikel
0.49 ± 0.06
0.65 ± 0.19
0.43 ± 0.03
0.393
Kadmiyum
0.12 ± 0.003 a
0.10 ± 0.002 b
0.11 ± 0.003 b
0.000
Kurşun
0.13 ± 0.02
0.08 ± 0.01
0.12 ± 0.02
0.131
Çinko
15.35 ± 0.72 b
15.96 ± 1.30 b
27.15 ± 0.71 a
0.000
Krom
0.49 ± 0.02
0.70 ± 0.19
0.50 ± 0.01
0.303
a, b: Aynı satırda farklı harf taşıyan ortalamalar arasındaki farklılık önemlidir (P<0.05).
Tartışma ve Sonuç
Beyaz salamura peynirlerde tespit edilen ortalama
alüminyum miktarının, tulum ve kaşar peynirlerinin
alüminyum içeriğinden anlamlı düzeyde (P<0.001)
yüksek olduğu belirlendi (Tablo 1). Araştırmada,
alüminyum miktarları, Ayar ve ark.’nın (5) beyaz
salamura peynirlerde tespit ettikleri ortalama değerlerle (3.31 mg/kg) benzer düzeyde, tulum ve kaşar
peynirlerinde tespit ettikleri değerlerden (sırasıyla
8.12 mg/kg, 5.79 mg/kg) ise daha düşük düzeyde
bulundu. Crescenza ve Squacquerone isimli İtalyan
taze peynirlerinde alüminyum miktarı 30-50 mg/
kg olarak belirlenmiş (16), bulgular bu değerlerden düşük düzeylerde tespit edilmiştir. Türk Gıda
Kodeksi’ne (29) göre, bazı gıda maddeleri için maksimum limitler 2-15 mg/kg olarak bildirilmiştir. Numunelerde tespit edilen değerler üst limitin altında
kalmaktadır. Beyaz salamura peynir numunelerinde
gözlenen yüksek alüminyum miktarı muhafaza ve
olgunlaştırma aşamasında, peynirde bulunan laktik asitin, peynirin ambalajlandığı teneke kutularda
meydana getirebileceği aşınmalardan kaynaklana-
bileceği kanısını (6) doğrulamaktadır. Tulum peynirinin deri veya bez tulumlarda ambalajlanması ve
birçok peynir çeşidine göre daha fazla tuz içermesi,
kaşarında çoğunlukla taze olarak tüketime sunulması ve termoplastik materyallerle vakumla ambalajlanması (26), bulaşmanın az olmasına sebep olabilir. Ayar ve ark. (5) tuzlama işleminin alüminyum,
kurşun ve kadmiyum elementlerinin kaybolmasına
neden olduğunu, Temurci ve Güner (27) ise metal
kaplarda muhafaza edilen peynirlerin alüminyum
düzeylerinin yüksek olduğunu bildirmişlerdir.
Beyaz salamura ve kaşar peynirlerindeki bakır içeriğinin, tulum peynirindeki bakır içeriğinden
anlamlı düzeyde (P<0.001) yüksek olduğu tespit
edilmiştir (Tablo 1). Araştırma verileri Mendil’in
(18), beyaz salamura peynir, Kars kaşar peyniri ve
Erzincan tulum peynirlerinde (sırasıyla 0.21 µg/g,
0.27 µg/g, 0.16 µg/g) ve Merdivan ve ark.’nın (19),
beyaz salamura peynirde tespit ettikleri değerlerden
(0.53 µg/g) yüksek çıkmıştır. Sağun ve ark. (22),
otlu peynirde bakır miktarının 90 günlük olgunlaşma süresince önemli bir değişiklik göstermediğini
gözlemlemişler; düzeyini 9.37-10.1 mg/kg olarak
8
belirlemişlerdir. Lante ve ark. (16), Crescenza ve
Squacquerone peynirlerinde bakır düzeylerini ise
0.2-1.1 mg/kg olarak belirlemişlerdir. Bulgular Sağun ve ark.’nın (22) tespit etiği değerden düşük,
Lante ve ark.’nın (16) tespit ettiği değerler ile kıyaslandığında ise, tulum peynirinde benzer, beyaz
salamura ve kaşar peynirlerinde düşük düzeylerde
belirlenmiştir. Türk Gıda Kodeksi’nde (29), bazı
bitkisel ve hayvansal içerikli gıdalar için maksimum
limitler 0.05-50 mg/kg olarak bildirilmiştir. Tespit
edilen değerler bu limitler arasında kalmaktadır. Beyaz salamura ve kaşar peynirlerindeki tespit edilen
bakır miktarlarının, tulum peynire göre yüksek olması, bakırın peynirlere yapımında kullanılan ekipmanlardan geçebileceği kanısını uyandırmaktadır.
Ayrıca tarım ilaçlarında bakırın yüksek miktarlarda
bulunduğu (27) göz önüne alınırsa, hayvan yemlerinden süte, dolayısıyla peynire geçebilecek bakırın
bu düzeylerde bulunabilmesi normal olarak karşılanabilir.
Araştırmada, beyaz salamura peynirde tespit
edilen demir miktarının, tulum ve kaşar peynirlerinin demir içeriğinden anlamlı düzeyde yüksek
(P<0.001) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 1). Tarakçı ve ark. (25), Dumas çökeleği üzerinde yaptıkları
araştırmada demir oranını 10.26 mg/kg olarak belirlerken, Park (21), otlu peynirlerde demir oranını ortalama 17.70 mg/kg düzeyinde tespit etmiştir.
Mendil (18), beyaz salamura peynir, Erzincan tulum
ve Kars kaşar peyniri üzerinde yaptığı araştırmada
demir miktarlarını sırasıyla 10.00 µg/g, 5.7 µg/g,
7.5 µg/g olarak belirlemişlerdir. Bulgular Tarakçı
ve ark. (25) ve Mendil (18) ile Merdivan ve ark.’nın
(19) beyaz salamura peynirlerde tespit ettikleri demir değerlerinden (5.43 µg/g) yüksek olup, Park’ın
(21) otlu peynirde tespit ettikleri demir düzeyi ile
benzerlik göstermiştir. Türk Gıda Kodeksi’ne (29)
göre bazı gıda maddeleri için maksimum demir
miktarları 0.2-25 mg/kg olarak bildirilmiştir. Tespit edilen değerler bu sınırlar içinde kalmaktadır.
Numunelerde tespit edilen demir miktarının alüminyum ve bakır gibi oldukça düşük düzeyde bulunmuş olması, peynir üretiminde kullanılan alet ve
ekipmanlar ile ambalaj materyallerinden kaynaklanabileceğini, Türk Gıda Kodeksi’nde (29) belirtilen
sınırlar içinde kalması nedeniyle de bu düzeylerde
normal sayılabileceğini düşündürmektedir.
Peynir numunelerinde, beyaz salamura, tulum
ve kaşar peynirlerinde tespit edilen nikel düzeyle-
rinin birbirlerine yakın olduğu ve herhangi bir anlamlılık arz etmediği görülmüştür (Tablo 1). Mendil (18), beyaz salamura peynir, Erzincan tulum ve
Kars kaşar peynirlerde yaptığı bir çalışmada nikeli
sırasıyla 0.23 µg/g, 0.26 µg/g ve 0.18 µg/g olarak
tespit etmiş, Merdivan ve ark. (19) beyaz salamura
peynirlerde nikel miktarını 1.22 µg/g olarak belirlemişlerdir. Kılıçel ve ark. (15) otlu lorlarda nikel
düzeyini 0.30 mg/kg, Alberti-Fidanza ve ark. (3) ise
peynirler üzerine yaptıkları çalışmada nikel miktarını 0.34 µg/g olarak tespit etmişlerdir. Bulgular
Mendil (18), Kılıçel ve ark. (15), Alberti-Fidanza ve
ark.’nın (3) tespit ettiği değerlerden yüksek, Merdivan ve ark.’nın (19) tespit ettiği değerden düşük
bulunmuştur. Türk Gıda Kodeksi’nde (29) bazı gıda
maddeleri için maksimum limitler 0.1-0.2 mg/kg
olarak belirlenmiştir. Bulgular bu değerlerin üstündedir. Ancak WHO (33) tarafından belirtilen günlük maksimum tolere edilebilir limit (0.6 mg) ile
uyumludur. Nikel peynir üretiminde özellikle nikel
kaplamalı kapların kullanılmasından bulaşabilmektedir. Ayrıca süt, pıhtı ve/veya telemenin ısıtılması
esnasında alet ve ekipmanlardan nikel kontaminasyonunun artabileceği bildirilmektedir (32).
Beyaz salamura peynirin kadmiyum içeriğinin, tulum ve kaşar peynirlerinin kadmiyum içeriğinden anlamlı düzeyde (P<0.001) yüksek olduğu
tespit edildi (Tablo 1). Yapılan bir araştırmada (4)
peynir numunelerinin %50’sinde kadmiyum düzeyi
0.20 mg/kg olarak belirlenirken, Lante ve ark. (16)
Crescenza ve Squacquerone taze peynirlerinde kadmiyum belirleyememiştir. Yüzbaşı (34), kaşar peynirlerinde ortalama kadmiyum miktarını 1.82 ppb
(0.0182 mg/kg) olarak bildirmiştir. Bulgular Türk
Gıda Kodeksi’nin (30) bazı bitkisel ve hayvansal
gıdalar için belirlediği maksimum değerler (0.051.0 mg/kg) arasında olup sağlık için bir risk oluşturmamaktadır. Peynirlerde kadmiyum kontaminasyonu üzerinde, üretim yerlerinin sanayi bölgelerine
yakın olması, kömür yakıtıyla ısınma sonucunda
oluşan hava kirliliği, yapım aşamasında kullanılan
plastik maddeler ile alet ve ekipmanlardaki deterjan
kalıntıları etkili olmaktadır (1, 32).
Kurşun gıda maddelerine özellikle çevresel etkilerden bulaşmakta, trafiğin çok olduğu bölgelerde
ve sanayi kuruluşlarına yakın yerlerde fazlaca rastlanmaktadır (31). Araştırmada, beyaz salamura peynirin kurşun içeriğinin, tulum ve kaşar peynirlerinin
kurşun içerikleriyle benzer düzeylerde olduğu ve
herhangi bir anlamlılık arz etmediği görüldü (Tablo
1). Diğer taraftan numunelerde beyaz salamura peynir ve tulum peynirlerin 2 tanesinde (%6.7), kaşar
peynirlerinin 4 tanesinde (%13.3) kurşuna rastlanmamıştır. Ayar ve ark. (5) beyaz salamura peynir,
tulum ve kaşar peynirler üzerinde yaptıkları araştırmalarda en yüksek kurşun miktarına kaşar peynirinde (1.10 mg/kg) ve beyaz salamura peynirde
(0.92 mg/kg) rastlamış, kurşunun kazein tarafından
bağlanması nedeniyle peynirlerde yüksek düzeylerde olabileceğini bildirilmiştir. Ayrıca üretimde ve
ambalajlamada kullanılan malzemelerin de kurşun
miktarında etkili olduğu belirtilmektedir. Yapılan
diğer bir çalışmada (18) ise kurşun miktarı çeçil
peynirinde 0.14 µg/g, çömlek peynirinde 1.20 µg/g
düzeyinde belirlenmiştir. Türk Gıda Kodeksi’nde
(30) bazı bitkisel ve hayvansal gıda maddelerinde
maksimum kurşun miktarları 0.02-1.5 mg/kg olarak
bildirilmiştir. Bulgular bu değerlerle uyuşmaktadır.
Peynir numunelerinde, kaşar peynirlerde tespit
edilen ortalama çinko içeriğinin, beyaz salamura ve
tulum peynirlerinin çinko içeriğinden anlamlı düzeyde (P<0.001) yüksek olduğu belirlendi (Tablo
1). Türk Gıda Kodeksi (29), bazı gıda maddelerindeki maksimum miktarları 2-50 mg/kg olarak bildirmiştir. Araştırma sonucunda bulunan değerler bu
sınırların içindedir. Bulgular Kılıçel ve ark.’nın (15)
otlu lorlarda (29.19 mg/kg) tespit ettiği değerden
düşük, Gambelli ve ark.’nın (12) Ricotta peynirlerinde ve Mendil’in (18) beyaz salamura peynirlerde tespit ettiği değerlerden (sırasıyla 3.5-4.8 mg/kg
ve 12.0 µg/g) yüksek bulunmuştur. Park (21) otlu
peynirlerde çinko düzeyini 7.75 mg/kg olarak tespit
etmiştir. Bulgular bu sonucunda üstündedir. Çinkonun peynirlere yapım aşamasında kullanılan metal
kaplardan bulaşabileceği, teneke kutularda ambalajlanan peynirlerde olgunlaşma ve muhafaza sırasındaki asit artışına bağlı olarak yüksek düzeylerde
bulunabileceği bildirilmektedir (4).
Araştırmada, beyaz salamura peynirin krom
düzeyinin, tulum ve kaşar peynirlerinin krom içerikleriyle yakın olduğu ve herhangi bir anlamlılık
arz etmediği görüldü (Tablo 1). Coni ve ark. (10)
koyun peynirlerinde yaptıkları çalışmada krom düzeyini 10.05 µg/g, Merdivan ve ark. (19) beyaz salamura peynirde 0.17 µg/g, Kılıçel ve ark. (15) otlu
peynirlerde 0.25 mg/kg olarak tespit etmişlerdir.
Mendil (18) beyaz salamura peynirlerde kromu 0.55
µg/g, Erzincan tulumunda 0.34 µg/g, Kars kaşar
9
peynirinde 0.62 µg/g, Gambelli ve ark. (12) Ricotta
peynirlerinde 0.073 mg/kg, Mozzarella peynirlerinde 0.069 mg/kg düzeyinde belirlemişlerdir. Tespit
edilen değerler, Coni ve ark.’nın (10) belirledikleri
krom düzeyinden düşük, Mendil’in (18) bulgularıyla benzer, Kılıçel ve ark. (15), Merdivan ve ark.
(19) ile Gambelli ve ark.’nın (12) tespit ettiği değerlerden yüksek bulunmuştur. Kromun peynir üretiminde özellikle ısıtma işlemi sırasında kullanılan
alet ve ekipmanlardan bulaşabileceği bildirilmektedir (14). Bulgular Bratakos ve ark.’nın (7) peynirde saptadıkları değerler (0.04-0.11 µg/kg) dikkate
alındığında bu durumu doğrulamaktadır. Türk Gıda
Kodeksi’nin ilgili tebliğlerinde (29, 30) maksimum
krom miktarları belirtilmemiştir.
Sonuç olarak, beyaz salamura, tulum ve kaşar
peynirlerine ait numuneler arasında üretim tekniğindeki dolayısıyla çeşidindeki farklılıklara bağlı olarak alüminyum, bakır, demir, kadmiyum ve çinko
içeriklerinde anlamlı farklılıklar saptandı. Bununla
birlikte numunelerdeki ağır metal miktarlarının Türk
Gıda Kodeksi’nin (29, 30) bazı gıdalarda belirlediği
sınırlar içinde bulunduğu tespit edildi. Ciddi sağlık
problemleri oluşturabilecek kurşun, nikel ve kadmiyumun peynirlerdeki düzeylerinin daha düşük seviyelere çekilebilmesi için, daha bilinçli ve kontrollü
bir üretim gerçekleştirilmelidir. Bu amaçla özellikle
üretim yerlerinin ve kullanılan materyallerin kimyasal atıklardan ve çevre kirliliği görülebilecek yerlerden uzakta olması sağlanmalı, hayvanlara yedirilen
yemlerin hazırlanmasında mümkün olduğunca kimyasal içerikli yem maddelerinden ve ilaçlardan uzak
durulmalıdır.
Kaynaklar
1. Abernathy AR, Larson GL, Mathews Jr, (1984). Heavy
metals in surficial sediments of Fontana Lake, North Carolina. Water Res. 18(3), 351-354.
2. Akın N, Ayar A, Sert D, Çalık N, (2003). Konya ilinin değişik bölgelerinden toplanan sütlerin ağır metal içerikleri
üzerine bir araştırma. Süt Endüstrisinde Yeni Eğilimler
Sempozyumu Bildiriler Kitabı. 355-358, 22-23 Mayıs, İzmir.
3. Alberti-Fidanza A, Buruni G, Periello G, (2002). Trace elements in foods and meals consumed by students attending
the faculty cafeteria. Sci Total Environ. 287, 133-140.
4. Anonymous, (2003). Heavy metals and pesticides residue
in the foodstuff. Auroville Innovative Urban Management,
IND-015, Annexes, Final Report.
5. Ayar A, Sert D, Akın N, (2007). Konya’da tüketime sunulan süt ve ürünlerinin ağır metal içeriklerinin belirlenmesi.
Selçuk Üniv Ziraat Fak Derg. 21(41), 58-64.
10
6. Belgaied JE, (2003). Release of heavy metals from Tunisian
tarditional earthenware. Food Chem Toxicol. 41, 95-98.
7. Bratakos MS, Lazos ES, Bratakos SM, (2001). Chromium
content of selected Greek foods. Sci Total Environ. 290, 4758.
8. Brooks RR, ed., (2000). Phytochemistry of Hyperaccu-mulators. In plants that hyperaccumulate heavy metals. CABI
Publishing, New York. p. 18-21.
9. Concon JM, (1988). Food Toxicology, Part B. Contaminants
and additives. Marcel Doccor Inc, New York and Basel. p.
1351.
10. Coni E, Bocca A, Coppolelli P, Caroli S, Cavalucci C,
Trabalza Marinucci M, (1996). Minor and trace element
content in sheep and goat milk and dairy products. Food
Chem. 57(2), 253-260.
11. Dabeka RW, McKenzie AD, (1992). Total diet study of
lead and cadmium in food composites: preliminary investigations. J AOAC International. 75(3), 386- 394.
12. Gambelli L, Belloni P, Ingrao G, Pizzoferrato L, Santaroni GP, (1999). Minerals and trace elements in some
Italian dairy products. J Food Compos Anal. 12, 27-35.
13. Güder G, (2006). Avrupa birliği gıda güvenliği politikası
ve üyelik sürecinde Türkiye’ye yansımaları. Uzmanlık Tezi.
Yayın No: DPT 2696. TC Başbakanlık DPT, AB İle İlişkiler
Genel Müdürlüğü, Ankara.
14. Jensen RG, (1995). Handbook of milk composition. Academic Press, New York. p. 897-899.
15. Kılıçel F, Tarakçı Z, Sancak H, Durmaz H, (2004). Otlu
lorların mineral madde ve ağır metal içerikleri. Yüzüncü
Yıl Üniv Ziraat Fak Tarım Bilimleri Derg. 14(1), 41-45.
16. Lante A, Lomolino G, Cagnin M, Spettoli P, (2006).
Content and characterisation of minerals in milk and in
Crescenza and Squacquerone Italion fresh cheeses by ICPOES. Food Control. 17(3), 229-233.
17. Laurent L, (1997). Minerals. Analysis of food constituents.
Multon, JL. ed. Viley-VCH Inc., Canada. p. 90-95.
18. Mendil D, (2006). Mineral and trace metal levels in some
cheese collected from Turkey. Food Chem. 96(4), 532-537.
19. Merdivan M, Yilmaz E, Hamamci C, Aygun RS, (2004).
Basic nutrients and element contents of white cheese of Diyarbakir in Turkey. Food Chem. 87(2), 163-171.
20. Özdamar K, (1997). Paket programlar ile istatistiksel veri
analizi 1. Anadolu Üniv Yayınları No: 1001, Fen Fakültesi
Yayınları No:11, Eskişehir.
21. Park YW, (1990). Nutrient profiles of commercial goat
milk cheses manufactured in the United States. J Dairy Sci.
73(11), 3059-3067.
22. Sağun E, Tarakçı E, Sancak E, Durmaz H, (2005). Salamura otlu peynirde olgunlaşma süresince mineral madde
değişimi. Yüzüncü Yıl Üniv Vet Fak Derg. 16(1), 21-25.
23. Şahan Y, (2003). Süt ürünlerinde ağır metal kontaminasyonu. Süt Endüstrisinde Yeni Eğilimler Sempozyumu Bildiriler Kitabı. 347-350, 22-23 Mayıs, İzmir.
24. Şimşek O, Gültekin R, Öksüz O, Kurultay S, (2000). The
effect of environmental pollution on the heavy metal content
of raw milk. Nahrung/Food. 44(5), 360-363.
25. Tarakçı Z, Yurt B, Küçüköner E, (2003). Darende Dumas
çökeleğinin yapılışı ve bazı özellikleri üzerine bir araştırma. Gıda, 28(4), 421-427.
26. Tekinşen OC, Tekinşen KK, (2005). Süt ve süt ürünleri:
temel bilgiler, teknoloji, kalite kontrolü. Selçuk Üniversitesi
Basımevi, Konya.
27. Temurci (Usta) H, Güner A, (2006). Ankara’da tüketime
sunulan süt ve beyaz peynirde ağır metal kontaminasyonu.
Atatürk Üniv Vet Bilimleri Derg, 1(1-2), 20-28.
28. Tripathi RM, Raghuanth R, Sastry VN, Krishnamoorthy TM, (1999). Daily intake of heavy metals by infants through milk and milk products. Sci Total Environ.
227(2-3), 229-235.
29. Türk Gıda Kodeksi, (2002). Gıda maddelerinde belirli bulaşanların maksimum seviyelerinin belirlenmesi hakkında
tebliğ. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tebliğ No: 2002/63,
Ankara.
30. Türk Gıda Kodeksi, (2008). Gıda maddelerindeki bulaşanların maksimum limitleri hakkında tebliğ. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tebliğ No: 2008/26, Ankara.
31. Vidovic M, Sadibasic A, Cupic S, Lausevic M, (2005).
Cd and Zn in atmospheric deposit, soil, wheat and milk.
Environ Res. 97(1), 26-31.
32. Vural H, (1993). Ağır metal iyonlarının gıdalarda oluşturduğu kirlilikler. Ekoloji. 8, 3-8.
33. WHO, (1989). Thirty-third report of the Joint FAO/ WHO
Expert Committee on Food Additives. WHO Technical Report No: 776, Geneva.
34. Yüzbaşı N, (2001). Kaşar peynirinde bazı ağır metallerin
düzeyi ve prosesteki değişimi. Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
Etlik Vet Mikrobiyol
Derg,Ulusoy
21, 11Y,- 16,
2010
Makalesi
/ Research Article
11
Uzun FG,
Demir
F, Kalender S. Etlik Vet MikrobiyolAraştırma
Derg, 21, 11
- 16, 2010
Malathion’un ratların ince bağırsak dokusu üzerine etkisi ve vitamin C ve
E’nin koruyucu rolü
Fatma Gökçe UZUN1, Yavuz ULUSOY2, Filiz DEMİR1, Suna KALENDER3
Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü; 2Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü
Patoloji Laboratuvarı; 3Gazi Üniversitesi Gazi Eğitim Fakültesi Fen Bilgisi Eğitimi, Ankara, Türkiye
1
Özet: Organofosfatlı bir pestisit olan malathion pestleri kontrol etmek için tarımda ve ev uygulamalarında sıklıkla kullanılan bir insektisittir. Bu çalışmada 300–320 g ağırlığındaki erkek Wistar ratlara vitamin C (200 mg/kg) + vitamin E
(200 mg/kg), malathion (27 mg/kg) ve vitamin C (200 mg/kg) + vitamin E (200 mg/kg) + malathion (27 mg/kg) 4 hafta
süreyle oral gavaj yoluyla verilmiştir. Uygulamadan 4 hafta sonra ratların ince bağırsaklarındaki histopatolojik değişiklikler ışık mikroskobu altında kontrol grubu ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Malathion uygulandıktan 4 hafta
sonra ratların ince bağırsaklarında nekroz, ödem ve hiperemi gibi histopatolojik değişiklikler gözlenirken vitamin C +
vitamin E + malathion uygulanan grupta nekroz ve mononüklear hücre infiltrasyonu gözlenmiştir. Sonuç olarak düşük
doz malathion’un ratların ince bağırsaklarında histopatolojik değişikliklere neden olduğu tespit edilmiştir. Vitamin C ve
vitamin E’nin malathion’un ince bağırsakta neden olduğu histopatolojik değişiklikleri önlemediği gözlenmiştir.
Anahtar sözcükler: Histopatoloji, ince bağırsak, malathion, vitamin C, vitamin E.
Effects of malathion in small intestine tissue of rats and protective role of vitamin C and E
Summary: Malathion is an organophosphate pesticide that is widely used in agricultural and household applications
to control pests. In this study, sexually mature male Wistar rats (weighing 300–320 g) were given malathion (27 mg/
kg) and/or vitamin C (200 mg/kg) + vitamin E (200 mg/kg) daily via gavage for 4 weeks. At the end of fourth week,
histopathological changes in small intestine were investigated using light microscope comparatively with control group.
Necrosis, edema and hyperemia were observed in the small intestine tissues of malathion treated group. It was observed
that there were necrosis and mononuclear cell infiltration in the small intestine of vitamin C + vitamin E + malathion
treated group. As a result, lower doses of malathion caused histopathological changes in the rat small intestine. It was
determined that vitamin C and vitamin E have not prevented the histopathological changes caused by malathion in small
intestine tissues.
Key words: Histopathology, malathion, small intestine, vitamin C, vitamin E.
Giriş
Organofosfatlı bileşikler tarımda insektisit ve akarisit olarak sıklıkla kullanılan bir pestisit grubudur
(27). Organofosfatlı pestisitlerin kalıntıları, toprakta, su organizmalarında, sebzelerde, tohumlarda
ve diğer besin ürünlerinde tespit edilmiştir (8, 27).
Halk sağlığı ve tarım uygulamalarında organofosfatlı pestisitlerin geniş bir şekilde kullanımı önemli
bir sağlık riski oluşturan çevresel kirlenmeye neden
olduğundan insanların akut ya da kronik zehirlenmelerine sebep olmaktadır (15). Organofosfatlı
insektisitlerin lipofilik özelliğinden dolayı hücre
membranı ile etkileşimini kolaylaştırdığı ve pek
çok iç organın hücrelerinde fosfolipit tabakasında düzensizliğe neden olduğu bilinmektedir (16).
Organofosfatlı bileşiklerin ilk hedefi asetilkolines-
terazdır. Organofosfatlı pestisitler tarafından asetilkolinesterazın inhibisyonu kolinerjik sinapslarda
asetilkolinin birikmesine sebep olur. Bu da kolinerjik sendrom olarak adlandırılan muskarinik ve nikotinik reseptörlerin aşırı uyarılmasına neden olur
(6). Bununla beraber, organofosfatlı pestisitlerin
pseudokolinesterazı inhibe ettiği de bilinmektedir
(13, 14, 18). Organofosfatlı pestisitlerin deney hayvanlarında immun sistem (79), üreme sistemi (27,
28), karaciğer (7, 13, 31), böbrek (12), hematolojik
sistem (5) ve sinir sistemi (4) gibi pek çok sistem ve
organı etkilediği bildirilmiştir. Ayrıca organofosfatlı bileşiklerin ince bağırsakları etkilediği de rapor
edilmiştir (3, 19).
Malathion [O,O-dimethyl-S-(1,2-dicarbet-hoxyethyl) phosphorodithioate] pestleri kontrol etmek
Yazışma adresi / Correspondance: Fatma Gökçe Uzun, Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü,
06500, Ankara, Türkiye E-posta: [email protected]
12
Uzun FG, Ulusoy Y, Demir F, Kalender S. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 11 - 16, 2010
için tarım ve ev uygulamalarında sıklıkla kullanılan
organofosfatlı bir pestisittir. Malathion’un yaygın
şekilde kullanımı ve besin ürünlerindeki yüksek
miktarı insanlar, hayvanlar ve kuşların bu pestisite yüksek oranda maruz kalmasına neden olabilir
(26). Malathion’un hedef dokularda asetikolinesterazı inhibe ettiği bilinmektedir (21, 22). Ayrıca
malathion’un biyolojik olarak aktif formu malaokzon yolu ile de toksik etki gösterdiği bilinmektedir.
Malathion’un lipitte çözünebildiği ve karaciğer ve
diğer lipofilik dokularda depolanabildiği bildirilmiştir (15). Yapılan önceki çalışmalarda malathion’un
deney hayvanlarında karaciğer (7), testis (27) ve
beyin (4) gibi dokular üzerinde olumsuz etkilere neden olduğu görülmüştür.
Antioksidan vitaminler immun stimülasyonu
ve karsinojenlerin metabolik aktivitelerinde değişiklik gibi pek çok biyolojik aktiviteye sahiptirler
(29). Vitamin E en önemli lipofilik antioksidandır
ve çoğunlukla hücre membranlarında bulunur. Bu
nedenle membran stabilitesinin sürdürülmesine
yardım eder. Vitamin C hidrofiliktir ve ekstraselüler sıvılarda sulu ortamda radikalleri yakalayan ve
biyomembranları peroksidatif hasardan koruyan en
önemli serbest radikal temizleyicisidir. Antioksidan özelliklerine ek olarak vitamin C membranda
tokoferil radikallerinden tokoferol rejenerasyonunu da gerçekleştirir. Bu nedenle vitamin C ve vitamin E interaktif etkilere sahiptirler (25). Yapılan
önceki çalışmalarda vitamin C ve E’nin pestisitlerin neden olduğu toksisiteye karşı koruyucu olduğu gösterilmiştir (27, 28, 30). Bu çalışmanın amacı
malathion’un subakut uygulamasının ratların ince
bağırsak dokularında meydana getirebileceği histopatolojik değişiklikleri incelemek, bunun yanı sıra
malathion’un ince bağırsaklarında sebep olabileceği histopatolojik değişikler üzerine vitamin C ve E
kombinasyonun koruyucu rolünü araştırmaktır.
Materyal ve Metot
Hayvanlar: Bu çalışmada 300-320 g ağırlığında erkek Wistar ratlar kullanıldı. Gazi Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Yetiştirme ve Deneysel Araştırmalar Merkezi (GÜDAM)’nden temin edilen ratlar
özel besleme kafesleri içerisinde her kafeste 6 rat
olacak şekilde yerleştirildi. Deney hayvanları standart laboratuvar besini ve su ile beslendi. Ratlara 20
± 2ºC oda sıcaklığında, 12 saat aydınlık/karanlık fotoperiyodu uygulandı. Ratlar uygulama yapılmadan
10 gün önce karantina altına alındı. Bu çalışma için
Bozok Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik
Kurulu’ndan onay alınmıştır.
Kimyasallar: Malathion, Ankara Zirai Mücadele Merkezi’nden temin edildi. Vitamin E (DL-αtocopherol acetate) Merck’ten (Almanya), vitamin
C (L-ascorbic acid) ise Carlo Erba’dan (Milano,
İtalya) sağlandı.
Hayvanlara uygulama planı: Ratlar kontrol grubu (n=6) ve uygulama grubu (n=18) olmak üzere
iki gruba ayrıldı. Uygulama grubu da kendi içerisinde üç gruba ayrıldı; malathion uygulanan grup
(n=6), vitamin C + vitamin E uygulanan grup (n=6)
ve vitamin C + vitamin E + malathion uygulanan
grup (n=6). Uygulamalar sabah 09:00-10:00 saatleri
arasında aç olmayan ratlara yapıldı. Uygulamanın
yapıldığı ilk gün deneyin 0’ıncı günü olarak kabul
edildi. Uygulamadan 4 hafta sonra her gruptan 6 rat
disekte edilerek patolojik incelemeler için bağırsak
örnekleri alındı.
Kontrol grubu: Her bir rata günlük 0.2 ml mısır
yağı oral olarak gavaj yoluyla verildi.
Vitamin C + vitamin E uygulanan grup: Her bir
rata günlük 200 mg/kg vitamin C (L-ascorbic acid)
distile su içerisinde çözülerek oral gavaj yoluyla verildi. Daha sonra aynı hayvanlara 200 mg/kg vitamin E (DL-α-tocopherol acetate) mısır yağı içerinde
çözülerek oral gavaj yoluyla verildi.
Malathion uygulanan grup: Her bir rata günlük
27 mg/kg malathion (1/50 LD50) mısır yağı içerisinde çözülerek oral gavaj yoluyla verildi.
Vitamin C + vitamin E + malathion uygulanan
grup: Her bir rata günlük 200 mg/kg vitamin C (Lascorbic acid) distile su içerisinde çözülerek oral
gavaj yoluyla verildi. Yine aynı hayvanlara 200 mg/
kg vitamin E (DL-α-tocopherol acetate) mısır yağı
içerinde çözülerek oral gavaj yoluyla verildi. Aynı
hayvanlara 27 mg/kg malathion (1/50 LD50) mısır
yağı içerisinde çözülerek oral gavaj yoluyla verildi.
Ratlara malathion uygulaması vitamin uygulamasından 30 dk sonra yapıldı.
Işık mikroskobu incelemeleri: Deneyin sonunda
ratlar disekte edilerek histopatolojik incelemeler
için ince bağırsakları alındı. Nötral formalin solüsyonunda 24 saat süreyle tespiti yapıldıktan sonra
akan musluk suyu altında yıkandı. Yükselen alkol
serilerinden geçirilerek dehidrasyonu yapıldıktan
sonra parafin ortamında bloklandı. Parafin bloklar-
13
dan mikrotomda (Microm) 5-6 μm kalınlığında ince
kesitler alındı ve alınan kesitler ışık mikroskobu
incelemeleri için hematoksilen-eosin ile boyandı.
Kesitler fotoğraf makinesi ataçmanlı ışık mikroskobunda (Olympus Bx51) incelendi ve fotoğrafları
çekildi.
Bulgular
Kontrol grubu ve vitamin C + vitamin E uygulanan
gruptaki ratların ince bağırsak dokularının histolojisi normal yapıda gözlendi (Şekil 1, Şekil 2). Malathion uygulamasından 4 hafta sonra ratların ince
bağırsaklarındaki villuslarda nekroz, ödem, villus
atrofisi ve villuslarda dejenerasyon ve hiperemi
gözlendi (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6). Vitamin
C + vitamin E + malathion uygulanan ratların ince
bağırsak dokularında ise nekroz ve mononüklear
hücre infiltrasyonu gözlendi (Şekil 7, Şekil 8).
Şekil 3: Malathion muamelesinden 4 hafta sonra ratların ince
bağırsaklarında nekrotik alanlar (N), HE, ×200.
bağırsaklarında villus atrofisi () ve ödem (), HE, ×200.
Şekil 1: Kontrol grubu ratların ince bağırsaklarının histolojik
yapısı. L: Lümen, : Villus, : Kas tabakası, HE, ×200.
bağırsaklarında hücre infiltrasyonu (), HE, ×400.
Şekil 2: Vitamin C + E uygulanmış ratların ince bağırsaklarının
histolojik yapısı. , : Villus, : Kas tabakası, HE, ×200.
14
Tartışma
Malathion tarım alanlarında, meyvelerde, fındık
ağaçlarında, sebzelerde, hayvancılıkta ve hayvan
bakım ürünlerinde kullanılan geniş spektrumlu bir
insektisit ve akarisittir (17). Malathion’un oldukça
yaygın olarak kullanımının memeliler, kuşlar ve
hedef olmayan omurgasızların maruziyetine neden
olduğu bilinmektedir (13, 24, 26). Epidomiyolojik
çalışmalar ile malathion’un akut ve kronik maruziyette memeliler için oldukça toksik olduğu gösterilmiştir (15). Malathion’un erkek ratlar için oral LD50
değeri 1350 mg/kg’dır (9).
Şekil 6: Malathion muamelesinden 4 hafta sonra ratların
ince bağırsaklarında hiperemi (), HE, ×200.
Şekil 7: Vitamin C+Vitamin E + malathion muamelesinden 4 hafta sonra ratların ince bağırsaklarında nekrotik
alanlar (), HE, ×200.
Şekil 8: Vitamin C + Vitamin E + malathion muamelesinden 4 hafta sonra ratların ince bağırsaklarında hücre
infiltrasyonu (), HE, ×200.
Yapılan pek çok çalışmada organofosfatlı pestisitlerin deney hayvanlarının çeşitli dokularında histopatolojik değişikliklere neden olduğu görülmüştür
(2, 5, 18, 23, 28). Malathion’un ratların karaciğer
dokularında çeşitli histopatolojik ve biyokimyasal
değişikliklere neden olduğu bildirilmiştir (13, 15,
22). Ratlara oral yoldan uygulanan 27 mg/kg (1/50
LD50) dozundaki malathion’un subakut etkisinde
testis dokularında dejenerasyona, sperm miktarı ve
sperm motilitesinde azalmaya ve anormal sperm
morfolojisinde artışa neden olduğu bildirilmiştir
(27). Pournourmohammadi ve ark. (20) yapmış oldukları bir çalışmada ratlara 5, 10 ve 20 mg/kg dozlarında malathion’u oral yoldan uyguladıklarında 10
ve 20 mg/kg dozlarında uygulama yapılan ratların
pankreas dokularında histopatolojik değişiklikler
meydana geldiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada da
1/50 LD50 dozunda malathion erkek ratlara 4 hafta
süreyle uygulandığında ince bağırsaklarında histopatolojik değişikliklere neden olduğu gözlenmiştir.
Deneysel periyot boyunca ratlarda ölüm meydana
gelmemiştir.
İyonize radyasyon ile yapılan bir çalışmada ratların ince bağırsak dokularında villuslarda şekil bozuklukları, lamina propria’da ayrılma, villus epitelinde dökülme gibi dejeneratif değişiklikler olduğu
rapor edilmiştir (1). Organofosfatlı bir pestisit olan
metil parathion uygulanan ratların ince bağırsak
dokularında villuslarda dejenerasyon, granülasyon,
genişleme ve bazı bölgelerde infiltrasyon olduğu
bildirilmiştir (19). Çetin ve ark. (3) yaptıkları bir
çalışmada organofosfatlı bir pestisit olan diklorvosun 4 ve 7 haftalık uygulamasından sonra ratların
ince bağırsak dokularında villuslarda dejenerasyon
şekillendiğini bildirmişlerdir (3). Bu çalışmada 27
mg/kg dozundaki malathion’un 4 haftalık uygulamasının erkek ratların ince bağırsaklarında villus
atrofisi, nekroz, ödem, villuslarda dejenerasyona ve
hiperemiye neden olduğu görülmüştür.
Antioksidan vitaminlerin etkili konsantrasyonlarında patolojik durumları inhibe ettiği bilinmektedir (11). Düşük moleküler ağrılıklı bir antioksidan
olan vitamin C suda çözünebilen oksijen nitrojen
radikallerine karşı hücresel kompartımanları güçlendirir (10). Vitamin E membranları korumak için
serbest radikal zincir reaksiyonlarını önleyen, oksijen radikalleri ile reaksiyona giren ana endojen antioksidandır (11). Yapılan çalışmalarda antioksidan
vitaminler olan vitamin C ve vitamin E’nin ratların
çeşitli dokularında pestisitlerin neden olduğu hasarı
azalttığı rapor edilmiştir (13, 19, 27, 28). İyonize
radyasyon ile birlikte vitamin C uygulanan ratların ince bağırsak mukozasında radyasyonun neden
olduğu mukozal hasarın doza bağlı olarak azaldığı
bildirilmiştir (1). Ancak Çetin ve ark. (3) yaptıkları
bir çalışmada ratlara diklorvos ile birlikte Vitamin C
+ vitamin E kombinasyonu uyguladıklarında diklorvosun ince bağırsakta neden olduğu histopatolojik
değişiklikleri azaltmadığını rapor etmişlerdir. Yapılan bir başka çalışmada metil parathion ile vitamin
C + vitamin E’nin birlikte uygulanması ratların ince
bağırsağında patolojik değişiklere neden olduğu bildirilmiştir (19). Bu çalışmada Vitamin C + vitamin E
+ malathion uygulanan ratların ince bağırsaklarında
uygulamadan 4 hafta sonra nekroz, villus epitelinde
dökülme, ödem ve mononüklear hücre infiltrasyonu
gözlenmiştir.
Sonuç olarak, 1/50 LD50 dozundaki malathion uygulamasından 4 hafta sonra ratların ince
bağırsak dokularında histopatolojik değişiklilere
neden olmuştur. Vitamin C + vitamin E kombinasyonun uygulanması ratların ince bağırsaklarında
malathion’un neden olduğu hasarı önlemediği gözlenmiştir.
Kaynaklar
1. Akpolat M, Topçu Tarladaçalışır Y, Kanter M, (2008).
İyonizan radyasyonun neden olduğu ince bağırsak hasarına karşı curcumin ve C vitamininin koruyucu etkilerinin
incelenmesi. Tıp Araştırmaları Dergisi. 6, 77 -85.
2. Büyükokuroğlu ME, Cemek M, Tosun M, Yürümez Y,
Baş O, Yavuz Y, (2008). Danrolene may prevent ofganophosphate- induced oxidative stres and muscle injury. Pestic
Biochem Phys. 92, 156–163.
3. Çetin A, Ulusoy Y, Öğütçü A, Uzun FG, Demir F, (2008).
Dichlorvos’un ratların ince bağırsak dokusu üzerine etkisi
15
ve vitamin C ve E’nin koruyucu rolü. Etlik Vet Mikrobiyol
Derg.19, 47-52.
4. Fortunato JJ, Feier G, Vitali AM, Petronilho FC, DalPizzol F, Qevedo J, (2006). Malathion-induced oxidative
stres in rat brain regions. Neurochem Res. 31, 671–678.
5. Garg UK, Pal AK, Jha GJ, Jadhao SB, (2004). Haemato-biochemical and immuno-pathophysiological effects of
chronic toxicity with synthetic pyrethroid, organophosphate
and chlorinated pesticides in broiler chicks. Int Immunopharmacol. 4, 1709–1722.
6. Giordano G, Sfdhsrinejad Z, Guizzetti M, Vitalone A,
Kavanagh TJ, Costa LG, (2007). Organophosphorus insecticides chlorpyrifos and diazinon and oxidative stres in
neuronal cells in a genetic model of glutathione deficiency.
Toxicol Appl Pharmacol. 219, 181-189.
7. Handy RD, Abd-El Samei HA, Bayomy MFF, Mahran
AM, Abdeen AM, El-Elaimy EA, (2002). Chronic diazinon exposure: pathologies of spleen, thymus, blood cells,
and lymph nodes are modulated by dietary protein or lipid
in the mouse. Toxicology 172, 13–34.
8. IARC, (1983). Monograph on the evaluation of carcinogenic risk of chemicals to man. Miscellaneous pesticides.
International Agency for Research on Cancer, vol. 30. Lyon
France.
9. John S, Kale M, Rathore N, Bhatnagar D, (2001). Protective effect of vitamin E in dimethoate and malathion induced oxidative stress in rat erythrocytes. J Nutr Biochem.
12, 500–504.
10. Jurczuk M, Brzóska MM, Moniuszko-Jakoniuk J,
(2007). Hepatic and renal concentrations of vitamins E and
C in lead- and ethanol-exposed rats: An assessment of their
involvement in the mechanisms of peroxidative damage.
Food Chem Toxicol. 45, 1478–1486.
11. Kadkhodaee M, Khastar H, Faghihi M, Ghaznavi R,
Zahmatkesh M, (2005). Effects of co-supplementation of
vitamins E and C on gentamicin-induced nephrotoxicity in
rat. Exp Physiol. 90, 571–576.
12. Kalender S, Kalender Y, Durak D, Ogutcu A, Uzunhisarcikli M, Cevrimli BS, Yildirim M, (2007). Methyl
parathion induced nephrotoxicity in male rats and protective role of vitamin C and E. Pestic Biochem Phys. 88,
213–218.
13. Kalender S, Uzun FG, Durak D, Demir F, Kalender Y,
(2010). Malathion-induced hepatotoxicity in rats: The effects of vitamins C and E. Food Chem Toxicol. 48, 633–
638.
14. Kalender Y, Uzunhisarcikli M, Ogutcu A, Acikgoz F,
Kalender S, (2006). Effects of diazinon pseudocho-linesterase activity and haematological indicates in rats: the protective role of vitamin E. Environ Toxicol Phar. 22, 46–51.
15. Lasram MM, Annabi AB, El Elj N, Semli S, Kamoun
A, El-Fazaa S, Gharbi N, (2009). Metabolic disorders of
acute exposure to Malathion in adult Wistar rats. J Hazadous Materials 163, 1052–1055.
16. Mahjoubi-Samet A, Fetoui H, Zeghal N, (2008). Nephrotoxicity induced by dimethoate in adult rats and their suckling pups. Pesticide Pestic Biochem Phys. 91, 96-103.
16
17. Masten SJ, Tian M, Upham BL, Trosko JE, (2001). Effect of selected pesticides and their ozonation by-products
on gap junctional intercellular communication using rat
liver epithelial cell lines. Chemosphere 44, 457–465.
18. Ogutcu A, Suludere Z, Kalender Y, (2008). Dichlorvosinduced hepatotoxicity in rats and the protective effects of
vitamin C and E. Environ Toxicol Phar. 26, 355–361.
19. Öğütçü A, Ulusoy Y, Kahraman K, Uzunhisarcikli M,
Uzun FG, Taştan H, (2007). Metil parathion’un sıçanların
ince bağırsak dokusu üzerine etkisi ve vitamin C ve E’nin
koruyucu rolü. Etlik Vet Mikrobiyol Derg. 18, 21–26.
20. Pournourmohammadi S, Ostad SN, Azizi E, Ghahremani MH, Farzami B, Minaie B, Larijani B, Abdollahi
M, (2007). Induction of insulin resistanse by Malathion:
Evidence for disrupted islets cells metabolism and mitochondrial dysfunction. Pestic Biochem Phys. 88, 346–352.
21. Rezg R, Mornagui B, El-Fazaa S, Gharbi N, (2008a).
Caffeic acid attenuates malathion induced metabolic disruption in rat liver, involvement of acetylcholinesterase activity. Toxicology 250, 27–31.
22. Rezg R, Mornagui B, El-Fazaa S, Gharbi N, (2008b).
Biochemical evaluation of hepatic damage in subchronic
exposure to malathion in rats: effect on superoxide dismutase and catalase activities using native PAGE. C. R.
Biologies 331, 655–662.
23. Sayim, F, (2007). Dimethoate-induced biochemical and
histopathological changes in liver of rats. Exp Toxicol
Pathol. 59, 237–243.
24. Sodhi S, Sharma A, Brar APS, Brar RS, (2008). Effect of
a tocoferol and selenium on antioxidant status, lipid peroxidation and hepatopathy induced by malathion in chicks.
Pestic Biochem Phys. 90, 82–86.
25. Sulak O, Altuntas I, Karahan N, Yildirim B, Akturk
O, Yilmaz HR, Delibas N, (2005). Nephrotoxicity in rats
induced by organophosphate insecticide methidation and
ameliorating effects of vitamins E and C. Pestic Biochem
Phys. 83, 21–28.
26. Suresh Babu N, Malik JK, Rao GS, Aggarwal M, Ranganathan V, (2006). Effects of subchronic malathion exposure on the pharmacokinetic disposition of pefloxacin.
Environ Toxicol Pharmacol. 22, 167–171.
27. Uzun FG, Kalender S, Durak D, Demir F, Kalender Y,
(2009). Malathion-induced testicular toxicity in male rats
and the protective effect of vitamins C and E. Food Chem
Toxicol. 47, 1903–1908.
28. Uzunhisarcikli M, Kalender Y, Dirican K, Kalender S,
Ogutcu A, Buyukkomurcu F, (2007). Acute, subacute and
subchronic administration of methyl parathion induced testicular damage in male rats and protective role of vitamins
C and E. Pestic Biochem Phys. 87, 115–122.
29. Verma RS, Mehta A, Srivastava N, (2007). In vivo chlorpyrifos induced oxidative stres: attenuation by antioxidant
vitamins. Pestic Biochem Phys. 88, 191–196.
30. Yavuz T, Delibas N, Yildirim B, Altuntas I, Candir O,
Cora A, Karaman N, Ibrisim E, Kutsal A, (2004). Vascular wall damage in rats induced by methidathion and
ameliorating effect of vitamins E and C. Arch Toxicol. 78,
655–659.
31. Yousef MI, Awad TI, Mohamed EH, (2006). Deltamethrin-induced oxidative damage and biochemical alterations in rat and its attenuation by vitamin E. Toxicology
227, 240–247.
Etlik Vet Mikrobiyol
21, 17S,- Ünal
21, 2010
Araştırma
17
ÜnDerg,
H, Tuncer
N, Aylan O. Etlik Vet Mikrobiyol Derg,
21, 17 - Makalesi
21, 2010 / Research Article
Kuduz teşhisi için ulusal laboratuvarlar arası ring test (floresan antikor
tekniği) - 2009
Hikmet ÜN, Selim TUNCER, Nil ÜNAL, Orhan AYLAN
Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Kuduz Teşhis Laboratuvarı, Ankara, Türkiye
Özet: Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Kuduz Teşhis Laboratuvarı, kuduz hastalığı açısından
ulusal referans laboratuvardır. Ulusal kuduz referans laboratuvarı tarafından her yıl düzenli olarak laboratuvarlar arası
ring test düzenlemektedir. Laboratuvarlar arası kuduz ring test örnekleri 2009 yılı içinde hazırlanmış, teşhis merkezlerine gönderilmiş ve detaylar/sonuçlar/değerlendirmeler burada açıklanmıştır. Kuduz teşhis kapasitesinin ortaya konulması açısından 2009 yılı Laboratuvarlar Arası Ulusal FAT Ring Test Programı başarılı olarak değerlendirilmiştir.
Anahtar sözcükler: Kuduz, teşhis, ring test.
National inter laboratory ring test (direct fluorescent antibody test) for rabies diagnosis - 2009
Summary: Etlik Central Veterinary Control and Research Institute, Rabies Diagnosis Laboratory is the national reference laboratory for rabies. Inter laboratory ring tests are organized regularly every year by national rabies reference
laboratory. Inter laboratory ring test for rabies in 2009 samples were prepared, were submitted to diagnostic centers and
details/results/evaluations are described here. To reveal the diagnostic capacity of National FAT Ring Inter Laboratory
Test Program in year 2009 was considered successful.
Key words: Diagnosis, rabies, ring trial.
Giriş
Ülkemizde kuduz hastalığının teşhisinden Tarım ve
Köyişleri Bakanlığı’na bağlı, Koruma ve Kontrol
Genel Müdürlüğü (KKGM) sorumludur. Ülke genelinde faaliyet gösteren 8 adet Veteriner Kontrol
ve Araştırma Enstitüsü, kuduz teşhis laboratuvarında, kuduz hastalığının teşhisi Dünya Sağlık Örgütü (WHO), Dünya Hayvan Sağlığı Organizasyonu
(OIE) ve Tarım ve Köyişleri Bakanlığı’nın direktiflerine göre yapılmaktadır.
Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma
Enstitüsü (EMVKAE), Kuduz Teşhis Laboratuvarı,
kuduz hastalığı açısından ulusal referans laboratuvardır. Kuduz teşhis çalışmaları KKGM tarafından
koordine edilmekte ve ulusal referans laboratuvarı
her yıl düzenli olarak laboratuvarlar arası ring test
düzenlemektedir. Laboratuvarlar arası kuduz ring
test (Kuduz FAT) örnekleri 2009 yılı içinde hazırlanmış, teşhis merkezlerine gönderilmiş ve detaylar/
sonuçlar/değerlendirmeler burada açıklanmıştır.
Önceki yıllardan farklı olarak bu yıl her laboratuvara birer adet numara verilmiştir (LAB01LAB08 arasında). Burada amaç, değerlendirme
açısından bir önyargı oluşmasını engellemek ve eşit
değerlendirmektir.
Materyal ve Metot
Test örnekleri: Test paneli 10 adet numaralandırılmış tüpten oluşmuştur.
Negatif materyal: Negatif materyal olarak 2009
yılı içerisinde Ankara ilinden EMVKAE’ye kuduz
şüphesi ile gönderilen ve hem direkt Floresan Antikor Tekniği (FAT) hem de deneme hayvanı inokulasyonu ile kuduz negatif tespit edilen koyun (Ovis
aries) izolatı seçilmiştir. Bu beyin dokusu homojenize edilmek sureti ile her teşhis merkezi için üçer
adet farklı numaralı tüplere dağıtılmış ve bu tüpler
negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Aynı zamanda
bu beyin dokusu pozitif materyalin dilüsyonu amacı
ile de kullanılmıştır.
Pozitif materyal: Pozitif materyal olarak 2009
yılı içerisinde Zonguldak ili, Çaycuma ilçesinden
EMVKAE’ye kuduz şüphesi ile gönderilen ve FAT
ile kuduz pozitif tespit edilen çakal (Canis aureus)
izolatı kullanılmıştır. Pozitif materyal homojenize
Yazışma adresi / Correspondance: Hikmet Ün, Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Kuduz Teşhis Laboratuvarı,
06020, Etlik, Ankara, Türkiye E-posta: [email protected]
18
Ün H, Tuncer S, Ünal N, Aylan O. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 17 - 21, 2010
edilerek, negatif koyun beyin homojenatı içerisinde log2 tabanlı dilue edilmiştir (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,
1/32, 1/64 ve 1/128). Dolayısı ile materyallerin kuvvetli pozitiften zayıf pozitif ve negatife doğru sıralanması amaçlanmıştır.
Kullanılan test yöntemi: Teşhis merkezlerinden,
ulusal ring test için gönderilen test panellerini,
WHO’nun önerdiği metotlardan olan ve sürekli olarak her yıl hizmet içi eğitim çalışması düzenlenen
FAT (1) ile test etmeleri istenilmiştir.
FAT test Prosedürü: Şüpheli hayvana ait beynin
cornu ammoni’sinden alınan ince bir parça doku
kurutma kağıdı üzerine konularak, işaretlendirilmiş
temiz bir lamın sağ ve sol tarafına çok ince iki tuşe
preparat yapılır.
jugat distile su ile üreticinin tavsiyesine göre stok
dilüsyon ve çalışma dilüsyonu olarak dilue edilir ve
testte kullanılır. Hazırlanan preparatların üzerlerine
konjugatın çalışma dilüsyonundan birer damla damlatılır. Preparatlar alt tarafına ıslak kurutma kağıdı
konularak rutubetlendirilmiş petri kutularında “U”
şeklindeki baget üzerine yerleştirilir. Petrinin kapağı kapatılarak 37°C’lik etüvde 30 dakika bırakılır.
Petri kutusu etüvden çıkarılır. Preparat petri kutusunun kapağına konulur üzerine yavaşça pH 7.4
olan PBS (Phosphate Buffered Saline)’den konulur
ve hemen boşaltılır. Tekrar üzerine PBS konulur ve
10 dakika bekletilir. Süre sonunda preparat bir defa
distile su ile yıkanır. Meyilli bir yere konarak suyunun süzülmesi beklenir.
Oda ısısında kurutulan preparat -20°C’de bulundurulan ağzı kapaklı lam kabı (Coplin jar) içindeki asetona konulur. Preparat asetonda 4 saat tutulur. Asetondan çıkarılan preparat kuruması için
oda ısısında 5-10 dakika bırakılır. Pozitif ve negatif
kontrol preparatları da aynı şekilde hazırlanır. Kon-
Preparatın sağ ve sol tarafındaki doku kısımlarına 1 damla gliserin/PBS (%90 gliserin + %10
PBS pH 7) damlatılır ve temiz birer lamelle üzerleri
kapatılır. Preparatlar floresan mikroskopta incelenir.
Pozitif ve negatif kontrol preparatlara göre sonuç
değerlendirilir (Şekil 1).
Kuduz pozitif
Kuduz negatif
Şekil 1. FAT test prosedürüne göre hazırlanmış kuduz müspet ve menfi birer preparatın floresan mikroskop altındaki görünümü.
Test panellerinin saklanması ve nakliyesi: Prosedür olarak Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Kuduz Teşhis Laboratuvarında teşhis
aşamasından sonra saklanılması düşünülen beyin
dokuları, -80°C’de muhafaza edilmektedir. Bu çalışmada da kullanılan beyin dokuları test panelleri,
hazırlanıncaya ve hazırlandıktan sonra gönderilinceye kadar -80°C’de muhafaza edilmişlerdir. Nakliye için strafor kutular seçilmiş ve -80°C’den çıkartılan paneller buz aküleri ile desteklenerek sızdır-
maz paketleme yapılmak sureti ile kargo ile teşhis
merkezlerine gönderilmiştir. Test panellerine kod
numarası verilerek, laboratuvarlara gönderilmesinde esas alınan numaralandırma sistemi Tablo 1’de
gösterilmiştir.
Kontrol testleri: Hazırlanan 10 tüpten oluşan test
paneli (üç adet negatif ve yedi adet pozitif beyin
dokusu dilüsyonu) teşhis merkezlerine gönderilmeden önce FAT testi (1) ile EMVKAE, Kuduz Teşhis
Laboratuvarında kontrol edilmiştir. FAT ile negatif
kontroller (3 adet) kuduz negatif olarak değerlendirilmiştir. Pozitif beyin dokusunun log2 tabanlı
dilüsyonu ile hazırlanan 7 adet dilüe materyalden
1/2, 1/4, 1/8, 1/16 dilüsyonlarına karşılık gelen
tüpler FAT ile kuduz pozitif değerlendirilmiş olup
19
1/32, 1/64 ve 1/128 dilüsyonlar ise negatif olarak
değerlendirilmiştir. Bu şekilde FAT açısından kayıt
altına alınan test panelleri 8 teşhis merkezine gönderilmiştir. Sonuçların değerlendirilmesi açısından
bu kayıtlar esas alınmıştır (Tablo 2).
Tablo 1. Laboratuvarlar arası ulusal FAT ring test materyal gönderim şeması - 2009.
Laboratuvar
Kodu
Tüp numarası
01/09
02/09
03/09
04/09
05/09
06/09
07/09
08/09
09/09
10/09
LAB01
nk
1:4
1:16
1:32
nk
1:64
1:128
nk
1:8
1:2
LAB02
1:2
nk
1:4
1:32
1:128
nk
1:64
1:16
nk
1:8
LAB03
1:32
1:2
nk
1:4
1:64
1:16
nk
1:128
1:8
nk
LAB04
nk
1:32
1:2
nk
1:4
1:128
1:8
nk
1:16
1:64
LAB05
1:32
1:64
1:8
1:2
nk
nk
nk
1:4
1:16
1:128
LAB06
1:16
1:128
nk
1:8
1:2
1:4
1:64
nk
nk
1:32
LAB07
1:16
nk
1:32
nk
1:8
nk
1:2
1:4
1:64
1:128
LAB08
nk
nk
nk
1:16
1:64
1:2
1:4
1:128
1:32
1:8
Tablo 2. EMVKAE’de FAT ile yapılan kontrol testi sonuçları.
Kullanılan
Test
FAT
Pozitif beyin dokusunun log2 tabanlı dilüsyonu
Negatif beyin dokusu
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
nk
nk
nk
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
Programa katılan teşhis merkezleri: Programa
Adana Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü,
Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü,
Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü,
Erzurum Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma
Enstitüsü, Konya Veteriner Kontrol ve Araştırma
Enstitüsü, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma
Enstitüsü, Samsun Veteriner Kontrol ve Araştırma
Enstitüsü katılmıştır.
Bulgular
Tablo 3’de test panellerine ilişkin olarak teşhis merkezlerinden bildirilen sonuçlar ve Tablo 4’te 2008,
2009 yılı sonuçlarının karşılaştırması verilmiştir.
20
Tablo 3. 2009 yılı laboratuvarlar arası ulusal FAT ring test sonuçları
Laboratuvar
Kodu
Pozitif beyin dokusunun log2 tabanlı dilüsyonu ve negatif beyin dokusu.
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
nk
nk
nk
LAB01
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
LAB02
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
LAB03
+
+
-
-
+
-
-
-
-
-
LAB04
+
+
+
-
-
+
-
-
-
-
LAB05
-
+
+
+
+
-
+
-
-
-
LAB06
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
LAB07
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
LAB08
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
Tablo 4. Laboratuvarlar arası ulusal FAT ring test 2008 ve 2009 sonuçlarının karşılaştırması.
FAT 2008
FAT 2009
Laboratuvar sayısı
8
8
Negatif kontroller sonucu
%100 (64/64)
%100 (24/24)
Pozitif kontroller sonucu
%100 (16/16)
%81.25 (26/32)
Ulusal referans laboratuvar FAT sonucuna göre
FAT ile negatif olması beklenenler (Tablo 2’ye göre)
-
%83.33 (20/24)
Test panellerinin bu şekilde hazırlanması ile teşhis
açısından hassas bir değerlendirme yapılabilmesi
amaçlanmıştır. Hastalığın, Türkiye açısından önemli olması ve son yıllarda bölgeler bazında artma/yayılma eğilimi göstermesi nedeni ile teşhis merkezlerinin FAT’nin kullanımı açısından sürekli ve her an
teşhise hazır halde bulunmasına, bu ring testin katkı
sağlayacağı kanaatine varılmıştır.
Önceki yıllarda hazırlanan ring test panellerinde hazırlanan pozitif ve negatif örneklerde beyin
dokuları direkt olarak kullanılmıştır. Hazırlanan test
panelinde ise negatif materyal yine önceki yıllarda
olduğu gibi dilüe edilmeden homojenize edilerek
hazırlanan beyin dokusundan oluşturulmuştur. Pozitif materyal ise öncelikle homojenize edilip ve yine
homojenize edilen negatif beyin dokusu içerisinde
log2 tabanlı seri dilüsyonu yapılmıştır. Burada Dr.
Thomas Müller (National and OIE Reference Laboratory for Rabies, WHO Collaborating Centre for
Rabies Surveillance and Research, Institute for Epidemiology, Friedrich-Loeffler-Institute, Seestr. 55,
16868, Wusterhausen, Germany��
) tarafından Almanya için hazırlanan 2002 ve 2006 Alman Ulusal Ring
Test Programı esas alınmıştır (2, 3). Burada amaç,
materyallerin kuvvetli pozitiften zayıf pozitif ve negatife doğru sıralanması ile test merkezlerinin elde
edeceği sonuçlar açısından yüksek oranda sensitivite ve spesifite yakalanmasıdır. Tablo 2’de bildirilen
sonuçlar sensitivite ve spesifite hesaplanmasında
esas alınmıştır. Sensitivite %81.25 ([laboratuvarlar tarafından bildirilen doğru pozitif örnek sayısı/
toplam pozitif örnek sayısı (doğru pozitif+yanlış
negatif)]×100) ve spesifite %86.25 ([laboratuvarlar tarafından bildirilen doğru negatif örnek sayısı/toplam pozitif sayısı (doğru negatif+yanlış
pozitif)]×100) olarak hesaplanmıştır (4).
Tablo 2’de belirtilen kontrol testi sonuçları ile
teşhis merkezlerinin sonuçları kıyaslandığında, tüm
merkezlerin negatif kontrol örneklerini %100 doğrulukla tespit ettikleri görülmüştür (Tablo 3 ve 4).
Bu örnekler açısından yanlış pozitif sonuç tespit
edilmemiş olması fevkalade başarılıdır. Karşılaştırmak açısından bakılırsa, 2008 ve 2009 yılı sonuçları negatif kontroller açısından aynı olmakla birlikte
pozitif kontrollerde küçük bir düşme gözlenmiştir
(Tablo 4).
Pozitif beyin dokusunun log2 tabanlı dilüsyonu ile hazırlanan örnekleri; dört merkezin (LAB01,
LAB02, LAB06 ve LAB08) FAT sonucunun, Tablo
2’de belirtilen sonuçlara göre tam uyumlu olduğu
görülmüştür. LAB03 1/2, 1/4 ve 1/32 dilüsyonlarında, LAB04 1/2, 1/4, 1/8 ve 1/64 dilüsyonlarında,
LAB05 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 ve 1/128 dilüsyonlarında, LAB07 1/2 ve 1/8 pozitiflik tespit etmiş oldukları saptanmıştır.
Yanlış negatif sonuç 1/2 ve 1/4 dilüsyon basamaklarında LAB05 ve LAB07 tarafından tespit
edilmiştir. Sensitivite ve spesifite açısından düşünüldüğünde olmaması gereken bu durum referans
laboratuvarda hazırlık aşamasında, insan kaynaklı
teknik bir hata yapılmış olunabileceği şeklinde değerlendirilmiştir. Yine 1/32, 1/64 ve 1/128 dilüsyonlarında tespit edilen pozitiflikler konusunda referans
laboratuvar tarafından bunlarla ilgili başka bir test
yapmadığı için yorum yapmakta zorluk çekilmiştir.
Kargo ile gönderimi takiben referans laboratuvar
tarafından materyallerin saklama koşulları ile ilgili
bir uyarı yapılmamış olması dolayısıyla bu materyallerin teşhis merkezleri tarafından alınmalarını
takiben +4°C’de muhafaza edilme olasılığını ortaya
çıkarmıştır. Bu tür bir muhafaza ortamının sağlanmış olması, zaten dilüe edilmiş olan pozitif materyalden FAT ile teşhis zafiyetine yol açmıştır. Sonraki uygulamalarımızda bu hususun dikkate alınması
gerekliliği ortaya konulmuştur.
Ayrıca test panelleri ile birlikte tüm teşhis
merkezlerine bir sorgulama formu gönderilmiştir.
Sorgulama formları teşhis laboratuvarlarınca doldurularak referans laboratuvara iletilmiştir. Formlar
21
incelendiğinde, kuduz hastalığının teşhisi açısından
teşhis laboratuvarlarında bir eksikliğin olmadığı görülmüştür. İlk olarak 1999 yılında yapılan ve her yıl
tekrarlanan “Kuduz Hastalığının Teşhisinde Metot
Birliğinin Sağlanması” konulu hizmet içi eğitim
programı ile tüm teşhis merkezlerinin hemen hemen aynı FAT test protokollerini uyguladığı ortaya
konulmuştur. Bununla beraber ortak bir standart test
prosedürünün (SOP) izlenmesi faydalı olacaktır. Bu
açıdan FAT, SOP referans laboratuvar tarafından
güncellenerek bürokratik işlemlerin tamamlanmasını takiben dağıtımı yapılacaktır.
Sonuçta teşhis kapasitesinin ortaya konulması açısından 2009 Yılı Laboratuvarlar Arası Ulusal
FAT Ring Test Programı başarılı olarak değerlendirilmiştir. Alınan sonuçlara göre daha iyi bir hazırlıkla 2010 yılı için de benzer bir programın uygulanmasında fayda sağlanacağı düşünülmektedir.
Teşekkür
Referans laboratuvar, katılan tüm teşhis merkezlerine ve katkılarından ötürü Dr. Thomas Müller’e
teşekkür eder.
Kaynaklar
1. Dean DJ, Abelseth MK, Athanasiu P, (1996), The fluorescence antibody test. In Meslin FX, Kaplan MM, Koprowski
H. (eds.) Laboratory techniques in rabies, 4th edition, World
Health Organization, Geneva, Switzerland, p. 88-93.
2. Müller T, (2002), Nationaler ringversuch zur tollwutdiagnostik 2002 and 2006. National and OIE Referens Laboratory for Rabies, WHO Collaborating Centre for Rabies
Surveillance and Research, Institute for Epidemiology,
Friedrich-Loeffler-Institute, Seestr. 55, 16868, Wusterhausen, Germany.
3. Müller T, (2006), Nationaler ringversuch zur tollwutdiagnostik 2002 and 2006. National and OIE Referens Laboratory for Rabies, WHO Collaborating Centre for Rabies
Surveillance and Research, Institute for Epidemiology,
Friedrich-Loeffler-Institute, Seestr. 55, 16868, Wusterhausen, Germany.
4. Robardet E, Cliquet, F, (2010), Interlaboratory trial 2009:
FAT repor., Community reference Laboratory for Rabies,
Laboratory for Studies and Research on Rabies and Wildlife Disease, AFSSA, Malzeville, France.
22
Etlik Vet
Mikrobiyol
Derg, E,
21,Güngör
23 - 29,AB,
2010
AraştırmaDerg,
Makalesi
23
Kabaklı
Ö, Çalışkan
Yöndem S, Demirhan İ. Etlik Vet Mikrobiyol
21, 23/ Research
- 29, 2010Article
Vero hücrelerinde ısıya dayanıklı sığır vebası aşı üretimi*
Özden KABAKLI1, Elvin ÇALIŞKAN1, A. Burak GÜNGÖR1, Süreyya YÖNDEM1,
İlkay DEMİRHAN2
Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Viral Aşı Üretim Laboratuvarı; 2Lalahan Hayvancılık Merkez
Araştırma Enstitüsü, Ankara, Türkiye
1
Özet: Vero hücrelerinde üretilen bir sığır vebası aşısının termostabilitesi %5 laktalbumin hidrolizat ve %10 sukrozdan
oluşan stabilizatör ve 74 saat süren liyofilizasyon protokolu ile gerçekleştirildi. Stabilizatör ve liyofilizasyon protokolu
+37ºC, +42ºC, +45ºC ve +56ºC’deki hızlandırılmış stabilite testi ile test edildi ve bu verilerden Arhenius eğrisi yapıldı.
Bu metotla üretilen liyofilize sığır vebası aşısı minimum gerekli infektif titre olan 10-2.5 DKID50 /ml titreyi +37ºC’de
30 günden fazla sürdürmüştür. Aşının aktivitesi sığırlarda antikor titresi ile test edildi. Sulandırılmış aşının stabilitesi
üç farklı dilüent ile test edildi. Sonuç olarak aşı virusunun 1 molar magnezyum sülfat solüsyonu ve normal fizyolojik
tuzlu su ile sulandırıldığında, +37°C gibi yüksek ısıya sahip bir ortamda 4 saatten daha fazla infektif titresini koruduğu
belirlendi.
Anahtar sözcükler: Canlı aşı, ısıya dayanıklı, sığır vebası, stabilite, vero hücre.
Production of a thermostable vero-cell adapted rinderpest vaccine
Summary: The thermo stability of a rinderpest vaccine produced on vero cells were evaluated using 5% lactalbumin hydrolysate–10% sucrose as a stabilizer and a lyophilization protocol that is takes 74 hours. The stabilizer and lyophilization schedules were examined using accelerated stability testing at +37ºC, +42ºC,+45ºC and +56ºC, and an Arrhenius
plot was based on from these data. A lyophilized rinderpest vaccine was maintained the minimum required dose of 10-2.5
TCID50 /ml more than 30 days at +37ºC. The biological activity of the vaccine by measured with antibody titration in
cattle. The stability of the reconstituted vaccine was examined using three different diluent preparations. Finally, the
infectivity of vaccine was stable even at high temperatures up to 4 h after reconstitution with magnesium sulphate molar
solution or normal physiological saline.
Key words: Live vaccine, rinderpest, stability, thermostability, vero cells.
Giriş
Günümüzde kullanılan sığır vebası aşılarının çoğu
Plowright tarafından primer dana böbrek (PDB)
hücre kültürlerinde 92. pasajda attenue edilen Rinderpest Bovine Kabate O (RBOK) suşundan orjin
alır (14). Ülkemizde de 1999 yılına kadar, primer
buzağı böbrek hücre kültürlerinde attenüe RBOK
suşundan üretilen canlı liyofilize sığır vebası aşısı kullanılmıştır (7, 20). Bu suş ile primer buzağı
böbrek hücre kültürlerinde üretilen aşının tek ve
önemli dezavantajı ısıya karşı hassasiyetidir (22).
Günümüze kadar RP aşı üretimi konusunda, aşının
ısıya dayanıklılığı açısından pek çok çalışma yapılmıştır. Bunların bir kısmında farklı stabilizatörler
ve farklı liyofilizasyon metotları denenirken (5, 13,
23) bir kısmında ise ısıya dayanıklı mutant suşlar
elde ederek termostabil aşı üretme yoluna gidilmiş-
tir (17). Mariner ve ark. (11) tarafından laktobionik
asit, hidrolize jelatin ve sorbitol (LGS), laktoalbumin hidrolizat ve sukroz (LS) ile hidrolize jelatin
(BUGS)’den oluşan 3 farklı stabilizatör denenerek
yapılan çalışmada %10 sukroz ve %5 laktalbumin
hidrolizat’ın termostabiliteyi sağlayan en iyi stabilizatör olduğu bildirilmiştir. OIE standartlarında da
(2) RP aşı üretiminde %10 sukroz ve %5 laktalbumin hidrolizat önerilmektedir. Bunların yanı sıra RP
aşılarında termostabiliteyi etkileyen diğer bir etken
olarak liyofilizasyon ısıları ve süreleri üzerinde de
çalışmalar yapılmıştır. Bu amaçla Mariner ve ark.
(12) tarafından liyofilizasyon süresinde değişiklik
yapılarak, vero hücrelerinde ısıya dayanıklı RP aşı
üretimi gerçekleştirilmiştir.
Termostabil sığır vebası aşısı soğuk zincire
gerek kalmaksızın sahada 30 güne kadar kullanılmaktadır (10). Liyofilize aşıların sahada kullanımı
Yazışma adresi / Correspondance: Özden Kabaklı, Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü
Viral Aşı Üretim Laboratuvarı, 06020, Etlik, Ankara, Türkiye E-posta: [email protected]
*Bu araştırma TKB EMVKAE ve TAGEM/HS/14/01/07/127 no’lu proje ile desteklenmiştir.
24
Kabaklı Ö, Çalışkan E, Güngör AB, Yöndem S, Demirhan İ. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 23 - 29, 2010
sırasında, sulandırma amaçlı kullanılan 1M MgSO4,
%0.85 NaCl ve distile su gibi diluentlerde termostabilite açısından pek çok araştırıcı tarafından denenmiş olup bunlar içinde1M MgSO4, %0.85 NaCl en
uygun diluent olarak bulunmuştur (3, 20). Aşılardaki
stabilite çalışmalarında, aşının yarılanma zamanını
ve raf ömrünü belirlemede Arrhenius eğrisi ve degredasyon oranı belirleyebilen istatistik programları
kullanılmıştır (1, 4, 6). Termostabilite çalışmaları
için ise aşılar farklı ısılarda tutularak test edilmiştir
(15, 18, 19).
Bu çalışmanın amacı Türkiye’de ilk kez ısıya
dayanıklı sığır vebası aşısı üretmektir. Aşıda vero
hücre hattının kullanım amacı, aşı virusunun üretilmesi sırasında primer hücrelerden kaynaklanabilecek teknik zorlukları ortadan kaldırmaktır. Aynı zamanda ısıya dayanıklı sığır vebası aşısı üretimi ile
aşısının raf ömrü uzayacak ve sahada soğuk zincir
şartlarına uyma gerekliliği olmadan rahatlıkla kullanılabilecektir. Bu çalışma, diğer liyofilize aşıların
da benzer yöntemlerle ısıya dayanıklı olarak üretilebilmesi için bir basamak oluşturacaktır.
Materyal ve Metot
Virus: Primer dana böbrek (PDB) hücre kültüründe 95’inci pasajdaki sığır vebası Kabate O suşu
(KABATE O RP-Pirbright V19/13/92 BK 95) vero
hücre kültürlerinde 3 pasaj gidildi. 98’inci pasajda
vero hücrelerine adapte ana tohum virus stokları
(MS-TRPV BK95 VERO3) oluşturuldu. Stoklar
OIE’de (2) belirtilen kalite kontrol testlerine göre
test edildi ve değerlendirdi. Benzer şekilde üretimi
yapılan 3 seri deneme üretimi TRPV 1/08, TRPV
2/08, TRPV 3/08 olarak kodlanarak kalite kontrol
testleri tamamlandı. Vero hücrelerinde üretimi yapılıp steril bulunan ve titresi Spaermen-Kaerber metoduna göre belirlenen bulk virusa 1/1 oranında %5
laktalbumin hidrolizat ve %10 sukroz (pH 7.2) ihtiva eden stabilizatör ilave edildi, 1 ml’lik aşı şişelerine taksim edilerek; 74 saat süren ve vakumun 100
mTorr olarak sabitlendiği, Mariner ve ark. (12)’nın
uyguladığı liyofilizasyon protokolu ile liyofilize
edildi. Liyofilizasyon sonrası kalite kontrol testleri yapılarak -20°C’de muhafaza edildi. Daha sonra
farklı ısılarda tutulan (+4°C, +37°C, +42°C, +45°C,
+56°C) liyofilize aşıda ve farklı sulandırma sıvıları
(1M MgSO4, %0.85 NaCl–fizyolojik tuzlu su, distile su) ile sulandırılmış aşıda +37°C’deki stabilite
testleri yapıldı.
Liyofilize formundaki aşının hızlandırılmış stabilite testi ve hesaplanması: -20°C’de muhafaza
edilen liyofilize aşı viruslarından 100’er şişe örnek
alınarak (+4°C, +37°C, +42°C, +45°C, +56°C) gibi
farklı ısılarda tutuldu, bu gruplardan bir kısmı liyofilizasyonun ardından +37°C (±0.5°C) inkübatöre
konuldu, ardından 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28,
35, 42, 56, 70, 84, 106, 122, 140, 202’nci günlerde
2 şişe örnek alınarak -20°C’de titreleri test edilinceye kadar saklandı. Diğer örnekler +42°C, +45°C,
+56°C ayarlanan su banyosuna konuldu ve takiben;
+42°C’deki şişeler 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 29,
35, 43, 49’uncu günlerde, +45°C’deki şişeler 0, 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 29, 35, 43, 49’uncu günlerde, +56°C’deki şişelerden 0, 2, 4, 7’nci saatlerde
ve 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 29, 35, 43, 49’uncu
günlerde 2 şişe örnek alınarak -20°C’de titreleri test
edilinceye kadar saklandı. +4°C, -20°C’de ve oda
şartlarında saklanan aşılarda yapılan test sonucu 19
ay sonunda +4°C ve -20°C’de infektif titrede hiç
düşme olmadığı tespit edildi. Aşının yarılanma ve
raf ömrünün belirlenmesi amacıyla Mariner ve ark.
(11)’nın bildirdiği şekilde azalma eğrisi ve Arrhenius eğrisi kullanıldı. Kabul edilebilir minimum titre 100 doz için 10-4.5 TCID50 /ml ve tek doz için 102.5
TCID50 /ml kabul edildi. Bu yöntemle dört farklı
ısıda azalma değeri ile seçilen düşük ısılardaki düzeltilmiş “k” değeri, yarılanma ömrü ve tahmini “k”
değeri belirlendi.
Sulandırılmış aşının stabilite testi: 1 şişe (100 doz)
liyofilize aşı +37°C (±5°C)’deki su banyosu içinde
daha önce ısıtılmış 100 ml’lik, 1M MgSO4, %0.85
NaCl–fizyolojik tuzlu su ve distile su bulunan koyu
renkli sulandırma şişeleri içinde ışık görmeyecek
şekilde sulandırıldıktan sonra, tekrar +37°C’deki su
banyosu içinde inkube edildi, inkube edilen örneklerden distile su için 30 dakika aralarla 8 saat süre
ile 1M MgSO4, %0.85 NaCl için 2 saat aralıklarla
8 saate kadar örnekler alınarak hemen buz içinde
soğutulup test edilinceye kadar +2/+8°C’de buzdolabında bekletildi. Bu süre sonunda örneklerin
hepsinde titrasyon testi yapıldı. Dilusyonlara bağlı
infektivite kaybı +37°C (±5°C)’deki sulandırılmış
aşıların titre ortalamalarına dilusyon faktörü ilave
edilerek (1.7 log10 TCID50 ) +4°C’de 1 ml distile su
içinde dilue edilen aşılar arasındaki titre farkı olarak
hesaplandı.
Bulgular
MS-TRPV BK95 VERO3 olarak kodlanan ana tohum suş ve TRPV 1/08, TRPV 2/08, TRPV 3/08
olarak kodlanan 3 seri deneme üretimi yapıldı. Ana
tohum suşun infektif titresi log106.5 DKID50 /ml,
TRPV 1/08, TRPV 3/08 serilerinin infektif titresi
log106.0 DKID50/ml ve TRPV 2/08 seri no’lu aşının
infektif titresi log106.2 DKID50 /ml olarak bulundu.
Ana tohum suş ve üç seri aşının sterilite, identifikasyon, güvenlik ve etkinlik testleri standartlara uygun
bulundu.
Liyofilize formundaki aşının stabilite testi: Liyofilize aşının stabilite değerlendirmesinde +4°C ve
-20°C’de saklanan aşılarda, 19 ayın sonunda infektif titrede hiç düşme olmadığı tespit edildi. 37°C,
42°C, 45°C ve 56°C’de saklanan aşılardan belirli
periyotlarla alınan örneklerin infektif titre değerleri
ile yapılan regresyon analizleri ise Şekil 1’de gösterilmiştir.
Regresyon analizi, 7’nci güne kadar infektif
titrede hızlı bir düşüş olduğundan, 37°C, 42°C ve
Sulandırılmış aşının stabilite testi: Farklı sulandırma sıvıları ile sulandırılmış aşıların 37°C’de bekletildiğinde infektif titrelerindeki düşme değerleri
(canlılık eğrisi) Tablo 2 ve Şekil 3’de log10 bazında gösterilmiş olup, yarılanma ömrü olarak 0’ıncı
saatteki infektif titresinin yarılandığı zaman baz
alınmıştır. Magnezyum sülfat ve fizyolojik tuzlu su
arasında önemli bir fark bulunmazken distile suda
değerler düşük bulunmuştur.
6
5
5
4
4
y = -0,0227x + 5,5044
R2 = 0,7714
3
2
45C deki degradation e÷risi
6
titre log 10
Titre log 10
45°C’de 7’nci günden sonraki değerler üzerinden
yapılırken, 56°C’de 1’inci günden itibaren hesaplandı. Regresyon değerleri baz alınarak yapılan hesaplamalarda düzeltilmiş raf ömrü 37°C’de 40 gün,
42°C’de 19gün ve 45°C’de 8.5 gün olarak bulundu.
Aşının yarılanma ömrü ise 37°C’de 12 gün, 42°C’de
6.5 gün ve 45°C’de 5.3 gün olarak bulundu. Farklı
dört ısı derecesi ile elde edilen değerler Tablo 1 ve
Şekil 2’de özetlenmiştir. Yapılan Arrhenius eğrisi
sonucu R2=0.99 ve K=4.7 ile iyi bir linearite göstermiş olup, +4°C’deki yarılanma ömrü 21 yıl olarak
bulunmuştur.
37oC degredation e÷risi
7
3
2
1
y = -0,0601x + 4,98
2
R = 0,9633
1
0
0
20
40
60
zaman (gün)
25
0
80
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
zaman (gün)
B
A
56 C deki degradation e÷risi
42C deki degradation e÷risi
6
6
5
5
4
titre log10
titre log 10
4
3
y = -0,0434x + 5,37
2
R = 0,9035
2
1
3
2
y = -0,262x + 4,26
R2 = 0,7887
1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
0
0
zaman (gün)
C
1
2
3
4
5
zaman
(gün)
6
7
8
D
Şekil 1. Liyofilize TRPV aşısının A. 37°C, B. 45°C, C. 42°C ve D. 56°C’deki azalma eğrileri.
9
10
11
12
13
14
15
26
Tablo 1. Arrhenius eğrisi kullanılarak hesaplanan aşının stabilite değerlerinin özeti.
Isı (°C)
n1
Deneysel k2, 3
Raf ömrü4
Hesaplanmış k5
Yarı ömür6
4
-
-
-
0.000039
21 yıl
10
-
-
-
0.000092
9 yıl
25
-
-
-
0.0061
49 gün
37
10
0.0227
40.1 gün
0.0247
12 gün
42
6
0.0434
19 gün
0.0461
6.5 gün
45
8
0.06
8.5 gün
0.0568
5.3 gün
56
7
0.26
2.1 gün
0.199
1.5 gün
Örnek sayısı; 2k=gözlemlere dayanan verilerle hesaplanmış degradasyon sabiti; 3370C, 420C, 450C azalma eğrisi için linear regresyon 7’nci günden
başlamaktadır, 560C için analiz 1’inci günden başlamaktadır; 4Düzeltilmiş raf ömrü, 104.5 DKID50 /ml 100 doz minimum gerekli titre kabul edilerek
düzenlenen azalma eğrisinin regresyon çizgisinden hesaplanmıştır; 5Düzeltilmiş k değerleri Arrhenius eğrisi linear regresyon analizinden elde edilmiştir; 6Yarılanma ömrü düzeltilmiş k değerinden hesaplanmıştır; ** p<0.01 *** p<0.001.
1
Arhenius plot
0
-1
log (k)
-2
-3
y = -4,7461x + 13,728
2
R = 0,9943
-4
-5
-6
3
3,1
3,2
3,3
3,4
3,5
3,6
3,7
(1/(t+273) * 1000)
Şekil 2. Dört ısı derecesindeki (56°C, 45°C, 42°C, 37°C) azalma sabit değerleri temel alınarak düzenlenen Arhenius
eğrisi grafiği.
Tablo. 2. Farklı sulandırma sıvıları ile sulandırılmış aşının 370C’de stabilite testi.
MgSO4
(Log10 DKID50 /ml)
NaCl
(Log10 DKID50 /ml)
Distile su
(Log10 DKID50 /ml)
1 ml içinde sulandırılmış
aşının titresi
6.0
6.0
6.0
100 ml aşıda ilk titre kaybı
0.54
0.70
1.09
0.5
3.9
3.9
3.7
1
3.9
3.7
3.7
1.5
3.9
3.7
3.5
2
3.7
3.7
3.5
2.5
3.7
3.7
3.5
3
3.6
3.6
3.4
3.5
3.5
3.5
3.4
4
3.5
3.5
3.1
Süre (h)
titre
4,5
4,4
4,3
4,2
4,1
4
3,9
3,8
3,7
3,6
3,5
3,4
3,3
3,2
3,1
3
y = -0,1329x + 4,01
27
1M MgSO4
% 0,85
NaCl
Distile su
Do÷rusal
y = -0,0969x + 3,88
y = -0,1406x + 3,79
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
saat
Şekil 3. Farklı sulandırma sıvıları ile sulandırılmış aşının 37°C’deki azalma eğrileri.
Bu araştırmada, primer dana böbrek (PDB) hücre
kültüründe 95’inci pasajdaki sığır vebası Kabate O
suşu (KABATE O RP-Pirbright V19/13/92 BK 95)
vero hücre kültürlerinde 3 pasaj gidilerek 98’inci
pasajda vero hücrelerine adapte ana tohum virus
stokları oluşturuldu. Vero hücrelerine adapte sığır
vebası virusunun titresi OIE normlarına göre değerlendirildi. Vero hücrelerine adapte termostabil
RP aşısı üretimi konusunda yapılan çalışmada da
Mariner ve ark. (12) primer dana böbrek hücre kültüründeki RP virusu, vero hücrelerinde 3 seri pasaj
sonrası adaptasyonunu sağlamışlar ve vero hücrelerine adapte sığır vebası virusunun titresini OIE
normlarına göre değerlendirmişlerdir.
RP aşısının deneme üretimini yaptığımız bu
çalışmada stabilizatör olarak %5 laktalbumin hidrolizat ve %10 sukroz kullanıldı. Benzer amaçlı yapılan pek çok araştırmada, raf ömrünü uzatmak ve
termostabiliteyi sağlamak amacıyla Morbillivirus
grubu etkenlere karşı geliştirilen attenue liyofilize
viral aşılarda farklı stabilizatörler denenmiş ve bu
çalışmalar sonunda, %5 laktalbumin hidrolizat ve
%10 sukroz uygun bulunarak önerilen stabilizatör-
ler arasında yer almıştır (8). Plowright ve ark. (15)
LS ile stabilize edilmiş RP aşısında 37°C’de günlük
0.0139 log10 kayıp ile farklı 5 eğri değerinde başarılı
bulmuştur. Mariner ve ark. (11) LS, (1:1, 3:1, 4:1)
BUGS ve LGS gibi farklı stabilizatörlerle termostabil RP aşısı üretimini denemiş ve araştırma sonucunda iyi bir linearite gösteren LS stabilizatörü ile 33
güne kadar yüksek titre elde edildiğini bulmuşlardır.
Termostabiliteyi sağlamak amacıyla bu çalışmamızın ana metodu olan liyofilizasyon aşamasında Mariner (12)’in önerdiği şekilde 100 milliTorr vakum
altında, ana kuruma safhası 30°C’de 16 saat süren
ve final raf ısısı 35°C olan 74 saat süren liyofilizasyon metodu kullanılmıştır. Liyofilizasyon sonunda
aşı şişelerindeki %100 vakum, %2.5 nem oranı ve
homojen krem renkteki aşı peleti görünümü ve liyofilizasyon öncesi infektif titre ile liyofilizasyon
sonrası infektif titre arasındaki titre kaybının ortalama 0.18 olması liyofilizasyonun başarılı olduğunu
göstermektedir. Mariner ve ark.(12) LS stabilizatör
ile farklı liyofilizasyon metotlarını denemişler ve
araştırmamız için örnek aldığımız liyofilizasyon
metodunu başarılı bulmuşlardır. Sarkar ve ark. (18)
PPR aşısında termostabilite için yaptıkları çalışmada geleneksel liyofilizasyon metotlarının yerine
28
Mariner (12)’in önerdiği ve OIE (2), standartlarında
termostabil aşı üretimi için önerilen 74 saat süren
liyofilizasyon metodu ile daha iyi sonuç elde edebileceklerini bildirmişlerdir. Geçmişten günümüze
kadar yapılan aşılardaki termal inaktivasyon ve stabilite çalışmalarında araştırıcılar hızlandırılmış stabilite test ve raf ömrü belirlenmesi içinde Arrhenius
eğrisini kullanmışlardır (4). Allison ve ark. (1)’da
kızamık virusu aşısının stabilite değerlerini hesaplamada Arrhenius eğrisini kullanmıştır. Aynı şekilde
Mariner ve ark. (11) RP aşısının stabilite değerlerini
Arrhenius eğrisi ile belirlemişlerdir. Bu çalışmada
da hızlandırılmış stabilite test ve raf ömrü belirlenmesi için Arrhenius eğrisi kullanıldı. Deneme aşımızın yarılanma ömrünü belirlemek için daha önce
Mariner ve ark. (9, 11)’nın belirttiği şekilde ve OIE
(2), standartlarına göre aşının orijinal titresinin yarıya düştüğü zaman temel alındı. Yaptığımız stabilite
testi sonucu elde ettiğimiz değerler diğer araştırmacıların bulduğu değerlerle paralellik göstermektedir
(11). Raf ömrü farklı ısılarda yapılan stabilite testi
37°C’de 40 gün,42°C’de 19 gün ve 45°C’de 8.5 gün
olarak bulundu. Elde edilen bulgular uyguladığımız
liyofilizasyon metodu ve kullandığımız stabilizatörün aşının infektivite gücünü yüksek ısılarda dahi
uzun süre korumasını sağladığını göstermektedir.
Bu yöntemle üretilen sığır vebası aşısı araştırmamızın hedefi olan saha şartlarında soğuk zincire gerek
duyulmadan raf ömrü 30 günden fazla (37°C’de 40
gün) olmaktadır. Arhenius eğrisi sonucu +4°C ve
-20°C aşımızın raf ömrünün 20 yıldan çok olduğu
belirlenmiş olup, acil stok olarak saklama durumunda uzun yıllar infektivite gücünü koruyacağını göstermektedir. Uyguladığımız bu yöntemle RP aşısı
üretildikten sonra stok yenilenme işlemini ortadan
kaldıracağı için ülke ekonomisine katkı sağlayacaktır. Mariner ve ark. (10) aynı metotla ürettikleri
termostabil sığır vebası aşısını soğuk zincire gerek
duymadan 30 gün boyunca Nijerya’daki sığırlar
üzerinde 1988 yılındaki aşılama kampanyasında
saha şartlarında denemiş ve başarılı sonuç (%98
seropozitif) almıştır. Çalışmamızdaki metotla üretilen aşıda raf ömrü, 37°C’de ve karanlık ortamda
30 günden fazla bulundu. Türkiye şartlarında sıcak
mevsimlerde ortalama hava sıcaklığı 37°C olup
bazı bölgelerde 40°C’nin üzerine çıkmaktadır. Bu
şartlarda aşırı yüksek sıcaklarda ve güneş ışığından
korunduğu durumlarda ayrıca ilk 7 günde infektif
titredeki hızlı düşüş göz önüne alınarak bu amaçla üretilen aşılarda başlangıç titresinin en az 106.5
DKID50 /ml 100 doz olması durumunda aşımızın raf
ömrü saha şartlarında soğuk zincire gerek kalmaksızın 1 ay olacaktır.
Değişik dilüentlerle yapılan stabilite çalışması sonucu 1M MgSO4, %0.85 NaCl uygun dilüent
olarak tespit edilmiş olup bu bulgular diğer araştırmacıların bulgularıyla benzerlik göstermektedir
(11, 15). Sarkar ve ark. (18) LS stabilizatör ile hazırlanmış PPR aşısının 37°C’de karanlıkta bekletilmiş 1M MgSO4 ve %0.85 NaCl içinde sulandırılması sonucunda 8 saate kadar önemli bir titre kaybı
olmadığını bildirmişlerdir. Diğer araştırmacıların
önerileri ve bizim araştırmamızdan elde ettiğimiz
sonuçlara göre 1M MgSO4 ve %0.85 NaCl’nin her
ikisi de dilüent olarak uygun bulunmuş olup, vero
hücrelerine adapte termostabil sığır vebası aşısı için
dilüent olarak %0.85 NaCl seçilmiştir.
Araştırmamız sonunda elde edilen bulgular ve
diğer araştırmacıların önerileri doğrultusunda vero
hücrelerine adapte termostabil sığır vebası aşısı;
stabilizatör olarak %5 laktalbumin hidrolizat ve
%10 sukroz kullanılıp, uyguladığımız liyofilizasyon metodu ile liyofilizasyon işlemi gerçekleştirilerek düşük nem (≤%2) ve yüksek başlangıç titresi
(≥106.5 DKID50 /ml), liyofilizasyon sırasında düşük
titre kaybı (≤100.18 DKID50 /ml) elde edilerek sahada
soğuk zincire gerek duymadan 1 ay kullanılabilecektir. -20°C’de stok aşı olarak saklandığında yıllarca stok yenilemeye gerek duyulmayacak ve dilüent olarak %0.85 NaCl kullandığında sulandırılmış
aşı sıcak mevsimlerde dahi 4 saate kadar güvenle
kullanılabilecektir.
Kaynaklar
1. Allison LMC, Mann GF, Perkins FT, Zuckerman AJ,
(1981). An accelerated stability test procedure for lyophilized measles vaccines. J Biol Stand. 9, 185-194.
2. Anonim (2008). Rinderpest. In; OIE Manual of Standards
Diagnostic Tests and Vaccines Chapter 2.1.15. www.oie.int/
fr/normes/mmanual.
3. Asım A, Rashid A, Choudhary H, (2008). Effect of varıous
stabılızers on titre of lyophılızed live attenuated Peste Des
Petıts Rumınants (PPR) Vaccine. Pakistan Vet J. 28(4), 203104.
4. Colinet G, Peetermans J, (1982). Behavior of five commercial measles vaccines in an accelerated stability test. J Biol
Stand. 10, 241-247.
5. House JA, Mariner JC, (1996). Stabilization of rinderpest
vaccine by modification of the lyophilization process. Dev
Biol Stand. 87, 235-244.
6. Ihsak R, Howard CR (1990). Thermal stability of yellow
fever vaccines. Mem Inst Oswaldo Cruz. 85(3), 339-345.
7. İyigören B, Ünlü M, Yonguç AD, (1973). Doku Kültürü
Sığır Vebası Aşısı Uygulanan Bölgelerdeki Sığırların Bağışıklık Durumu Üzerine Araştırma. Etlik Vet Bak Ens Derg.
4(3-4), 11-19.
8. Languet B, Precausta P, Mackowiak M, Dubourget P,
Reynaud G, Duret C (1985). Freeze dried vaccine against
rinderpest: stability and activity study. Comp. Immunol.
Microbiol Infect Dis. 8(3-4), 285-295.
9. Marıner, JC, House JA, Sollod AE, Stem C, Van Den
Ende MC, Mebus CA, (1989). Heat Stable Rinderpest
Vaccine Implementation Project. Recommendations Adopted by The Pan African Rinderpest Campaign (PARC)
at The Informal Meeting on Thermostable Vaccines Held at
The International Office of Epizootics, Paris, France, September. 21-22, 1989.
10. Mariner, JC, House JA, Salifou S, Stem C, Van Den
Ende MC, Mebus CA, (1990) .The serological response to
a thermostable vero cell-adapted rinderpest vaccine under
field conditions in Niger. Vet Microbiol. 22(2-3), 119-127.
11. Mariner, JC, House JA, Sollod AE, Stem C, Van Den
Ende MC, Mebus CA, (1990). Comparison of the effect of
various chemical stabilizers and lyoflization cycles on the
thermostability of a vero cell adapted rinderpest vaccine.
Vet Microbiol. 21(3), 195-209.
12. Marıner, JC, House JA, Sollod AE, Stem C, Van Den
Ende MC, Mebus CA, (1991). Production of a thermostable vero-cell adapted rinderpest vaccine. J Tiss Cult
Meth. 13, 253-256.
13. Mariner, JC (1993). The use of thermostable vero celladapted rinderpest vaccine as a heterologous vaccine
against peste des petits ruminants. Res Vet Sci. 54, 212216.
14. Plowright W, Ferris RD (1962). Studies with Rinderpest
Virus in Tissue Culture. The use of Attenueted Culture Virus
as a vaccine for Cattle. Res Vet Sci. 3, 172-182.
29
15. Plowright W, Herniman KAJ, Rampton CS, Taylor WP
(1970). Studies on Rinderpest Culture Vaccine. III. Stability
of The Lyophilised Product. Res Vet Sci. 11, 71-81.
16. Plowright W, Herniman KAJ, Rampton CS (1971). Studies on Rinderpest Culture Vaccine. IV. The Stability of Reconstituted Product. Res Vet Sci. 12, 40-46.
17. Raut A, Sıngh RK, Malık M, Joseph MC, Bakshı CS,
Suryanarayana V VS, Butchaıah G (2001). Development
of a thermoresıstant tissue culture Rinderpest vaccine virus. Acta Virol. 45, 235-241.
18. Sarkar J, Sreenivasa BP (2003). Comparative efficacy
of various chemical stabilizers on the thermostability of a
live-attenuated peste des petits ruminants (PPR) vaccine.
Vaccine 1. 21(32), 4728-4735.
19. Siddique MP, Rahman MB, Chowdhury SMZH, Kafi
MA, Alam MS (2006). Deteriınation of efficacy of thermostable PPR live homologous vaccıne incubated at room
temperature or 14 Days. Bangl J Vet Med. 4(1), 43-46.
20. Sütçü M, Erdem H (1976). Dana böbrek hücre kültüründe
attenue sığır vebası virusu üretimi aşı hazırlanması ve
hazırlanan aşıların laboratuvar ve bağışıklık kontrolü
sonuçları. Vet Hekimler Dern Derg. 46(7-8-9), 34-35.
21. Tsukiyama K, Yoshikawa Y, Kamata H, Imaoka K, Asano K, Funahashi S, Maruyama T, Shida H, Sugimoto M,
Yamanouchi K (1989). Development of heat-stable recombinant rinderpest vaccine. Arch Virol. 107, 225-235.
22. Woese C (1960). Thermal inactivation of animal viruses.
Ann N Y Acad Sci. 83, 741-751.
23. Worrall EE, Litamoi JK, Seck BM, Ayelet G (2000). Xerovac: an ultra rapid method for the dehydration and preservation of live attenuated Rinderpest and Peste des Petit
ruminants vaccines. Vaccine, 22; 19(7-8), 834-839.
30
21, 31 -S,36,
2010 S. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21,
Araştırma
31
Gürpınar
Savaşan
31 - 36, 2010
Ege Bölgesi kültür balıklarında Gram pozitif bakteri infeksiyonlarının
incelenmesi*
Saadet GÜRPINAR, Serap SAVAŞAN
Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Aydın, Türkiye
Özet: Bu araştırmada, Ege Bölgesi kültür balıklarındaki Gram pozitif bakteri infeksiyonlarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Ege Bölgesi’nde bulunan çeşitli balık çiftliklerinden canlı olarak sağlıklı ve hasta olmak üzere, rutin teşhis
laboratuvarına getirilen 150 kültür balığının fiziksel ve bakteriyolojik olarak incelenmesi sonucu toplam 101 adet izolat
elde edildi. Bu izolatların 10 adeti (%9.9) Gram negatif kok ve basil, 91 adeti (%90.1) ise Gram pozitif kok-kokoid
olarak belirlendi. Gram pozitif kok-kokoid tarzı 91 adet mikroorganizma Staphylococcus spp. (%43), Lactococcus lactis
(%35.1), Enterococcus avium (%3.2), Enterococcus feacalis (%17.5), Listeria spp. (%1), Aerococcus viridans (%10.9),
Aerococcus urinae (%5.4), Streptococcus pyogenes (%7.6) Streptococcus agalactiae (%14.2) olarak identifiye edildi. S.
agalactia, sağlıklı balıkların %10.4’ünden izole edilirken, %7.8 oranında hasta balıklarda izole edilmiştir. S. pyogenes
ise, sağlıklı balıkların %6.2’sinden izole edilirken, hasta balıkların %3.9’undan izole edilmiştir.
Anahtar sözcükler: Balık hastalıkları, Gram pozitif bakteri, identifikasyon, izolasyon.
Investigation of Gram positive bacterial infections in culture fisheries in the Aegean Region
Summary: Aim of this study was, to define Gram positive bacterial infections at culture fisheries in the Aegean Region.
In this research, 150 live culture fish taken from various fish farms on Aegean Region were classified as healthy or diseased. After analyzing of 150 culture fish at routine identification laboratories, 101 bacteria were isolated. Ten (9.9%) of
these bacteria were identified as Gram negative cocci and bacilli, 91 (90.1%) of them were identified as Gram positive
cocci-coccoid. These 91 Gram positive cocci-coccoid bacteria were identified as Lactococcus lactis (35.1%), Enterococcus avium (3.2%), Enterococcus feacalis (17.5%), Listeria spp. (1%), Aerococcus viridans (10.9%), Aerococcus urinae
(5.4%), Streptococcus pyogenes (7.6%) and Streptococcus agalactiae (14.2%). S. agalactia were isolated from 10.4%
of healthy fish as well as they were isolated from 7.8% of diseased fish. Also S. pyogenes was isolated from 6.2% of
healthy fish and 3.9% of diseased fish.
Key words: Fish diseases, Gram positive bacteria, identification, isolation.
Giriş
Balıklar arasında Gram pozitif bakterilerden kaynaklanan hastalıklar sayısal olarak Gram negatiflere göre daha az görülmekle beraber, morbidite ve
mortaliteleri daha düşüktür (2). Kültür balığı populasyonlarında giderek artan ve önemli bir problem
halini alan streptokokal infeksiyonlar, Pier & Madin tarafından 1976 yılında, Plumb tarafından 1991
yılında, Baya, Lupuani, Hetrick, Robertson, Lukacovic, May & Poukish tarafından 1990 yılında, AlHarbi & Ahmed tarafından 1994 yılında ve Chang
& Pulumb tarafından 1996 yılında tanımlanmıştır
(4). Balıklardan yaygın olarak izole edilen patojen
streptokok türlerinden en önemlileri, ilk kez tilapia
balıklarından 1976 yılında Pier & Madin tarafından
tanımlanan Streptococcus iniae, özellikle sıcak su
streptokokkozis infeksiyonlarından yaygın olarak
izole edilen Streptococcus difficili ve Kusuda ve
Komatsu tarafından 1978 yılında çeşitli balık türlerinden izole edilen Streptococcus agalactiae’dir.
Dünyada çeşitli streptokokkozis vakalarından izole
edilen diğer streptokokkozis etkenleri de Streptocuccus parauberis, Streptococcus equi, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus shiloi’dir (7,
16, 18).
S. iniae’nin balık hastalıklarındaki septisemi ve
meningoensefalitis gibi klinik belirtileri, S. parauberis, S. difficili, L. garvieae gibi diğer balık patojenlerinin klinik belirtileriyle benzerlik göstermektedir (13, 19). B grubu streptokoklar içinde yer alan
S. agalactiae, balık patojeni olarak, tatlı su ve deniz
balıklarından, tilapia, gümüş balığı, barbun balığı
Yazışma adresi / Correspondance: Saadet Gürpınar, Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji
Anabilim Dalı, Işıklı, Aydın, Türkiye E-posta: [email protected]
* Aynı isimli yüksek lisans tezinden özetlenmiştir.
32
Gürpınar S, Savaşan S. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 31 - 36, 2010
türlerini etkileyerek ölümlere neden olmuştur (17,
19). Düzensiz yüzme, vücut renginin koyulaşması,
çift ya da tek taraflı ekzoftalmi, korneal opaklık,
operkulum üzerinde hemorajiler, kaudal yüzgeci
başlangıcında ve vücut yüzeyinde ülserler yaygın
olarak görülen semptomlardır (2). Öncelikle dalak,
karaciğer, kalp, böbrek gibi iç organlar etkilenir.
Karaciğer genellikle soluk renklidir ve kiraz renginde lokal nekroz odakları görülebilir (11). Sırt ve
kuyruk yüzgecinin ön kısmı, ağız çevresi, operkulum ve genellikle operkulumun alt tarafında ülserler
daha belirgindir. Lezyonlar sık sık anal bölge ve anal
yüzgeci de içeren anüs çıkışında görülür. Türlerin
çoğunda gözlerdeki semptomlar en önemli belirtilerdendir (1, 11). İlk lezyon retrobulbarda kan birikmesiyle sonuçlanan ekzoftalmi ve ödemle sınırlı
olabilir. Gözlerde hiperemi vardır (11). Streptokok
türlerinin neden olduğu streptokokkozis, gözlerde
şiddetli ekzoftalmusla seyrettiği için “pop eye” hastalığı olarak isimlendirilmektedir. Hastalık bugün
dünyanın birçok ülkesinde görülmekle birlikte, son
yıllarda özellikle Ege Bölgesi’nde bulunan alabalık
ve bazı levrek çiftliklerinde ekonomik kayıplara neden olmaktadır.
Bu çalışmada, Ege Bölgesi’nde yetiştirilen deniz ve tatlı su kültür balıklarında ciddi ekonomik
kayıplara yol açan Gram pozitif bakteri infeksiyonlarının araştırılarak, hastalık etkeni olan streptokok
türlerinin belirlenmesi hedeflenmiştir.
Materyal ve Metot
Bu çalışmada Ege Bölgesi’nde, Aydın, İzmir ve
Muğla illerinde bulunan çeşitli balık çiftliklerinden
sağlanan, rastgele örnekleme ile 48 sağlıklı, 102
hasta balık olmak üzere toplam 150 adet balık materyali kullanılmıştır.
Fiziksel muayenede, gözler, operkulum açıklığı, deri yüzeyi ve pullar, karın bölgesindeki şişlik
durumu, deri rengi, kaudal, dorsal, ventral ve pektoral yüzgeç durumu incelendi (2). Nekropsisi yapılarak abdominal boşluğu açılan balıkların, karaciğer,
böbrek, beyin, kalp ve dalak gibi iç organlarından
%5 koyun kanı içeren, Trypticase-Soy Agar (TSA)
(Biomerieux 51044 Fransa) besiyerine ekimler yapılarak 22°C’de, 12-24 saat süreyle inkübasyona
bırakıldı (12). İzolasyon sonucu elde edilen suşlar
Gram pozitif bakteriler yönünden incelendi. İzole
edilen saf kültürler, tür identifikasyonu %5 gliserinli Brain Heart Infusion Broth (Merck 1.10493
Almanya) sıvı besi yerine aktarılarak, -20°C’deki
dondurucuda saklandı.
Tür olarak identifikasyonda ticari bir kit (Api
20 Strep. Bio Merieux, Lyon, France) kullanıldı (3,
22). Standart test işlemi üretici firmanın tavsiye ettiği şekilde yapıldı.
Bulgular
Yüz elli adet kültür balığından yapılan fiziksel muayene ve nekropsi sonuçları Tablo 1 ve Tablo 2’de
belirtilmiştir. İzolasyon ve identifikasyon çalışmaları sonucunda, 49 adet örnekte üreme görülmeyip,
101 adet örnekte ise üreme tespit edildi. Belirlenen
87 Gram pozitif, katalaz ve oksidaz negatif suştan,
32 adet Lactococcus lactis, 3 adet Enterococcus
avium, 16 adet Enterococcus feacalis, 1 adet Listeria spp., 10 adet Aerococcus viridans, 5 adet Aerococcus urinae, 7 adet Streptococcus pyogenes ve
13 adet Streptococcus agalactiae identifiye edildi
(Tablo 3).
S. agalactiae, sağlıklı balıkların %10.4’ünden
hasta balıkların ise %7.8’inden izole edildi. S. pyogenes ise, sağlıklı balıklardan %6.2 oranında izole
edilirken, hasta balıklardan %3.9 oranında; sağlıklı
ve hasta balıklardan ise toplam %7.4 oranında izole
edildi (Tablo 4).
Fiziksel muayene sonuçları, tür bazındaki bakteri identifikasyon bulguları ile değerlendirildiğinde
ise, bakteriyel üreme gözlenmeyen 49 adet örnekten,
%71.4’ü fiziksel muayenede normal olarak değerlendirilmiş olup, %20.4’ünde deride renk değişimi
gözlenirken, %6.1’lik bir bölümünde ise ekzoftalmi
görüldü. A. viridans izole edilen balıkların hepsinde
çeşitli semptomlar gözlenirken, %90’ınında ekzoftalmi, %40’lık bir bölümünde ise yüzgeç hasarları belirlendi. S. agalactiae izole edilen balıkların
%38.4’lük bir bölümünde fiziksel bir bulguya rastlanmazken, %61.5 oranında ekzoftalmi, %46.1 oranında deride renk değişimleri, %38.4 oranında ise
deri yüzeyinde lezyonlar izlendi (Tablo 1).
Tablo1: Balıklarda yapılan fiziksel muayene bulguları ve bakteriyel üreme durumları.
Solungaç
Deri renk
Bakteri
Adet
Eksoftalmus Pul kaybı
Lezyon
renk kaybı değişimi
33
Yüzgeç
hasarı
Normal
Üreme yok
49
%6.1
-
%2
%20.4
%2
%4
%71.4
Gram negatif
10
%40
%20
%10
%10
%30
-
%30
Gram pozitif
Katalaz pozitif
4
-
-
%25
-
-
-
%25
A. viridans
10
%90
-
%40
%30
%10
%40
-
A. urinae
5
%60
-
%40
%80
%20
-
-
Listeria spp.
1
-
-
-
-
-
-
%100
L. lactis
32
%90.6
%3.1
%43.7
%59.3
%12.5
%21.8
-
E. avium
3
%100
-
-
-
-
-
-
E. faecalis
16
%100
%6.2
%31.2
%87.5
%62.5
%59.2
-
S. agalactiae
13
%61,5
%30.7
%15.3
%46.15
%38.4
%30.7
%38.4
S. pyogenes
7
%47.1
%14.2
%14.2
%42.8
%28.5
%28.5
%42.8
Tablo 2: Balıklarda nekropsi bulguları ve bakteriyel üreme durumları.
Dalak
Karaciğer
Bakteri
Adet
büyümesi renk değişimi
Asites
Kaslarda
hemoraji
Normal
Üreme yok
49
%2
%18.3
%4
-
%93.8
Gram negatif
10
%20
%30
%10
%10
%60
Gram pozitif
Katalaz pozitif
4
-
%25
%25
-
%25
Aerococcus viridans
10
%60
%50
%40
%10
-
Aerococcus urinae
5
%40
%10
%20
%20
-
Listeria spp.
1
-
-
-
%100
-
Lactococcus lactis
32
%81.2
%56.2
%21.8
%43.7
-
Enterococcus avium
3
-
%66.6
-
-
%33.3
Enterococcus faecalis
16
%93.7
%56.2
%18.7
%12.5
-
Streptococcus agalactiae
13
%61.5
%23
%15.3
%38.4
%38.4
Streptococcus pyogenes
7
%57.1
%28.9
%14.2
%28.5
%42.8
Tablo 3: İdentifikasyon sonucu bulunan türler ve toplam türlere oranları.
Toplam türlere
İdentifiye edilen tür
Tür adedi
oranı (n=87)
10
%11
Aerococcus viridans
Aerococcus urinae
5
%6
Listeria spp.
1
%1
Lactococcus lactis
32
%38
Enterococcus avium
3
%3
16
%18
13
%15
7
%8
34
Tablo 4: İdentifiye edilen tüm suşların hasta ve sağlıklı balıklardaki dağılımı.
İzole edilen tür
Sağlıklı balıklardan izolasyon
(n:48) (%)
Hasta balıklardan izolasyon
(n:102) (%)
Toplam balık
(n:150) (%)
Gram negatif basil
5 (%10.4)
4 (%3.9)
9 (%6)
Gram negatif kok
1 (%2)
0 (%0)
1 (%0.6)
Staphylococcus spp.
1 (%2)
3 (%2.9)
4 (%2.6)
Aerococcus viridans
0 (%0)
10 (%9.8)
10 (%6.6)
Aerococcus urinae
0 (%0)
5 (%4.9)
5 (%3.3)
Listeria spp.
1 (%2)
0 (%0)
1 (%0.6)
Lactococcus lactis
0 (%0)
32 (%31.3)
32 (%21.3)
Enterococcus avium
0 (%0)
3 (%3.9)
3 (%2)
0 (%0)
16 (%15.6)
16 (%10.6)
5 (%10.4)
8 (%7.8)
13 (%8.6)
3 (%6.2)
4 (%3.9)
7 (%7.4)
Nekropsi bulguları, tür bazındaki bakteri identifikasyonu ile değerlendirildiğinde ise, bakteriyel üreme gözlenmeyen 49 adet örnekten, %93.8’i sağlıklı,
%18.3’ünde ise karaciğerde renk değişimleri görüldü. A. viridans izole edilen balıkların %60’ında, A.
urinae izole edilen balıkların ise %40’ında dalakta
büyüme saptandı. L. lactis bulunan balıklarda, %81,
E. faecalis izole edilen balıklarda da %93.7 oranında dalak büyümesi tespit edildi (Tablo 2).
ken, %9.9 (10 adet) oranında Gram negatif bakteri
gözlemlendi.
Su sıcaklığı 15°C’nin üzerine çıktığında gözlemlenen hastalık sıcak su streptokokkozisi olarak
adlandırılır. Sıcak su streptokokkozisi, Akdeniz ülkelerinde yaygın olarak görülen ve ekonomik kayıplara neden olan bir hastalıktır (1). Bu çalışma,
1 Haziran - 30 Ekim 2006 tarihleri arasında, deniz
suları sıcaklığının 27-21°C, iç sular sıcaklığının ise
23-15°C olduğu dönemde, kültür balıkları arasında
yapıldı.
Balıklar, içerisinde bulundukları ortam nedeniyle
sürekli mikroorganizmalarla temas halindedirler.
Bu nedenle bakteriyel hastalıklar yoğun olarak balık yetiştiriciliğinin yapıldığı çiftliklerde büyük ekonomik kayıplara neden olur. Bu hastalıkların ortaya
çıkmasında en önemli rolü balığın doğal direncini
kıran etkenler oynar. Balık yemlerinin ihtiyacı karşılayamaması, suyun fiziksel ve kimyasal kalitesindeki bozukluk ve strese neden olan her türlü olumsuz faktör bakteriyel balık hastalıklarının çıkması
için zemin hazırlamaktadır (20).
Stafilokok türlerinden kaynaklanan hastalıklar,
balık türlerinde az sayıda görülmektedir. Bununla
birlikte, hastalık olgularından genellikle S. aureus
izole ve identifiye edilmiştir. Bu etken alabalıklarda
vücut üzerinde gri-beyaz lezyonlar, dalakta büyüme
ve bağırsakta yangısal lezyonlara neden olabilir (2).
Araştırmamızda ise, Gram pozitif 91 adet mikroorganizmadan 4 adet Stafilokok suşu izole edildi.
Yapılan fiziksel muayenede %25’i hastalık belirtisi
göstermezken, nekropside %25 oranında asites ve
karaciğerde renk değişimleri görüldü.
Balıklardan izole edilen hastalık ve ölümlere
neden olabilecek bakteriyel patojenler genel olarak
Gram negatif aerobik ve fakültatif anaerobik kok
ve basiller, Gram pozitif aerobik ve fakültatif anaerobik kok ve basiller olarak sınıflandırılabilir (11).
Bu çalışmada, balıklardan izole edilen 101 bakteriye Gram boyama yapıldı ve sonucunda, %90.1 (91
adet) oranında Gram pozitif bakteri gözlemlenir-
Gram pozitif bakterilerden 4 adet Staphylococcus spp., 32 adet L. lactis, 3 adet E. avium, 16 adet
E. feacalis, 1 adet Listeria spp., 10 adet A. viridans,
5 adet A. urinae, 7 adet S. pyogenes ve 13 adet S.
agalactiae identifiye edildi. Bunlardan Staphylococcus spp., olarak belirlenen 4 adet suş, katalaz
test pozitifken, diğer 87 suş, katalaz test ve oksidaz
testleri negatif olarak belirlendi.
İnsanlarda oluşan listeriozisten izole edilen
Listeria türleri balık, karides, midye ya da tütsülenmiş deniz ürünleri kaynaklıdır. Fransa’da midyeler
üzerinde yapılan bir araştırmada, 120 örneğin 66
adedinde Listeria türleri tespit edilmiş olup, tüm örneklerden %55 oranında izole edildiği bildirilmiştir
(14). Ayrıca Keban baraj gölünden yakalanan 150
balık türünden %6.6’sında Listeria türleri izole edilmiştir (6). Diyarbakır Dicle nehrinde ve Keban baraj gölünde 51 adet balık üzerinde yapılan diğer bir
çalışmada ise, %3.9 oranında Listeria monocytogenes izole edildiği belirtilmiştir (6, 21). Bu çalışmada
ise, hiçbir hastalık belirtisi göstermeyen sağlıklı bir
balıktan 1 adet Listeria spp. izole edilmiştir.
İnsan ve hayvanlardan L. lactis, Lactococcus piscium, L. garviae gibi türler tanımlanmıştır.
L. piscium ve L. garviae balıklarda potojen olarak
ölümlere yol açarken, L. garviae ve L. lactis gibi
türler insanlarda endokarditise bağlı ölümlerden
izole edilmişlerdir (10). Bu çalışmada, 87 adet katalaz testi ve oksidaz testi negatif suştan, 32 adet
L. lactis, izole edilirken, diğer Laktokok türlerinden L. piscium ve L. garviae türlerine rastlanmadı.
İzole edilen 87 Gram pozitif, katalaz ve oksidaz
test negatif suşlar içindeki oranı L. lactis %38 olarak belirlenmiştir. Yapılan bir diğer araştırmada,
İtalya’da yetiştirilen gökkuşağı alabalıklarının %20
’sinde Laktokokkozis görüldüğü bildirilmiştir (8).
İtalya’da 10 adet alabalık örneğinden yapılan bir
çalışmada, 7 adet örnekte, patojen L. garviae izole
edilmiştir. Yine bu çalışmada, L. lactis ile L. garviae arasında fenotipik benzerlikler olduğu ortaya
konmuştur (22). İtalya’da yapılan bir diğer çalışmada ise, alabalıklarda farklı zamanlarda görülen
100’den fazla salgında 71 adet (%87) oranında L.
garviae izole edilmiştir (5).
Araştırmamızda, belirlenen 87 adet katalaz testi ve oksidaz testi negatif suştan, 3 adet E. avium, 16
adet E. feacalis olmak üzere toplam 20 Enterokok
suşu izole edildi. İzole edilen bu suşlar içerisinde E.
avium, %3, E. feacalis ise, %18 oranında bulundu
(Tablo 3). Japonya’da kültür sarıkuyruk türlerinden
E. feacalis ve E, faecium izole edildiği bildirilmiştir
(11). Literatürlerde balıklarda, E. avium izolasyonuna dair bir bilgiye rastlanamadı.
Bu çalışmada, 87 adet katalaz testi ve oksidaz
testi negatif suştan, 10 adet ve %11 oranında. A. viridans, 5 adet ve %6 oranında A. urinae tür bazında
identifiye edildi (Tablo 3). 2005 yılında yapılan bir
35
çalışmada, 66 adet deniz suyundan, 20 adet deniz
dibindeki sediment içinden, 8 adet martı dışkısı ve
5 adet lağım kanal bölgesinden olmak üzere toplam
99 adet örnek toplanarak incelendiğinde, E. feacalis,
E. faecium ve A. viridans izole edildiği bildirilmiştir (15). Ancak literatürde balıklarda, A. urinae’nin
izolasyonu ile ilgili bir bilgiye rastlanamamıştır.
Streptokok türleri, sağlıklı insan ve hayvan florasında normal olarak bulunabilirken, bazı türler,
bulundukları organizmada hastalığa neden olabilir.
Bilinen fenotipik identifikasyon metotları ile S. pyogenes, S. agalactiae gibi türler fırsatçı patojen olarak kolayca tanımlanabilir (9). Kültür çipura, levrek
ve tekir balığında yapılan bir çalışmada hasta ve
sağlıklı balıklardan alınan örneklerde hiçbir klinik
hastalık belirtisi göstermeyen tekir balığı ve çipuraların beyin ve gözlerinden, S. agalactiae identifiye
edildiği bildirilmiştir (7). Zebra balıklarında yapılan
bir araştırmada ise S. pyogenes lokal kas lezyonlarından izole edilmiştir (16). Bu çalışmada S. agalactia sağlıklı balıkların %10.4’ünden izole edilirken,
%7.8 oranında hasta balıklarda izole edildi. Toplam
balıklardan izolasyon oranı ise %8.6 olarak belirlendi. S. pyogenes ise, sağlıklı balıkların %6.2’sinden
izole edilirken, hasta balıkların %3.9’undan izole
edildi. Toplam balıklardan izolasyon oranı %7.4
olarak belirlendi (Tablo 4).
Hasta, kültür, pisi balıklarında yapılan bir çalışmada, hastalığın klinik belirtileri olarak, gözlerde,
tek ya da çift taraflı ekzoftalmi, operkulum ve solungaçlar üzerinde ve iç organlarda hemorajiler görülmüştür. Çalışmada 22 hasta balıktan 18 adedinde
S. parauberis izole edilirken, 3 adet L. garviae izole
edilmiş, anti S. iniae serumu ile aglütinasyon gösteren S. iniae türüne rastlanamamıştır (18).
Araştırmamızda, patojenitesi yüksek olan S.
iniae, S. parauberus ve L. garviae türlerine rastlanmadı. Ancak, S. agalactiae izole edilen balıkların %38.4’lük bir bölümünde fiziksel bir bulguya
rastlanmazken, %61.5 oranında ekzoftalmi, %46.1
oranında deride renk değişimleri, %38.4 oranında
ise deri yüzeyinde lezyonlar belirlendi. S. pyogenes
izole edilen balıkların, %42.8’inde semptom gözlenmezken, %47.1’inde ekzoftalmi, %42.8 oranında
ise deride renk değişimleri gözlendi. L. lactis izole
edilen 32 balıkta, %90 oranında ekzoftalmi görülürken, %43.7 oranında solungaçlarda renk değişimleri
ve %59.3 oranında deride renk değişimlerine rastlanmıştır (Tablo 1).
36
Araştırmamızda, hasta ve sağlıklı balıklarda
bulunan Gram pozitif bakterilerin izolasyonları ve
identifikasyonları amaçlanmıştır. Bu türlerin varlığı
ile ileride oluşabilecek su kalitesindeki bozulmalar, suların ısınması ve balıkta stres artışı ile aktive
olarak etkinleşebileceği ve bölgede toplu ölümlere
bağlı ekonomik kayıplara neden olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışma ışığında, etkene karşı alınabilecek tedbirler belirlenerek, olası salgınlardan
korunma ya da tedavi yöntemlerinin araştırılması
ekonomik kayıpları önleme adına faydalı olabileceği sonucuna varılmıştır.
Kaynaklar
1. Actis LA, Tolmasky ME, Crosa JH, (1999). Enterococcus seriolicida and Streptococcus iniae, Chapter 8. eds.
Kusuda R, Salati F, Fish disease and disorders, Volume: 3
Viral, bacterial and fungal infections., CAB International,
Oxfordshire.
2. Arda M, Seçer S, Sareyyüpoğlu M, (2005). Balık Hastalıkları, 2. Baskı, Ankara, Medisan Yayınevi, 69-100.
3. Bachrach G, Zlotkin A, Hurvitz A, Evans DL, Eldar A,
(2001). Recovery of Streptococcus iniae from diseased fish
previously vaccinated with a Streptococcus vaccine. Appl
Environ Microbiol. 67 (8), 3756-3758.
4. Dodson SV, Muarer JJ, Shotts EB, (1999). Biochemical
and molecular typing of Streptococcus iniae isolated from
fish and human cases. J Fish Dis. 22, 331-336.
5. Eldar A, Goria M, Ghıttino C, Zlotkin A, Bercovier H,
(1999). Biodiversity of Lactococcus garviae strains isolated from fish in Europe, Asia and Australia. Appl Environ
Microbiol. 65 (3), 1005-1008.
6. Ertaş HB, Şeker E, (2005). Isolation of Listeria monocytogenes from fish intestines and RAPD analysis. Turk J Vet
Anim Sci. 29, 1007-1011.
7. Evans JJ, Klesıus PH, Gilbert PM, Shoemaker CA, Al
Sarawi J, Landsberg MA, Durumdez R, Al Marzouk
A, Al Zenki S, (2002). Characterization of β-haemolytic
group b Streptococcus agalactiae in cultured seabream,
Sparus auratus L., and wild mullet, Liza klunzingeri (day),
in Kuwait. J Fish Dis. 25, 505-513.
8. Ghittino C, Latini M, Agnetti F, Panzieri C, Lauro L,
Ciappeloni R, Petracca G, (2003). Emerging pathologies
in aquaculture: effects on production and food safety. Vet
Res Com. 27 (1), 471-479.
9. Goh SH, Driedger D, Gillett S, Low DE, Hemmingsen
SM, Amos M, Chan D, Lovgren M, Willey BM, Shaw C,
Smith JA, (1998). Streptococcus iniae a human and animal
pathogen: specific identification by the chaperonin 60 gene
identification method. J Clin Microbiol. 36 (7), 2164-2166.
10. Goyache J, Vela AI, Gıbella A, Blanco MM, Briones V,
Gonzales S, Tellez S, Ballesteros C, Dominguez L, Garayzabal JFF, (2001). Lactococcus lactis sbsp. lactis infection in waterfowl: first confirmation in animals. Emerg
Infect Dis. 7 (5), 884-886.
11. Kitao T, (1994). Bacterial Diseases of Fish. Ed: İnglis V,
Roberts RJ, Bromage NR. eds. Streptococal Infections, The
University Pres, Cambridge.
12. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger
PC, Winn WC, (1997). Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 5th ed., New York, Lippincott, 577619.
13. Mata AI, Blanco MM, Dominguez L, Garayzabal JFF,
Gibello A, (2004). Development of a PCR assay for Streptococcus iniae based on the lactate oxidase (lctO) gene with
potential diagnotistic value. Vet Microbiol. 101, 109-104.
14. Monfort P, Minet J, Rocourt J, Piclet G, Cormier M,
(1998). Incidence of Listeria spp. in Breton live shellfish.
Lett Appl Microbiol. 26, 205-208.
15. Moore DF, Zhowandaı MH, Ferguson DM, Mcgee C,
Mott JB, Stewart JS, (2005). Comparison of 16S rRNA
sequencing with conventional and commercial phenotypic
techniquesfor identification of enterococci from the marine
environment. J Appl Microbiol. 1364-5072.
16. Neely MN, Pfeifer J, Dcaparon M, (2002). Streptococcus
zebrafish model of bacterial pathogenesis. Infect Immun.
70 (7), 3904-3014.
17. Pasnik DJ, Evans JJ, Klesius PH, (2006). Passive immunization of nile tilapias (Oreochromis niloticus) provides
significant protection against Streptococcus agalactiae.
Fish Shellfish Immunol. 21, 365-371.
18. Salvador R, Muller EE, Freitas JC, Leonhadt JH, Giordano LGP, Dias JA, (2005). Isolation and characterization
of Streptococcus spp. group b in nile tilapias (Oreochromis
niloticus) reared in hapas nets and earth nurseries in the
northern region of Prana State, Brazil. Ciéncia. Rural, Santa Maria. 35 (6), 1374-1378.
19. Shelby RA, Klesius PH, Shoemaker CA, Evans JJ,
(2002). Passive immunization of tilapia Oreochromis niloticus (L.), with anti-Streptococcus iniae whole sera. J
Fish Dis. 25, 1-6.
20. Tanrıkul TT, Çağırgan H, Tokşen E, (1997). Bakteriyel
Balık Hastalıkları. Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma
Enstitüsü Müdürlüğü Dergisi, Balık Hastalıkları Özel Sayısı. 20 (34), 105-128.
21. Vural A, Erkan ME, (2006). Diyarbakır Kenti’ndeki Dicle Nehri balıklarında mikrobiyolojik kalite parametreleri.
Dicle Tıp Derg. 33 (3), 253-156.
22. Zlotkin A, Eldar A, Chittino C, Berccvier H, (1998).
Identification of Lactococcus garvieae by PCR. J Clin Microbiol. 36 (4), 983-985.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg,Kasımoğlu
21, 37 - 40,
2010A. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 37 - 40, 2010
Doğru
Derleme / Review
37
Bir gıda patojeni: Cronobacter sakazakii
Aylin KASIMOĞLU DOĞRU
Kırıkkale Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı, Kırıkkale, Türkiye
Özet: Cronobacter sakazakii, yeni doğanlarda menenjit, septisemi ve enterokolite neden olan fırsatçı bir patojendir. Etken, Enterobacteriaceae familyasında yer alan, Gram-negatif çubuk şeklinde bir bakteridir. C. sakazakii farklı kaynaklardan izole edilmesine rağmen, enfeksiyonlar toz bebek mamalarıyla ilişkilendirilmiştir. C. sakazakii enfeksiyonlarından korunabilmek için, etkenin üreme, canlı kalma, inaktivasyon koşulları gibi özellikleri ile izolasyon ve identifikasyon
yöntemlerinin bilinmesi önemlidir.
Anahtar sözcükler: Cronobacter sakazakii, gıda, yeni doğan.
A food pathogen: Cronobacter sakazakii
Summary: Cronobacter sakazakii is an opportunistic pathogen causing meningitis, septicemia and enterocolitis in
neonates. The organism is a Gram-negative rod within the family Enterobacteriaceae. Although the pathogen was
isolated from different sources, its infections have been linked with powdered infant formulas. It is important to know
growth, survival, and inactivation conditions of C. sakazakii and its isolation and identification methods for preventative
purposes.
Key words: Cronobacter sakazakii, food, infant.
Giriş
Cronobacter sakazakii, yeni doğan enfeksiyonları
ile ilişkilendirilen fırsatçı bir patojendir (22). Adını Japon mikrobiyolog Riichi Sakazaki’den alan
etken, koliform, basillus, sarı koliform, sarı enterobakter, pigmentli kloacal A organizması, sarı
pigmentli Enterobacter cloaca ve Enterobacter sakazakii olarak farklı adlarla anılmıştır (13). Iversen
ve ark. (17)’nın E. sakazakii’ye ait biyogrupların
Cronobacter genusu ile taksonomik ilişkisini ortaya
koyması ile yeniden klasifikasyon yapılmıştır (17).
Etkenin, suşa bağlı olarak enterotoksin benzeri bileşikler üretebildiği ve sitotoksik etkilerinin olduğu
belirlenmiştir (23). C. sakazakii enfeksiyonunda
yeni doğan mortalitesinin %40-80 arasında olması
ve toz bebek mamalarında çok düşük düzeydeki etkenin (1000 bakteri) hastalığın oluşumu için yeterli
bulunması ile tüm dünya ülkelerini ilgilendiren bir
sorun olarak görülmektedir (15, 22). Yeni doğan enfeksiyonlarının toz bebek mamalarıyla ilişkilendirilmesi nedeniyle (22), pek çok ülkede olduğu gibi
Türkiye’de de bebek mamalarının mikrobiyolojik
kriterlerine yönelik değişiklik yapılarak, Türk Gıda
Mevzuatı Devam Formülleri Tebliği’nde bebek
mamalarının 25 gramında Enterobacter sakazakii
(Cronobacter sakazakii) bulunmaması gerektiği belirtilmiştir (2).
Bu derlemede, önemli gıda patojenleri arasında
yer almaya aday olarak görülen C. sakazakii’ye ilişkin çeşitli bilgilere yer verilerek, etkenin tanıtılması
amaçlanmıştır.
Biyokimyasal Özellikleri
Enterobacteriaceae familyasında yer alan C. sakazakii, fakültatif anaerobik, peritrik flagellaya sahip,
hareketli, Gram-negatif, sporsuz, çubuk şeklinde bir
bakteridir. Etken nitratı indirgeme, karbon kaynağı
olarak sitratı kullanma, eskülini ve arjinini hidrolize etme, L-ornitini dekarboksile etme, D-glukoz,
D-sukroz, D-rafinoz, D-melibiyoz, D-sellobiyoz,
D-mannitol, D-mannoz, L-ramnoz, L-arabinoz, Dtrehaloz, galakturonat ve D-maltozdan asit oluşturma özelliklerine sahiptir. Voges–Proskauer testini,
metil red testini ve oksidaz testi negatif vermektedir. Optimal pigment oluşturma sıcaklığı 25ºC’dir
(10, 17).
Yazışma adresi / Correspondance: Aylin Kasımoğlu Doğru, Kırıkkale Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi
Anabilim Dalı, 71450, Yahşihan, Kırıkkale, Türkiye E-posta: [email protected]
38
Kasımoğlu Doğru A. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 37 - 40, 2010
Üreme ve Canlı Kalma Koşulları
C. sakazakii’nin Neden Olduğu Enfeksiyonlar
C. sakazakii, Enterobacteriaceae familyasının diğer
üyelerine oranla sıcaklığa daha dayanıklı bir bakteridir. Üreyebildiği sıcaklık aralığı 5.5-47ºC olup
(optimal üreme sıcaklığı 37-43ºC), düşük sıcaklığa
dayanıklı olduğu belirlenmiştir (4ºC) (16, 22). Desimal redüksiyon zamanı (D-değeri) 60ºC’de (D60ºC)
toz bebek mamasında 3.52-3.58 dakika, kahverengi
pirinçte 3.79-3.6 dakika, sıvı besi yerinde D58ºC 0.390.60 dakika, Z değeri ise 3.1-3.6ºC olarak belirlenmiş olup, bazı suşların daha yüksek termotolerans
gösterdikleri (D58ºC 9.9 dakika) bildirilmiştir (6, 9).
C. sakazakii, yeni doğanlarda yüksek mortalite ve
morbidite ile seyretmesi ve bebeklerin gıda zincirinde ciddi mikrobiyolojik tehlike oluşturması nedeniyle, adını Yunan mitolojisinde çocuklarını doğar doğmaz öldüren tanrı olarak bilinen Cronos’tan
alan Cronobacter genusunun karakteristik bir üyesidir (17). C. sakazakii enfeksiyonları, yeni doğanlarda menenjitis, septisemi ve nekrotik enterokolitis
ile önemli ölçüde hayati tehlike oluşturmaktadır.
Prematüre ve düşük doğum ağırlığına sahip yeni
doğanlarda, özellikle ilk 28 günde enfeksiyon riski
daha fazladır. Klinik semptomları yeni doğanlarda
ventrikülitis, beyin apseleri, serebral infarkt ve kist
oluşumu ile komplike menenjitis, bakteriyemi ve
nekrotik enterokolitisi kapsar. Bu semptomlara ateş,
hipotermi, bradikardi, iştah azalması, irritabilite, siyanoz, kollaps ve konvülziyonlar eşlik edebilmektedir. Yetişkinlerde C. sakazakii enfeksiyonları sık
görülmemekte ve hayati tehlike oluşturmamaktadır.
Etken, diyabet hastalarında ayakta görülen ülseratif
yaralardan izole edilmiştir. Yaşlılarda ise, C. sakazakii enfeksiyonlarında ürosepsis, pnömoni ve bakteriyemi şekillendiği bildirilmektedir (13, 22).
C. sakazakii hücre içerisinde trehaloz birikimi
ile düşük su aktivitesi değerlerine (aw 0.25-0.30) ve
ozmotik strese dirençli olduğu belirlenmiştir. Toz
bebek mamalarında 4ºC’de 12 aydan daha uzun
süre canlı kalabilmektedir (5, 6, 21).
Etkenin üreyebildiği en düşük pH değerlerinin
24-37ºC’ler arasında pH 3.9-4.1 olduğu bildirilmiştir (8).
Risk Grubu Bireyler
Enfeksiyonun yüksek risk grubunda yeni doğanlar,
immunsupresif bireyler ve yaşlılar yer almaktadır. Prematüre bebeklerde gastrointestinal sistemin
daha geçirgen olması, hem prematüre hem de matür
yeni doğanlarda patojenlere karşı koruyan doğal bağırsak florasının olmaması (14) ve mide asiditesinin
düşük olması predispoze faktörlerdir (11).
Minimal İnfektif Doz
C. sakazakii’nin minimal infektif dozuna ilişkin
epidemiyolojik bilgi olmaması nedeniyle Neisseria
meningitidis, Escherichia coli O157:H7 ve Listeria
monocytogenes 4b gibi patojenlerle aynı infektif
doz (1000 bakteri hücresi) kabul edilmektedir. Bu
dozun etkenin karşılaştığı stres faktörlerine, bireysel duyarlılığa ve gıdanın bileşimine göre değişebileceği vurgulanmaktadır (15). C. sakazakii’nin oda
sıcaklığında bir gecede, 7 logaritmadan fazla üreyebilmesi (22) ve yeni doğan farelere oral ve intraperitoneal yolla verilen etkenin letal dozunun suşa
göre 105-108 kob arasında değiştiğinin belirlenmesi (23), bebek mamalarının üretim ve hazırlanma
aşamalarında kontaminasyonların önlenmesinin ve
tüketime hazır mamaların saklama koşullarının önemini ortaya koymaktadır.
Gıdalarda Bulunuşu
C. sakazakii, insan ve hayvan bağırsağının normal
florasında bulunmaması nedeniyle, gıdaların primer
kontaminasyon kaynaklarının toprak ve su olduğu
ifade edilmektedir (15). Pastörizasyon işlemi ile
inaktive olduğu bilinen etkenin, açılmamış mama
kutularından izole edilmesi (22), toz bebek mamalarının pastörizasyon sonrası aşamada vitamin ve
mineraller gibi sıcaklığa duyarlı katkıların eklenmesi esnasında kontamine olabileceği görüşünü
kuvvetlendirmiştir (5). Toz bebek mamalarındaki
C. sakazakii düzeyinin oldukça düşük olduğu (0.36
kob/100g) (22). Son yıllarda yoğunlaşan çalışmalar,
bebek mamalarının yanı sıra deve eti, domuz eti, kanatlı eti, et ürünleri, su ürünleri, yumurta, süt, hububat, bisküvi, pastacılık ürünleri, sebze ve salata gibi
çeşitli gıdalarda C. sakazakii varlığını göstermiş (5,
16) olmakla birlikte yetersizdir.
İnaktivasyon
C. sakazakii’nin HTST (High Temperature Short
Time: Yüksek Sıcaklık Kısa Zaman) pastörizasyon
yönteminde 71.7ºC’de 15 saniyede inaktive olduğu bildirilmiştir (22). Bebek mamalarına 10 µg/ml
laktoperoksidaz uygulamasının C. sakazakii üzerine
hem inaktive edici hem de üremeyi önleyici yönde
etkileri olduğu saptanmıştır (5). Yapılan deneysel
bir çalışmada, 10 µg/ml klordioksitin elma yüzeyindeki etkende, 1-5 dakikada 3.38-3.77 log kob/
elma düzeyinde azalma sağlarken, 40 µg/ml Tsunami 200’ün ≥4.00 log kob/elma düzeyinde azalmaya neden olduğu belirlenmiştir. Klorun kıvırcık
yapraklarındaki C. sakazakii’nin inaktivasyonunda,
elma ve domatesteki uygulamalara oranla daha az
etkili olduğu, Tsunami 200 (40-80 µg/ml)’ün kıvırcık yapraklarındaki etken üzerinde 5 dakikada
≥5.31 logaritmalık azalma sağladığı bildirilmiştir
(18). Gama irradyasyon işleminin ise 5 kGy dozda,
8.0-9.0 log kob/g düzeydeki C. sakazakii’yi tamamen elimine ettiği ve gama irradyasyon uygulanan
toz mamalarda sulandırılmalarını takiben, 10ºC’de
6 saat boyunca etkenin tekrar üremediği bildirilmiştir (19). FAO (Food and Agriculture Organisation)
tarafından güvenli olarak kabul edilen ve tarçın kabuğundan elde edilen trans-cinnamaldehyde ile yapılan denemelerde, %0.5’lik konsantrasyonun 6 log
kob/ml C. sakazakii’yi 23ºC ve 37ºC’de 4 saatte,
4ºC ve 8ºC’de 10 saatte inaktive ettiği, fakat transcinnamaldehyde’in gıdalarda duyusal değişikliklere
neden olup olmadığının araştırılması gerektiği ifade
edilmiştir (1). Propiyonik asit ve asetik asit gibi organik asitlerin ise C. sakazakii’nin inaktivasyonunda etkili olduğu ve koruyucu amaçla sıvı gıdalarda
kullanılabileceği rapor edilmiştir (3).
İzolasyon ve İdentifikasyon
Gıdalarda düşük düzeyde bulunan etkenin izolasyon
oranını arttırmak amacıyla ön zenginleştirme ve selektif zenginleştirme uygulanmaktadır. En Muhtemel Sayı Tekniği’ne dayanan FDA (Food and Drug
Administration: Amerika Gıda ve İlaç Dairesi) metoduna göre; zenginleştirme aşamasında Enterobacteriaceae enrichment (EE) brot, katı besi yeri olarak
Violet Red Bile Glukoz (VRBG) agar, sarı pigment
oluşumunu görebilmek için Tripticase Soya Agar
(TSA) kullanılır. TSA’da oluşan sarı renkli kolonilere oksidaz ve diğer biyokimyasal identifikasyon
testleri uygulanır (12).
Kromojenik agar kullanılarak yapılan kültür
metoduna göre; 25 gr örnek 225 ml ön zenginleştirme sıvısı (10 µg vankomisin hidroklorid içeren
tamponlanmış peptonlu su) ile homojenize edilerek
37ºC’de 18±2 saat inkübe edilir. Bir mililitre ön
39
zenginleştirme süspansiyonu selektif zenginleştirme
besi yerlerine inokule edilir. İnkübasyon periyodu
sonunda 10’ar µl selektif zenginleştirme süspansiyonu, Enterobacter sakazakii isolation agar (ESIA;
44ºC 21±3 saat R&F® Enterobacter sakazakii Chromogenic Plating Medium (ESPM; 37ºC 24 saat) ve
Druggan-Forsythe-Iversen Medium (DFI; 37ºC 24
saat) gibi kromojenik agarlara geçilir. İnkübasyon
periyodu sonunda oluşan şüpheli koloniler (ESIA:
mavi, ESPM: siyah, DFI: yeşil), koyun kanlı agara
geçilir ve burada oluşan koloniler, ID 32E test veya
API 20E test sistemleri ile test edilmelerini takiben
PCR ile doğrulanır (4, 7, 16). Seo ve Brackett (24)
real-time PCR ile C. sakazakii’nin makromoleküler
operon sentezini hedefleyen primerler ve TaqMan
prob kullanarak, sulandırılmış bebek mamalarında
zenginleştirme uygulanmadan 100 kob/ml düzeyinde etkeni belirleyebilmişlerdir.
Korunma
C. sakazakii enfeksiyonlarından korunma kapsamında, hastanelerdeki bebek ünitelerinde ve evlerde hijyene önem verilmeli, etkenin paslanmaz çelik
yüzeylerde ve bu yüzeylerde oluşan biyofilmlerde
dezenfektanlara dirençli olması nedeniyle, tezgah
vb. temas yüzeylerinde etkili temizlik ve dezenfeksiyon uygulanmalıdır. C. sakazakii’nin silikon,
lateks, polikarbonat, paslanmaz çelik, cam ve polivinil klorid gibi materyallere tutunabilme özelliği
nedeniyle, biberon ve emzikler kaynar suda 5 dakika bekletilmeden kullanılmamalıdır. Bebek maması
hazırlama ve muhafaza aşamalarında ya da önceden
vakumlanmış anne sütünün muhafazası ve bebeğe
verilme aşamalarında hijyene dikkat edilmelidir.
Mama hazırlamada kaynamış su kullanılmalıdır. Her
öğünde sadece bebeğin tüketebileceği kadar mama
sulandırılmalı, tüketim öncesinde oda sıcaklığında
ya da buzdolabında bekleme süresi kısa olmalıdır.
Biberonla besleme aşamasında bebek mamalarına
ve/veya biberonla verilen anne sütüne laktoperoksidaz ilavesi koruyucu olabilir (5,16,20).
Kaynaklar
1. Amalaradjou MAR, Hoagland TA, Venkitanarayanan K,
(2009). Inactivation of Enterobacter sakazakii in reconstituted infant formula by trans-cinnamaldehyde. Int J Food
Microbiol. 129, 146-149.
2. Anonim, (2008). Türk Gıda Mevzuatı Devam Formülleri
Tebliği.Erişim:http://www.kkgm.gov.tr/TGK/Teblig/200853.html, Erişim tarihi: 15.01.2010.
40
3. Back SY, Jin HH, Lee SY, (2009). Inhibitory effect of organic acids against Enterobacter sakazakii in laboratory
media and liquid foods. Food Control, 20, 867-872.
4. Baumgartner A, Grand M, Liniger M, Iversen C, (2009).
Detection and frequency of Cronobacter spp. (Enterobacter
sakazakii) in different categories of ready-to-eat foods other
than infant formula. Int J Food Microbiol. 136, 189-192.
5. Beuchat LR, Kim H, Gurtler JB, Lin LC, Ryu JH, Richards GM, (2009). Cronobacter sakazakii in foods and factors affecting its survival, growth, and inactivation. Int J
6. Breeuwer P, Lardeau A, Peterz M, Joosten HM, (2003).
Desiccation and heat tolerance of Enterobacter sakazakii.
J Appl Microbiol. 95, 967-973.
7. Cawthorn DM, Botha S, Witthuhn RC, (2008). Evaluation
of different methods for the detection and identification of
Enterobacter sakazakii isolated from South African infant
formula milks and the processing environment. Int J Food
Microbiol. 127, 129-138.
8. Dancer GI, Mah JH, Rhee MS, Hwang IG, Kang DH,
(2009). Resistance of Enterobacter sakazakii (Cronobacter
spp.) to environmental stresses. J Appl Microbiol. 107,
1606-1614.
9. Edelson-Mammel SG, Buchanan RL, (2004). Thermal inactivation of Enterobacter sakazakii in rehydrated infant
formula. J Food Prot 67, 60-64.
10. Farmer III JJ, Asbury MA, Hickman FW, Brenner
DJ, the Enterobacteriaceae Study Group, (1980). Enterobacter sakazakii: A new species of “Enterobacteriaceae”
isolated from clinical specimens. Int J Syst Bacteriol. 30,
569-584.
11.FAO/WHO (Food and Agriculture Organization/World
Health Organization), (2004). Joint FAO/WHO workshop
on Enterobacter sakazakii and other microorganisms in
powdered infant formula: meeting report, MRA series 6.
February, 2-5, Geneva-Switzerland.
12. FDA (Food and Drug Administration), (2002). Isolation
and enumeration of Enterobacter sakazakii from dehydrated pawdered infant formula. Erişim: http://www.fda.gov/
Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm114665.
htm, Erişim tarihi: 25.01.2010.
13. Gurtler JB, Kornacki JL, Beuchat LR, (2005). Enterobacter sakazakii: A coliform of increased concern to infant health. Int J Food Microbiol. 104, 1-34.
14. Hammerman C, Kaplan M. (2006). Probiotics and neonatal intestinal infection. Curr Opin Infect Dis. 19, 277-282.
15. Iversen C, Forsythe S, (2003). Risk profile of Enterobacter
sakazakii, an emergent pathogen associated with infant
milk formula. Trends Food Sci Technol. 14, 443-454.
16. Iversen C, Lane M, Forsythe SJ, (2004). The growth profile, thermotolerance and biofilm formation of Enterobacter
sakazakii grown in infant formula milk. Lett Appl Microbiol. 38, 378-382.
17. Iversen C, Lehner A, Mullane N, Bidlas E, Cleenwerck
I, Marugg J, Fanning S, Stephan R, Joosten H, (2007).
The taxonomy of Enterobacter sakazakii: proposal of a
new genus Cronobacter gen. nov. and descriptions of
Cronobacter sakazakii comb. nov. Cronobacter sakazakii
subsp. sakazakii, comb. nov., Cronobacter sakazakii subsp.
malonaticus subsp. nov., Cronobacter turicensis sp. nov.,
Cronobacter muytjensii sp. nov., Cronobacter dublinensis
sp. nov. and Cronobacter genomospecies 1. BMC Evol
Biol. 17, 7-64.
18. Kim H, Ryu JH, Beuchat LR, (2006). Survival of Enterobacter sakazakii on fresh produce as affected by temperature, and effectiveness of sanitizers for its elimination. Int J
19. Lee JW, Oh SH, Byun EB, Kim JH, Kim JH, Woon JH,
Byun MW, (2007). Inactivation of Enterobacter sakazakii
of dehydrated infant formula by gamma-irradiation. Radiat
Phys Chem. 76, 1858-1861.
20. Lenati RF, O’Connor DL, Hébert KC, Farber JM, Pagotto FJ, (2008). Growth and survival of Enterobacter sakazakii in human breast milk with and without fortifiers as
compared to powdered infant formula. Int J Food Microbiol. 122, 171-179.
21. Lin LC, Beuchat LR, (2007). Survival of Enterobacter
sakazakii in infant cereal as affected by composition, water
activity, and temperature. Food Microbiol. 24, 767-777.
22. Nazarowec-White M, Farber JM, (1997). Thermal resistance of Enterobacter sakazakii in reconstituted driedinfant formula. Lett Appl Microbiol. 24, 9-13.
23. Pagotto FJ, Nazarowec-White M, Bidawid S, Farber
JM, (2003). Enterobacter sakazakii: infectivity enterotoxin
production in vitro and in vivo. J Food Prot. 66, 370-375.
24. Seo KH, Brackett RE, (2005). Rapid, specific detection of
Enterobacter sakazakii in infant formula using a real-time
PCR assay. J Food Prot. 68, 59–63.
Yazarlara Bilgi / Instructions for Authors
41
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi Yayım Koşulları
1. Dergi, TC Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Etlik Merkez Veteriner
Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü’nün hakemli, bilimsel
yayın organı olup, yılda iki defa yayımlanır. Derginin kısaltılmış
adı “Etlik Vet Mikrobiyol Derg” dir.
2. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’nde veteriner hekimlik
alanında yapılan, başka bir yerde yayımlanmamış olan orijinal bilimsel araştırmalar, güncel derleme, gözlem, kısa bilimsel çalışmalar ve enstitüden haberler yayımlanır. Derleme şeklindeki yazılar;
orijinal olması, en son yenilikleri içermesi, klasik bilgilerin tekrarı
olmaması durumunda kabul edilir. Derlemeyi hazırlayan yazarın, o
konuda ulusal ya da uluslararası düzeyde orijinal yayın ve araştırmalar yapmış olması koşulu aranır.
3. Türkçe ve İngilizce olarak hazırlanacak metinler 12 punto Times
New Roman yazı karakterinde, düz metin olarak, çift aralıklı ve
kenarlarda 30 mm boşluk bırakılarak, A4 formundaki beyaz kağıda
yazılmalıdır. Yazıların tamamı, şekil ve tablolar dahil olmak üzere
orijinal bilimsel araştırmalarda 16, derlemelerde 10, gözlemlerde 6
ve kısa bilimsel çalışmalarda 4 sayfayı geçmemelidir.
4. Microsoft Word formatındaki metin ile en az 300 dpi çözünürlükteki JPEG formatındaki resim/lerin tamamı bir CD’ye kopyalanarak; metin ise dört nüsha (sadece bir kopyasında yazar/lar ve
yazar/lara ait bilgilerin bulunduğu) olarak yayın kuruluna gönderilmelidir.
5. Türkçe orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları,
adresleri, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, İngilizce başlık, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular,
tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar sırası ile hazırlanmalıdır.
İngilizce orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları,
adresleri, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, Türkçe başlık, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular,
tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar şeklinde hazırlanmalıdır.
Kısa bilimsel çalışmaların ve derlemelerin başlık ve özet bölümleri
orijinal çalışma formatında, bundan sonraki bölümleri ise, derlemelerde; giriş, metin ve kaynaklar şeklinde, kısa bilimsel çalışmalarda
ise bölümlendirme yapılmadan hazırlanmalıdır.
6. Orijinal çalışmalar ve gözlemler aşağıdaki sıraya göre düzenlenerek yazılmalıdır.
Başlık, kısa, konu hakkında bilgi verici olmalı ve küçük harflerle
yazılmalıdır.
Yazar(lar)ın, ad(lar)ı küçük, soyad(lar)ı büyük harflerle yazılmalı
ve unvan belirtilmemelidir.
Özet, Türkçe ve İngilizce olarak, tek paragraf halinde ve en fazla
500 sözcük olmalıdır.
Anahtar kelimeler, alfabetik sıraya göre yazılmalı ve 5 sözcüğü
geçmemelidir.
Giriş, konu ile ilgili kısa literatür bilgisi içermeli, son paragrafında
çalışmanın amacı vurgulanmalı ve iki sayfayı geçmemelidir.
Materyal ve Metot, ayrıntıya girmeden, anlaşılır biçimde yazılmalıdır. Başlıklar kalın, alt başlıklar italik yazı tipiyle belirtilmelidir.
Bulgular bölümünde veriler, tekrarlama yapmadan açık bir şekilde
belirtilmelidir. Tablo başlıkları tablonun üstünde, şekil başlıkları
ise şeklin altında belirtilmelidir.
Tartışma ve Sonuç bölümünde, araştırmanın sonucunda elde edilen bulgular, diğer araştırıcıların bulguları ile karşılaştırılmalı ve
literatüre olan katkısı kısaca belirtilmelidir.
Teşekkür bölümü, gerekli görülüyorsa kaynaklardan hemen önce
belirtilmelidir.
Kaynaklar bölümünde, kaynaklar listesi alfabetik ve kronolojik
olarak sıralanmalı ve numaralanmalıdır. Metin içerisindeki kaynak,
yazar soyadı yazılıp sıra numarası ile; cümle sonunda ise sadece
sıra numarası ile parantez içerisinde yazılmalıdır. Cümle sonunda
birden çok kaynak belirtilecek ise kaynak numaraları küçükten bü-
yüğe doğru sıralanmalıdır. Metin içerisinde ikiden çok yazarlı kaynak kullanımlarında ilk yazarın soyadı yazılmalı diğer yazarlar ise
“ve ark.” (İngilizce metinlerde “et al.”) kısaltması ile belirtilmelidir. Dergi adlarının kısaltılmasında “Periodical Title Abbreviations:
By Abbreviation” son baskısı esas alınmalıdır. Kaynaklar listesinde
yazar(lar)ın aynı yıla ait birden fazla yayını varsa, yayın tarihinin
yanına “a” ve “b” şeklinde belirtilmelidir.
Kaynak yazımı ve sıralaması aşağıdaki gibi yapılmalıdır;
Süreli Yayın:
Dubey JP, Lindsay DS, Anderson ML, Davis SW, Shen SK,
(1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201 (5), 709-713.
Yazarlı Kitap:
Fleiss Jl, (1981). Statistical methods for rates and proportions.
Second edition. New York: John Willey and Sons, p.103.
Editörlü Kitap:
Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of
Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IRL Press,
p.37.
Editörlü Kitapta Bölüm:
Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc,
San Diego. p.248-256.
Kongre Bildirileri:
Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic
trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International
Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmirTurkey.
Tezler:
Aksoy E, (1997). Sığır Vebası hastalığının histolojik ve immunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. Doktora Tezi, AÜ
Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
Anonim:
Anonim, (2009). Contagious equine metritis. Erişim adresi: http://
www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdf, Erişim tarihi: 17.10.2009.
Peter AT (2009). Abortions in dairy cows. Erişim adresi: http://
www.wcds.afns.ualberta.ca.htm, Erişim tarihi: 14.11.2009.
Yazışma adresi, çok yazarlı çalışmalarda yazışma adresi olarak
yazarlardan sadece birinin adı/soyadı, adresi ve e-posta adresi çalışmanın sonunda belirtilmelidir.
7. Latince cins ve tür isimleri italik yazı tipi ile yazılmalıdır. Tüm
ölçüler SI (Systeme Internationale)’ye göre verilmelidir.
8. Dergide yayımlanmak üzere gönderilen makaleler tüm yazarlar
tarafından imzalanan “Yayın Hakkı Devri Sözleşmesi” ve başvuruya ilişkin bir dilekçe ile birlikte gönderilmelidir. Yayımlanması
uygun görülen çalışmalar, istendiğinde Yayım Komitesi’nin basıma
ilişkin kararı, yazar(lar)ına bildirilir.
9. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’nde yayımlanacak olan,
hayvan deneylerine dayalı bilimsel çalışmalarda “Etik Kurul Onayı
Alınmıştır” ifadesi aranır.
10. Gönderilen yazıların basım düzeltmeleri orijinal metne göre yapıldığından, yazıların her türlü sorumluluğu yazarlara aittir.
11. Ürünlerin ticari adları ile karşılaştırılmalarına yönelik araştırmalar derginin ilgi kapsamı dışındadır.
12. Araştırmaya konu olan maddelerin ve ürünlerin ticari adları
kullanılmamalıdır.
13. Şayet varsa araştırmanın desteklendiği kurum adı ve proje numarası belirtilmelidir.
14. Dergiye gönderilen yazılar geliş tarihine göre yayımlanır.
15. Yayımlanmayan yazılar, yazarına iade edilmez.
42
Journal of Etlik Veterinary Microbiology Publication Conditions
1. The Journal is a refereed, scientific publication of Turkish Republic of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Directorate
of Etlik Central Veterinary Control and Research Institute and is
published two issues in a year. The abbreviation of the journal is “J
Etlik Vet Microbiol”.
2. In the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, original research
articles, actual reviews, case reports, short communications on the
issue of veterinary medicine whose one part or whole have not been
published in any other place before, and news from the institute
are published. The review articles will be accepted only if they are
original, actual and not repeating the classical knowledge. The author of the review is asked to possess original publications or researches on the subject at national or international levels.
3. Manuscripts that will be prepared in Turkish and English should
be typed as a full text, on A4 paper with 12 pt, in Times New Roman typing character, double-spaced and with 30 mm space in both
sides of the paper. Manuscripts including figures and tables should
not exceed 16 pages for original research articles, 10 pages for reviews, 6 pages for case reports and 4 pages for short communications.
4. Manuscript written in Microsoft Word format and figures in
JPEG format at minimum 300 dpi resolution should be sent in one
CD. Also four copies of manuscript [only one copy must include
the name(s) and information about author(s)] should be sent to the
edition board.
5. Original research articles and case reports should include in following rank: title, name(s) of the author(s), their addresses, abstract
and key words in English, title, abstract and key words in Turkish,
introduction, material and method, findings, discussion and conclusion, acknowledgements and references. In short communications
and reviews, divisions except summaries should be omitted.
6. Original research articles and case reports should be arranged
and composed as in the following.
Title should be brief, explanatory and written in small caps.
Explanation(s) about the study should be written as footnotes.
Author(s) should be mentioned by their names and surnames; their
surnames should be written in capital letters and author(s) title
should not be mentioned.
Summary should be in Turkish and English, single paragraph and
composed of at most about 500 words.
Key Words should be written in alphabetical order and should not
exceed 5 words.
Introduction not exceeding two pages should include a short review of the literature related with the subject and in the end paragraph; the aim of the study should be mentioned.
Material and Method should be written in an essential and comprehensible manner without getting into details. Subtopics should
be mentioned first in bold and after in italic type.
Findings should be shortly explained and data should not be repeated within the text. Legends should be indicated at the top of
each table, whereas should be indicated at the bottom of each figure
and print. Vertical lines are not allowed in tables.
Discussion and Conclusion must include the evaluation and comparison of results with other researchers’ findings. The study’s
contributions to the existing literature should also be explained
briefly.
Acknowledgements must be indicated before references if necessary.
References should be listed alphabetically and chronologically by
numbers. In the body of text, reference must be shown by author’s
surname and list number or only by list number within parenthesis. If there is more than one reference that refers to the same issue, these should be arranged by smallest to biggest reference list
numbers at the end of sentence. If the reference is more than two
authors, the surname of the first author should be written and other
authors should be mentioned with the abbreviation of “et al.”. For
the abbreviation of journals, the latest edition of the “Periodical
Title Abbreviations: By Abbreviation” should be taken as basis. If
the author(s) have more than one publication within the same year,
besides the publication date, it should be mentioned as “a” and “b”
in the list of references.
The writing of the references and their alignment should be as in
the following examples.
For articles:
Dubey JP, Lindsay DS, Anderson ML, Davis SW, Shen SK,
(1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201 (5), 709-713.
For books:
Fleiss Jl, (1981). Statistical methods for rates and proportions.
Second edition. New York: John Willey and Sons, p.103.
For edited books:
Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of
Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IRL Press,
p.37.
For chapter in edited books:
Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc,
San Diego. p.248-256.
For congress papers:
Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic
trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International
Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmirTurkey.
For dissertations:
Aksoy E, (1997). Sığır Vebası hastalığının histolojik ve İmmunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. PhD Thesis, Ankara
University Institute of Health Sciences, Ankara.
Corresponding address, in multiple-author studies, as a correspondence address, only one of the authors’ name/surname, address
and e-mail should be mentioned at the end.
7. Genus and species names in Latin should be written in italic. All
measures should be given according to the SI (Systeme Internationale) units.
8. The articles that are sent to be published in the journal should be
sent with a covering letter and “Publication Rights Transfer Agreement” signed by all of the authors. The selected articles for the
publication, and if asked for, the decision of the editorial committee concerning the publication, are declared to the article’s author/
authors.
9. The wording of “Ethical Commission Permission is obtained”
should appear in scientific studies based on animal experiments,
which will be published in the Journal of Etlik Veterinary Microbiology.
10. As the edition of the sent articles are done in accordance with
the original text, all responsibility of the articles bear on the authors.
11. Researches that aim at comparisons of the products with their
commercial names are out of the journal’s theme scope.
12. The trade marks of materials and products that are subject of the
research should not be mentioned.
13. If the research is supported by a foundation, name of the foundation and project number must be mentioned.
14. The articles that are sent to the journal are published in line with
their coming date.
15. Unpublished papers are not returned to their author.
43
Yayın Hakkı Devri Sözleşmesi
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi - Ankara
Aşağıda başlığı bulunan ve yazarları belirtilen makalenin tüm sorumluluğu Etlik Veteriner Mikrobiyoloji
Dergisi Yayın Komisyonu Başkanlığı’na ulaşıncaya kadar yazar/larına aittir.
Yayının adı: ......................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Yazar/ların ad/ları: ...........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Aşağıda isim ve imzaları bulunan yazarlar; yayınlamak üzere gönderdikleri makalenin orijinal olduğunu,
daha önce başka bir dergiye yayınlanmak üzere gönderilmediğini ve kısmen ya da tamamen yayınlanmadığını, gerekli düzeltmelerle birlikte her türlü yayın hakkının, yazının yayımlanmasından sonra Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’ne devrettiklerini kabul ederler. Yayımlanmak üzere gönderilen bu makalenin
tüm sorumluluğunu da yazar/lar üstlenmektedir.
Yukarıdaki makalenin tüm hakları Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’ne devredilmiştir.
Yazar ad/ları
İmza
Tarih
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Yazışma Adresi: ...............................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Copyright Release
Journal of Etlik Veterinary Microbiology Ankara - TURKEY
The undersigned authors release Journal of Etlik Veterinary Microbiology from all responsibility concerning the manuscript entitled;
Title of paper: . .................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Authors names: ................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Upon its submission to the publishing commission of the Journal of Etlik Veterinary Microbiology.
The undersigned author/s warrant that the article is original, is not under consideration by another journal,
has not been previously published or that if has been published in whole or in part, any permission necessary to publish it in the above mentioned journal has been obtained and provided to the Journal of Etlik
Veterinary Microbiology. We sign for and accept responsibility for releasing this material.
Copyright to the above article is hereby transferred to the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, effective upon acceptance for publication.
To be signed by all author/s
Authors names
Signature
Date
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Correspondence Address: ................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
44

21 Number: 1 2010 2010_1

Transkript

Benzer belgeler

BİR HASTA BLOĞUNDAN ALINTI: Periferiknöropati kontrolü için

Cilt/Volume 22 Sayı/Number 1 2011 2011_1

Salmonella

Prospektüs Sadece Hayvan Sağlığında Kullanılır VETFOS

22 Number: 2 2011 2011_2

23 Number: 1 2012 2012.1

Etlik-c24s1 - Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlükleri

Volume 25 Number 1 2014 - Veteriner Kontrol Enstitüsü

2012-2 - Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlükleri

18 Number: 1-2 2007 2007

Baş(saç)biti çocuklar arasında hızlı birşekilde

Alban 25 İzolban 25 Baron Seminal 25 Autoban 25 Catamaran 25

Volume 25 Number 2 2015 - Veteriner Kontrol Enstitüsü

dİyabet ve vİtamİn D - Türk Diyabet Cemiyeti

Elif

Burcu

Oturum Programı

2008 - Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlükleri