Cilt/Volume 22 Sayı/Number 1 2011 2011_1

Transkript

I
AYVANCIL
IK
B
I•
• GID
H
VE
IĞ
NL
KA
M
RI
A
A,
TA
ISSN 1016-3573
1921
ETLİK VETERİNER KONTROL MERKEZ
ARAŞTIRMA ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ
ANKARA
Test
AB-0048-T
ETLİK VETERİNER
MİKROBİYOLOJİ
DERGİSİ
JOURNAL OF ETLIK VETERINARY MICROBIOLOGY
ANKARA – TURKEY
Cilt/Volume 22 ♦ Sayı/Number 1 ♦ 2011
II
III
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi
Cilt/Volume 22 ♦ Sayı/Number 1 ♦ 2011
Journal of Etlik Veterinary Microbiology
Yılda iki kez yayımlanır / Published two times per year
ISSN 1016-3573
Sahibi
Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Adına
Dr. Nahit Yazıcıoğlu
Enstitü Müdürü
Editörler Kurulu / Editorial Board
Adres / Address
Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü
Baş Editör / Editor-in Chief
06020 Etlik – Ankara / TÜRKİYE
Dr. Nahit Yazıcıoğlu
Tel : 90 (312) 326 00 90 (10 hat)
Faks : 90 (312) 321 17 55
Editör Yardımcıları / Co-Editors *
Dr. Erhan Akçay
URL : http://www.etlikvet.gov.tr/yayinlar.htm
Uzm. Yıldız Ayaz
E-posta : [email protected] / [email protected]
Dr. Asiye Dakman
Dr. Arife Ertürk
Dr. Uğur Küçükayan
Dr. Yavuz Ulusoy
Dr. Armağan Erdem Ütük
Uzm. M. Kadri Yavuz
IV
Danışma Kurulu / Advisory Board *
Prof. Dr. Mehmet Akan
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Mükremin Özkan Arslan Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Levent Aydın
Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Nazmi Çetin
Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Kadir Semih Gümüşsoy
Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Abdullah İnci Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Oktay Keskin Harran Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Şükrü Kırkan
Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Ergün Köroğlu Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Aykut Özkul Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Meltem Şireli Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Mehmet Tolga Tan
Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Hülya Türütoğlu
Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Hakan Yardımcı
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
* İsimler soyada göre alfabetik dizilmiştir ve bu sayıda görev alanlar yazılmıştır.
ULAKBİM Yaşam Bilimleri ve Türkiye Atıf Dizini veritabanları kapsamında bulunan “çift hakemli” bir
dergidir.
Copyright © Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi 2011, Her hakkı saklıdır / All rights reserved
Basım Tarihi / Publishing Date: Temmuz / July 2011, Baskı adedi / Circulation: 500
Tasarım ve Baskı / Printing
M
MEDİSAN
Medisan Yayinevi Ltd.Şti.
Çankırı Cad. 45 / 347 Ulus - Ankara, Türkiye
Tel : +90 312 311 24 26 – 311 00 57
V
İçindekiler / Contents
Araştırma Makaleleri / Research Articles Sayfa /Page
Üzüm çekirdeği ekstraktının rumen mikroorganizmalarının fermantasyon aktivitesi üzerine in vitro etkileri
Effects of grape seed extract on in vitro fermentation activity of the rumen microorganisms
Hakan Öztürk, Ahu Demirtaş, Yasemin Salgırlı, Öğünç Meral, İlksin Pişkin, Bahri Emre, Ulvi Reha Fidancı ............................... 1
Koyunlarda intravajinal sünger uygulamasına bağlı vajinitis olgularından izole edilen aerobik bakteriler ve antibiyotik
duyarlılıkları
Aerobic bacteria and their antibiotic susceptibility of sheep with vaginitis due to intravaginal sponges application
Osman Yaşar Tel ................................................................................................................................................................................ 7
Varroosis ve nosemosis üzerine retrospektif bir çalışma
A retrospective study on varroosis and nosemosis
Armağan Erdem Ütük, F.Çiğdem Pişkin, Ahmet Deniz, İbrahim Balkaya ...................................................................................... 11
Attenue mavidil serotip-4 aşısının farklı stabilizatörler ile üretilmesi
Production of attenuated live bluetongue serotype-4 vaccine with different stabilizers
Ahmet Burak Güngör, Özden Kabaklı, Elvin Çalışkan ................................................................................................................... 16
Kedi ve köpeklerden izole edilen dermatofit etkenlerinin retrospektif değerlendirilmesi
Retrospective evolution of dermatophytes isolated from cats and dogs
Orkun Babacan, Bülent Baş, H. Kaan Müştak, Özlem Şahan, Oya Tekin, Ebru Torun .................................................................. 23
Sığırların doğal kene enfestasyonlarında bazı sentetik pyrethroid’lerin etkisi
Efficacy of some synthetic pyrethroids against ticks in naturally infested cattle
A. Ender Güleğen, A. Onur Girişgin, Serkan Bakırcı, Bayram Şenlik, Levent Aydın .................................................................... 27
İnaktif mavidil serotip 4 aşısı üretimi................................................................................................................................................
Production of inactivated serotype 4 bluetongue vaccine
Özden Kabaklı, A.Burak Güngör, Elvin Çalışkan, Nedret Çelik, İlkay Demirhan, Halil Erol, Hasan Keskin, Hasan Yurdakul . .. 32
Derleme / Review
Tavuk dışkılarından Salmonella etkenlerinin konvansiyonel ve moleküler yöntemlerle teşhisi
Detection of Salmonella from chicken faeces by conventional and molecular methods
Orkun Babacan ................................................................................................................................................................................ 39
VI
Yazarlara Bilgi / Instructions for Authors
VII
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi Yayım Koşulları
1. Dergi, T.C. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü’nün hakemli,
bilimsel yayın organı olup, yılda iki defa yayımlanır. Derginin kısaltılmış adı “Etlik Vet Mikrobiyol Derg” dir.
2. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’nde veteriner hekimlik
alanında yapılan, başka bir yerde yayımlanmamış olan orijinal bilimsel araştırmalar, güncel derleme, gözlem, kısa bilimsel çalışmalar ve enstitüden haberler yayımlanır. Derleme şeklindeki yazılar;
orijinal olması, en son yenilikleri içermesi, klasik bilgilerin tekrarı
olmaması durumunda kabul edilir. Derlemeyi hazırlayan yazarın, o
konuda ulusal ya da uluslararası düzeyde orijinal yayın ve araştırmalar yapmış olması koşulu aranır.
3. Türkçe ve İngilizce olarak hazırlanacak metinler 12 punto Times
New Roman yazı karakterinde, düz metin olarak, çift aralıklı ve
kenarlarda 30 mm boşluk bırakılarak, A4 formundaki beyaz kağıda
yazılmalıdır. Yazıların tamamı, şekil ve tablolar dahil olmak üzere
orijinal bilimsel araştırmalarda 16, derlemelerde 10, gözlemlerde 6
ve kısa bilimsel çalışmalarda 4 sayfayı geçmemelidir.
4. Microsoft Word formatındaki metin ile en az 300 dpi çözünürlükteki JPEG formatındaki resim/lerin tamamı bir CD’ye kopyalanarak; metin ise dört nüsha (sadece bir kopyasında yazar/lar ve
yazar/lara ait bilgilerin bulunduğu) olarak yayın kuruluna gönderilmelidir.
5. Türkçe orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları,
adresleri, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, İngilizce başlık, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular,
tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar sırası ile hazırlanmalıdır.
İngilizce orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları,
adresleri, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, Türkçe başlık, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular,
tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar şeklinde hazırlanmalıdır.
Kısa bilimsel çalışmaların ve derlemelerin başlık ve özet bölümleri
orijinal çalışma formatında, bundan sonraki bölümleri ise, derlemelerde; giriş, metin ve kaynaklar şeklinde, kısa bilimsel çalışmalarda
ise bölümlendirme yapılmadan hazırlanmalıdır.
6. Orijinal çalışmalar ve gözlemler aşağıdaki sıraya göre düzenlenerek yazılmalıdır.
Başlık, kısa, konu hakkında bilgi verici olmalı ve küçük harflerle
yazılmalıdır.
Yazar(lar)ın, ad(lar)ı küçük, soyad(lar)ı büyük harflerle yazılmalı
ve unvan belirtilmemelidir.
Özet, Türkçe ve İngilizce olarak, tek paragraf halinde ve en fazla
500 sözcük olmalıdır.
Anahtar kelimeler, alfabetik sıraya göre yazılmalı ve 5 sözcüğü
geçmemelidir.
Giriş, konu ile ilgili kısa literatür bilgisi içermeli, son paragrafında
çalışmanın amacı vurgulanmalı ve iki sayfayı geçmemelidir.
Materyal ve Metot, ayrıntıya girmeden, anlaşılır biçimde yazılmalıdır. Başlıklar kalın, alt başlıklar italik yazı tipiyle belirtilmelidir.
Bulgular bölümünde veriler, tekrarlama yapmadan açık bir şekilde
belirtilmelidir. Tablo başlıkları tablonun üstünde, şekil başlıkları
ise şeklin altında belirtilmelidir.
Tartışma ve Sonuç bölümünde, araştırmanın sonucunda elde edilen bulgular, diğer araştırıcıların bulguları ile karşılaştırılmalı ve
literatüre olan katkısı kısaca belirtilmelidir.
Teşekkür bölümü, gerekli görülüyorsa kaynaklardan hemen önce
belirtilmelidir.
Kaynaklar bölümünde, kaynaklar listesi alfabetik ve kronolojik
olarak sıralanmalı ve numaralanmalıdır. Metin içerisindeki kaynak,
yazar soyadı yazılıp sıra numarası ile; cümle sonunda ise sadece
sıra numarası ile parantez içerisinde yazılmalıdır. Cümle sonunda
birden çok kaynak belirtilecek ise kaynak numaraları küçükten bü-
yüğe doğru sıralanmalıdır. Metin içerisinde ikiden çok yazarlı kaynak kullanımlarında ilk yazarın soyadı yazılmalı diğer yazarlar ise
“ve ark.” (İngilizce metinlerde “et al.”) kısaltması ile belirtilmelidir. Dergi adlarının kısaltılmasında “Periodical Title Abbreviations:
By Abbreviation” son baskısı esas alınmalıdır. Kaynaklar listesinde
yazar(lar)ın aynı yıla ait birden fazla yayını varsa, yayın tarihinin
yanına “a” ve “b” şeklinde belirtilmelidir.
Kaynak yazımı ve sıralaması aşağıdaki gibi yapılmalıdır;
Süreli Yayın:
Dubey JP, Lindsay DS, Anderson ML, Davis SW, Shen SK,
(1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201 (5), 709-713.
Yazarlı Kitap:
Fleiss Jl, (1981). Statistical methods for rates and proportions.
Second edition. New York: John Willey and Sons, p.103.
Editörlü Kitap:
Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of
Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IRL Press,
p.37.
Editörlü Kitapta Bölüm:
Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc,
San Diego. p.248-256.
Kongre Bildirileri:
Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic
trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International
Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmirTurkey.
Tezler:
Aksoy E, (1997). Sığır Vebası hastalığının histolojik ve immunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. Doktora Tezi, AÜ
Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
Anonim:
Anonim, (2009). Contagious equine metritis. Erişim adresi: http://
www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdf, Erişim tarihi: 17.10.2009.
Peter AT (2009). Abortions in dairy cows. Erişim adresi: http://
www.wcds.afns.ualberta.ca.htm, Erişim tarihi: 14.11.2009.
Yazışma adresi, çok yazarlı çalışmalarda yazışma adresi olarak
yazarlardan sadece birinin adı/soyadı, adresi ve e-posta adresi çalışmanın sonunda belirtilmelidir.
7. Latince cins ve tür isimleri italik yazı tipi ile yazılmalıdır. Tüm
ölçüler SI (Systeme Internationale)’ye göre verilmelidir.
8. Dergide yayımlanmak üzere gönderilen makaleler tüm yazarlar
tarafından imzalanan “Yayın Hakkı Devri Sözleşmesi” ve başvuruya ilişkin bir dilekçe ile birlikte gönderilmelidir. Yayımlanması
uygun görülen çalışmalar, istendiğinde Yayım Komitesi’nin basıma
ilişkin kararı, yazar(lar)ına bildirilir.
9. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’nde yayımlanacak olan,
hayvan deneylerine dayalı bilimsel çalışmalarda “Etik Kurul Onayı
Alınmıştır” ifadesi aranır.
10. Gönderilen yazıların basım düzeltmeleri orijinal metne göre yapıldığından, yazıların her türlü sorumluluğu yazarlara aittir.
11. Ürünlerin ticari adları ile karşılaştırılmalarına yönelik araştırmalar derginin ilgi kapsamı dışındadır.
12. Araştırmaya konu olan maddelerin ve ürünlerin ticari adları
kullanılmamalıdır.
13. Şayet varsa araştırmanın desteklendiği kurum adı ve proje numarası belirtilmelidir.
14. Dergiye gönderilen yazılar geliş tarihine göre yayımlanır.
15. Yayımlanmayan yazılar, yazarına iade edilmez.
VIII
Journal of Etlik Veterinary Microbiology Publication Conditions
1. The Journal is a refereed, scientific publication of Turkish Republic of the Ministry of Food, Agriculture and Livestock, Directorate of Etlik Veterinary Control Central Research Institute and is
published two issues in a year. The abbreviation of the journal is “J
Etlik Vet Microbiol”.
2. In the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, original research
articles, actual reviews, case reports, short communications on the
issue of veterinary medicine whose one part or whole have not been
published in any other place before, and news from the institute
are published. The review articles will be accepted only if they are
original, actual and not repeating the classical knowledge. The author of the review is asked to possess original publications or researches on the subject at national or international levels.
3. Manuscripts that will be prepared in Turkish and English should
be typed as a full text, on A4 paper with 12 pt, in Times New Roman typing character, double-spaced and with 30 mm space in both
sides of the paper. Manuscripts including figures and tables should
not exceed 16 pages for original research articles, 10 pages for reviews, 6 pages for case reports and 4 pages for short communications.
4. Manuscript written in Microsoft Word format and figures in
JPEG format at minimum 300 dpi resolution should be sent in one
CD. Also four copies of manuscript [only one copy must include
the name(s) and information about author(s)] should be sent to the
edition board.
5. Original research articles and case reports should include in following rank: title, name(s) of the author(s), their addresses, abstract
and key words in English, title, abstract and key words in Turkish,
introduction, material and method, findings, discussion and conclusion, acknowledgements and references. In short communications
and reviews, divisions except summaries should be omitted.
6. Original research articles and case reports should be arranged
and composed as in the following.
Title should be brief, explanatory and written in small caps.
Explanation(s) about the study should be written as footnotes.
Author(s) should be mentioned by their names and surnames; their
surnames should be written in capital letters and author(s) title
should not be mentioned.
Summary should be in Turkish and English, single paragraph and
composed of at most about 500 words.
Key Words should be written in alphabetical order and should not
exceed 5 words.
Introduction not exceeding two pages should include a short review of the literature related with the subject and in the end paragraph; the aim of the study should be mentioned.
Material and Method should be written in an essential and comprehensible manner without getting into details. Subtopics should
be mentioned first in bold and after in italic type.
Findings should be shortly explained and data should not be repeated within the text. Legends should be indicated at the top of
each table, whereas should be indicated at the bottom of each figure
and print. Vertical lines are not allowed in tables.
Discussion and Conclusion must include the evaluation and comparison of results with other researchers’ findings. The study’s
contributions to the existing literature should also be explained
briefly.
Acknowledgements must be indicated before references if necessary.
References should be listed alphabetically and chronologically by
numbers. In the body of text, reference must be shown by author’s
surname and list number or only by list number within parenthesis. If there is more than one reference that refers to the same issue, these should be arranged by smallest to biggest reference list
numbers at the end of sentence. If the reference is more than two
authors, the surname of the first author should be written and other
authors should be mentioned with the abbreviation of “et al.”. For
the abbreviation of journals, the latest edition of the “Periodical
Title Abbreviations: By Abbreviation” should be taken as basis. If
the author(s) have more than one publication within the same year,
besides the publication date, it should be mentioned as “a” and “b”
in the list of references.
The writing of the references and their alignment should be as in
the following examples.
For articles:
Dubey JP, Lindsay DS, Anderson ML, Davis SW, Shen SK,
(1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201 (5), 709-713.
For books:
Fleiss Jl, (1981). Statistical methods for rates and proportions.
Second edition. New York: John Willey and Sons, p.103.
For edited books:
Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of
Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IRL Press,
p.37.
For chapter in edited books:
Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc,
San Diego. p.248-256.
For congress papers:
Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic
trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International
Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmirTurkey.
For dissertations:
Aksoy E, (1997). Sığır Vebası hastalığının histolojik ve İmmunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. PhD Thesis, Ankara
University Institute of Health Sciences, Ankara.
Corresponding address, in multiple-author studies, as a correspondence address, only one of the authors’ name/surname, address
and e-mail should be mentioned at the end.
7. Genus and species names in Latin should be written in italic. All
measures should be given according to the SI (Systeme Internationale) units.
8. The articles that are sent to be published in the journal should be
sent with a covering letter and “Publication Rights Transfer Agreement” signed by all of the authors. The selected articles for the
publication, and if asked for, the decision of the editorial committee concerning the publication, are declared to the article’s author/
authors.
9. The wording of “Ethical Commission Permission is obtained”
should appear in scientific studies based on animal experiments,
which will be published in the Journal of Etlik Veterinary Microbiology.
10. As the edition of the sent articles are done in accordance with
the original text, all responsibility of the articles bear on the authors.
11. Researches that aim at comparisons of the products with their
commercial names are out of the journal’s theme scope.
12. The trade marks of materials and products that are subject of the
research should not be mentioned.
13. If the research is supported by a foundation, name of the foundation and project number must be mentioned.
14. The articles that are sent to the journal are published in line with
their coming date.
15. Unpublished papers are not returned to their author.
IX
Yayın Hakkı Devri Sözleşmesi
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi - Ankara
Aşağıda başlığı bulunan ve yazarları belirtilen makalenin tüm sorumluluğu Etlik Veteriner Mikrobiyoloji
Dergisi Yayın Komisyonu Başkanlığı’na ulaşıncaya kadar yazar/larına aittir.
Yayının adı: ......................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Yazar/ların ad/ları: ...........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Aşağıda isim ve imzaları bulunan yazarlar; yayınlamak üzere gönderdikleri makalenin orijinal olduğunu,
daha önce başka bir dergiye yayınlanmak üzere gönderilmediğini ve kısmen ya da tamamen yayınlanmadığını, gerekli düzeltmelerle birlikte her türlü yayın hakkının, yazının yayımlanmasından sonra Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’ne devrettiklerini kabul ederler. Yayımlanmak üzere gönderilen bu makalenin
tüm sorumluluğunu da yazar/lar üstlenmektedir.
Yukarıdaki makalenin tüm hakları Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’ne devredilmiştir.
Yazar ad/ları
İmza
Tarih
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Yazışma Adresi: ...............................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Copyright Release
Journal of Etlik Veterinary Microbiology Ankara - TURKEY
The undersigned authors release Journal of Etlik Veterinary Microbiology from all responsibility concerning the manuscript entitled;
Title of paper: . .................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Authors names: ................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Upon its submission to the publishing commission of the Journal of Etlik Veterinary Microbiology.
The undersigned author/s warrant that the article is original, is not under consideration by another journal,
has not been previously published or that if has been published in whole or in part, any permission necessary to publish it in the above mentioned journal has been obtained and provided to the Journal of Etlik
Veterinary Microbiology. We sign for and accept responsibility for releasing this material.
Copyright to the above article is hereby transferred to the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, effective upon acceptance for publication.
To be signed by all author/s
Authors names
Signature
Date
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Correspondence Address: ................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
X
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22,Öztürk
1-6, 2011
1
H ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22,Araştırma
1-6, 2011 Makalesi / Research Article
Üzüm çekirdeği ekstraktının rumen mikroorganizmalarının fermantasyon
aktivitesi üzerine in vitro etkileri
Hakan ÖZTÜRK1, Ahu DEMİRTAŞ1, Yasemin SALGIRLI1, Öğünç MERAL2, İlksin PİŞKİN1,
Bahri EMRE1, Ulvi Reha FİDANCI2
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye, 2Ankara Üniversitesi Veteriner
Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye
1
Geliş Tarihi / Received: 04.02.2011, Kabul Tarihi / Accepted: 01.03.2011
Özet: Üzüm çekirdeği sahip olduğu fenolik bileşikler nedeniyle geniş bir yelpazede gram pozitif ve gram negatif bakteriler üzerine antimikrobiyal etkinlik göstermektedir. Bu araştırmanın amacı, Rumen Simülasyon Tekniğini (Rusitec)
kullanarak üzüm çekirdeği ekstraktının rumen mikroorganizmalarının fermantasyon aktivitesi üzerine etkilerini belirlemektir. Rusitec sisteminde hacimleri 1000 ml olan sekiz adet fermenter kullanıldı. Her bir fermenterde günlük olarak
5 g arpa samanı ve 5 g konsantre yemden oluşan bir deneme yemi karışımı inkübe edildi. Araştırma 12 gün sürdü. Altı
günlük adaptasyon fazından sonra üzüm çekirdeği ekstraktı ilgili fermenterlere 0, 15, 150 ve 1500 mg/gün dozlarında
ilave edildi. Üzüm çekirdeği ekstraktının artan dozları ruminal pH, propiyonat üretimi, asetatın propiyonata oranı, toplam protozoon sayısı, amonyak azotu (NH3-N) konsantrasyonu ve yem kuru maddesi sindirilebilirliğinde istatistiksel
olarak anlamlı bir değişikliğe neden olmadı. Hiçbir ilavenin yapılmadığı kontrol fermenterleri ile karşılaştırıldığında
üzüm çekirdeğinin 1500 mg/gün dozu, toplam uçucu yağ asidi (UYA), asetat ve bütiratın günlük üretimlerinde artışa
yol açtı (p < 0,05). Sonuç olarak, bu araştırma koşullarında üzüm çekirdeği ekstraktının rumen mikroorganizmalarının
fermantasyon aktivitesi üzerine minimal düzeyde etki ettiği gözlendi.
Anahtar sözcükler: Fermantasyon, rumen, üzüm çekirdeği ekstraktı.
Effects of grape seed extract on in vitro fermentation activity of the rumen microorganisms
Summary: Grape seeds have phenolic compounds with wide-spectrum antimicrobial activity against gram-positive and
gram-negative bacteria. The objective of this study was to investigate the effects of grape seed extract on fermentation
activity of rumen microorganisms using the Rumen Simulation Technique (Rusitec). The rusitec system was equipped
with eight fermenters, each with a capacity of 1000 ml. Each fermenter received daily 5 g barley straw and 5 g concentrate. The experiment lasted 12 days. After an adaptation period of 6 days, grape seed extract was added to the respective fermenters at levels of 0, 15, 150 or 1500 mg/day. Increasing level of grape seed extract had no effect on ruminal
pH, propionate production, acetate/propionate ratio, total protozoa number, NH3-N concentration or dry matter digestibility. However, the addition of 1500 mg grape seed extract increased (p < 0.05) the daily production of total volatile
fatty acid, acetate and butyrate when compared with the unsupplemented control fermenters. In conclusion, under the
conditions of this study, the addition of grape seed extract had only minor effects on the fermentation activity of rumen
microorganisms.
Key words: Fermentation, grape seed extract, rumen.
Giriş
Rumendeki mikrobiyal ekosistem üzerine araştırmalar yapan bilim insanları rumendeki mikrobiyal
florayı değiştirerek hayvan verimliliğini artırmayı
amaçlamaktadırlar. Bu amaçla, yaklaşık 30 yıldır
monensin, lasalosid ve laidlomisin propiyonat gibi
iyonofor grubu antibiyotikler başarılı bir şekilde
kullanılagelmiştir. Bu antibiyotikler genel olarak
gram pozitif bakterilerde hücre zarını etkileyerek
antimikrobiyal etkinlik gösterirler. Gram pozitif
bakteriler, gram negatiflere kıyasla rumende daha
fazla amonyak, hidrojen ve laktik asit üretirler. Bu
bakımdan gram pozitif bakterilerin baskılanması
yem enerjisinin ruminant tarafından daha verimli
kullanılmasına aracılık eder (21). Antibiyotiklerin
hayvansal üretim sürecinde büyütme faktörü olarak
kullanımı, bakterilerde antibiyotiklere karşı dirençlilik oluşturacağı ve hayvansal ürünlerde kalıntı
bırakacağı gerekçesiyle 1 Ocak 2006 tarihinden
itibaren Avrupa Birliği’ne üye ülkelerde yasaklanmıştır (18). Keza yine Dünya Sağlık Örgütü (WHO)
ile Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü (FAO)
1997’den beri antibiyotiklerin büyütme faktörü
Yazışma adresi / Correspondance: Hakan Öztürk, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı, 06110,
Dışkapı, Ankara, Türkiye. E-posta: [email protected]
2
Öztürk H ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 1-6, 2011
olarak kullanımlarının potansiyel tehlikesine dikkat çekmektedirler (10). Bu nedenle antibiyotiklere
alternatif olabilecek daha güvenli antimikrobiyal
maddeler üzerine yoğun bir ilgi oluşmuştur.
Üzüm (Vitis vinifera) çekirdeği (+)-kateşinler,
(-)-epikateşin, (-)-epikateşin-3-O-galat ve dimerik,
trimerik, tetramerik prosiyanidinler gibi monomerik fenolik bileşikler içermekte ve sahip olduğu bu
bileşikler sayesinde antimutajenik, antiviral, antioksidan özellikler göstermektedir (6). Yine yapılan
araştırmalarda üzüm çekirdeğinin geniş bir yelpazede gram pozitif ve gram negatif bakterilere karşı antibakteriyel etkinlik gösterdiği belirlenmiştir
(15). Ancak üzüm çekirdeği ekstraktının rumendeki
mikrobiyal floranın fermantasyon aktivitesi üzerine
etkileri ile ilgili yeterli bilgi mevcut değildir.
Bu araştırmanın amacı, yarı-sürekli bir in vitro
rumen tekniği olan Rusitec sistem ile üzüm çekirdeği ekstraktının artan dozlarına karşı rumen mikroorganizmalarının gösterdiği yanıtı temel fermantasyon parametrelerini belirleyerek ortaya koymaktır.
zaman 2 adet yem kesesi bulunduruldu ve bunlar
48 saat fermantasyona bırakıldı. Yem keselerinin
değişimi sırasında anaerobik şartların devamı için
fermenterlere CO2 gazı uygulandı. İn vitro inkübasyonun mümkün olduğunca in vivo rumen şartlarına
benzemesi için Rusitec sistemin fermenterleri sürekli 39°C’lik sabit sıcaklıkta tutuldu ve Tablo 2’de
bileşimi verilen, pH’sı 7,40 ve ozmolalitesi 293
mosmol/l olan suni tükürük (tampon solüsyon) ile
sıvı döngüsü (liquid turnover) sağlandı. Elektrikli
motorlar yardımıyla fermenterlerin içindeki delikli
iç kaplara dakikada 6 kez piston hareketi yaptırılarak rumen kontraksiyonları taklit edildi ve Rusitec
fermenterlerindeki katı ve sıvı fazlar arasında değişim sağlandı. Fermentasyon gazları fermenterlere
bağlı gaz keselerinde ve fermenterlerden uzaklaşan
rumen sıvıları ise kuru buza yerleştirilmiş erlenmayerlerde toplandı.
Tablo 1. Deneme yeminin kimyasal bileşimi.
Besin Maddeleri
Arpa samanı
(%)
Konsantre yem
(%)
Materyal ve Metot
Kuru madde
92
91
İnkübasyon tekniği: Araştırmada yarı-sürekli kapalı bir inkübasyon metodu olan Rusitec (Rumen
Simulation Technique) tekniği Czerkawski ve
Breckenridge’in (11) tanımladığı şekilde uygulandı.
Rusitec sisteminde hacimleri 1000 ml olan 8 adet
fermenter kullanıldı. Bu fermenterlerde inokulum
olarak kesimhanede kesilmiş canlı ağırlıkları yaklaşık 400 kg olan iki sığırdan elde edilen rumen
içerikleri kullanıldı. Rumen içerikleri yaklaşık 30
dakikada termo-kaplar içerisinde laboratuara ulaştırıldı. Donör hayvanlar kesim öncesi en az üç hafta
boyunca günde 1,8 kg arpa samanı ve 7,2 kg konsantre yem ile beslendiler. Bu rasyon aynı zamanda
Rusitec sisteminde de deneme yemi olarak kullanıldı. Tablo 1’de deneme yeminin kimyasal bileşimi
verilmiştir. İki sığırdan alınan taze rumen içerikleri
laboratuarda karıştırıldıktan sonra 3 katlı steril gazlı
bezden süzülerek sıvı ve katı fraksiyonlarına ayrıldı. Çalışmanın ilk günü taze katı rumen içeriğinin
80 gramı ve 5 g arpa samanı ile 5 g konsantre yemden oluşan deneme yemi karışımı, 150 µm por genişliğine sahip 2 adet naylon keseye konuldu. Bu iki
kese Rusitec fermenterlerindeki delikli iç kaplara
yerleştirildi. Katı rumen içeriği bulunan naylon kese
24 saat sonra deneme yemi karışımı içeren başka
bir kese ile değiştirildi. Sistem fermenterlerinde her
Ham protein
4
15
Ham yağ
1
3
Ham selüloz
31
13
Ham kül
7
9
Tablo 2. Tampon solüsyonun kimyasal bileşimi.
Kimyasallar
mmol/l
NaCl
28,00
KCl
7,69
CaCl2.2H2O
0,22
MgCl2.6H2O
0,63
NH4Cl
5,00
Na2HPO4.12H2O
10,00
NaH2PO4.H2O
10,00
NaHCO3
97,90
Deney kurgusu: Araştırma 12 gün sürdü ve bu
süreçte Rusitec sisteminde 8 fermenter eşzamanlı
olarak çalıştırıldı. Bu sürenin ilk 6 günü adaptasyon
fazı olup bu fazda rumen mikroorganizmalarının in
vitro şartlara alışması sağlandı. İkinci 6 günlük süre
(7-12. günler) araştırmanın deneme fazını oluşturdu. Bu fazda Rusitec sistemin 8 fermenteri 4 gruba
ayrıldı. İlk iki fermentere günde 15 mg, ikinci iki
fermentere günde 150 mg ve üçüncü iki fermentere
ise günde 1500 mg üzüm çekirdeği ekstraktı ilave
edildi. Son iki fermentere hiçbir ilave yapılmayıp
kontrol fermenterleri olarak kullanıldı. Araştırmada
ticari bir firmadan elde edilen ve gramında 66,7 mg
fenolik madde içeren üzüm çekirdeğinin katı ekstraktı kullanıldı.
Numune toplanması ve analizler: Araştırmanın
deneme fazı boyunca her gün fermenterlerdeki rumen sıvılarının pH değerleri bir pH elektrotu (WD35801-00, Oakton) ve bağlı olduğu pH metre (Ion 6,
Acorn series, Oakton) yardımıyla ölçüldü. Rumen
sıvılarının toplandığı erlenmayerlerden NH3-N ve
UYA’ların miktarlarını belirlemek için numuneler
alındı. NH3-N analizi için alınan rumen sıvısı örnekleri doğrudan -20°C’ye konulurken, UYA’ların
analizi için alınan 5’er ml rumen sıvıları, 12 N
H2SO4’den 90 µl eklendikten sonra - 20°C’ye konuldu.
NH3-N analizi için alınan numuneler 4°C’de
çözdürüldükten sonra NH3-N konsantrasyonu indofenol mavisi yöntemi ile spektrofotometrik olarak belirlendi (9). Bu yöntemde sodyum nitroprusit varlığında amonyak ve fenol sodyum hipoklorit
ile okside edilmekte ve mavi renkli bir kompleks
oluşturmaktadır. Oluşan mavi rengin yoğunluğu ise
numunedeki NH3-N konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Uçucu yağ asitleri için alınan numuneler yine
4°C’de çözdürüldükten sonra 30 dakika 13000 g’de
santrifüj edildi. Elde edilen süpernatantlar, gözenek
çapı 0,2 µm olan naylon filtrelerden geçirildi ve
20 µl sıvı HPLC sistemine (Dionex Summit P680,
ASI100, UVD170) enjekte edilerek 210 nm’de
okundu. HPLC sisteminde asetik, propiyonik ve bütirik asitlerin seperasyonu için Rezex ROA organik
asit kolonu (300x7,8 mm, Phenomenex) ve Rezex
ROA organik asit koruyucu kolonu (50x7,8 mm,
Phenomenex) kullanıldı. Mobil faz olarak 0,005 M
H2SO4 kullanıldı. Kolon ısısı 60°C’de sabit tutularak
akış hızı dakikada 0,6 ml olarak ayarlandı. Asetik
asit, propiyonik asit ve butirik asidin 50 mmol/l’lik
standartları kullanılarak kalibrasyon yapıldı ve Dionex Chromeleon yazılımı yardımıyla integrasyon
yapılarak sonuçlar elde edildi (19). UYA’ların günlük üretim miktarları ise konsantrasyon değerlerinin
3
erlenmayerlerde biriken günlük miktarları ile çarpılmasıyla hesaplandı.
Protozoon sayısı için fermenterlerden alınan 1
ml rumen sıvısı 1 ml protozoon sayım çözeltisiyle
(0,6 g metil yeşili, 8 g NaCl, 100 ml %37’lik formaldehit 1 litrelik balon jojeye konarak üzeri 1000
ml çizgisine kadar distile su ile tamamlanır) karıştırıldı. Işık mikroskobu ve Fuchs-Rosenthal lamı
(derinlik: 0,2 mm, küçük kare alanı: 0,0625 mm2)
yardımıyla protozoon sayımı yapıldı (14).
Yem kuru maddesi sindirilebilirlik oranı yem
maddelerinin fermantasyon öncesi ve sonrası içerdikleri kuru madde miktarları belirlenerek hesaplandı. Bunun için fermantasyona bırakılmamış yem
numunesinin nemi 60°C’lik etüvde 48 saat bekletilerek uzaklaştırıldı ve kuru madde miktarı belirlendi. Rusitec sisteminde 48 saat fermantasyona bırakılan yem numunelerinin kuru madde miktarları yine
aynı biçimde 60°C’lik etüvde 48 saat bekletildikten
sonra tartılarak bulundu. Kuru madde miktarları
arasındaki fark sindirilebilirlik oranı olarak kabul
edildi (20).
İstatistiksel değerlendirme: İstatistiksel değerlendirme SigmaStat 3.1 (Jandel Scientific, Erkrath, Almanya) istatistik paket programı kullanılarak yapıldı. Çalışmadan elde edilen veriler tek yönlü varyans
analizi (one-way ANOVA) ile analiz edildi. Varyans
analizi sonucunda gruplar arasında fark tespit edildiğinde, farkın hangi gruplar arasında olduğunu belirlemek için Duncan çoklu karşılaştırma testi uygulandı. P < 0,05 anlamlı olarak kabul edildi. Tablo
3’te sonuçlar aritmetik ortalama ± standart sapma
şeklinde verildi.
Bulgular
Tablo 3’te üzüm çekirdeğinin artan dozlarının ruminal mikrobiyal fermantasyonun temel parametreleri
üzerine olan etkileri görülmektedir. Üzüm çekirdeği
ekstraktının artan dozları ruminal pH, propiyonat
üretimi, asetatın propiyonata oranı (C2:C3), toplam protozoon sayısı, NH3-N konsantrasyonu ve
yem kuru madde sindirilebilirliğinde istatistiksel
bir değişime neden olmadı. Ancak üzüm çekirdeği
ekstraktının 1500 mg/gün dozu hiçbir ilavenin yapılmadığı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında toplam UYA, asetat ve bütiratın günlük üretim miktarlarında sırasıyla %11, %12 ve %22’lik artışlara (p <
0,05) yol açtı.
4
Tablo 3. Üzüm çekirdeği ekstraktının ruminal mikrobiyal fermantasyon parametreleri üzerine in vitro etkileri.
Uygulama grupları
Parametreler
0 mg
pH
15 mg
6,73±0,03
Toplam UYA (mmol/gün)
150 mg
6,74±0,04
1500 mg
6,73±0,03
6,70±0,04
23,32±1,99
23,78±3,06
22,33±1,40
25,85±2,37b
12,24±1,18a
12,64±1,81a
12,01±0,83a
13,73±1,28b
Propiyonat
7,29±0,78
7,13±0,88
6,61±0,60
7,45±0,89
Bütirat
a
3,79±0,52
a
4,01±0,56
a
3,70±0,36
4,63±0,48b
1,69±0.11
1,77±0.33
1,83±0,07
1,85±0,07
Toplam protozoon (x10 /ml)
2,86±0,90
3,28±1,10
3,75±1,00
3,44±0,86
NH3-N (mmol/l)
6,19±0,95
6,19±0,47
6,16±1,05
5,76±0,83
KMS (%)
49,92±4,25
50,24±6,75
46,45±4,58
45,91±3,18
Asetat
C2:C3
3
a
a
a
Aynı satırdaki farklı harfler istatistiksel farkı (p < 0,05) göstermektedir, değerler aritmetik ortalama ± standart sapmadır, C2:C3: asetatın propiyonata oranı, KMS: kuru madde sindirilebilirliği.
Tartışma ve Sonuç
Üzüm çekirdeği extraktı içerdiği fenolik bileşikler nedeniyle geniş bir yelpazede gram pozitif ve
gram negatif bakterilere karşı antibakteriyel etkinlik göstermektedir (15). Bu antimikrobiyal etkinlikten sorumlu asıl bileşenin galik asit (galat) olduğu
bildirilmiştir (22). Fenolik bileşikler antimikrobiyal
etkinliklerini bakteri hücresinde sitoplazmik membranın yapısını bozarak, protonların (H+) hücre dışına
çıkışını baskılayarak, aktif transport sürecinde iyon
hareketlerini engelleyerek ve hücre içeriğini pıhtılaştırarak gerçekleştirmektedirler (4).
Sunulan araştırmada, üzüm çekirdeği ekstraktının artan dozları ruminal pH’da istatistiksel
bir değişime neden olmamış ve Rusitec sistemin
fermenterlerinde ruminal pH değerleri fizyolojik
sınırlar içinde küçük dalgalanmalar göstermiştir
(Tablo 3). Yapılan literatür taramalarında üzüm
çekirdeği ektraktının rumen mikrobiyal fermantasyonu üzerine etkileri ile ilgili herhangi bir araştırmaya rastlanılamamıştır. Ancak yine fenolik yapıda
olan ögenol ve karvakrol bileşiklerinin 3, 30, 300
ve 3000 mg/l dozlarından 3 ve 30 mg/l dozları in
vitro ruminal pH’da bir değişime neden olmazken,
karvakrolün 300 ve 3000 mg/l, ögenolün ise 3000
mg/l gibi yüksek dozları ruminal pH’da yükselişe
neden olmuştur (5). Araştırıcılar fenolik bileşiklerin yüksek dozlarında gözlenen pH artışını uçucu
yağ asitlerinin üretimindeki azalmaya bağlamışlardır. Bu azalma, fenolik bileşiklerin rumen florasını
baskılayarak yem maddelerinin fermantasyonunu
sınırlandırmasından kaynaklanmaktadır (1, 12).
UYA’ların ruminantın günlük metabolik enerji ihtiyacının yaklaşık %70’ini karşıladığı düşünüldüğünde (23), mikrobiyal UYA üretimindeki bu azalma in
vivo şartlarda hayvan verimliliği açısından çok da
avantajlı olmayacaktır. Mevcut araştırmada, üzüm
çekirdeği ektraktının 1500 mg’lık dozu yem kuru
maddesi sindirilebilirliğinde istatistiksel bir fark
oluşturmamasına rağmen, toplam UYA, asetat ve
bütirat üretimlerinde artışa neden olmuştur. Bu durum üzüm çekirdeği ekstraktının rumen ortamında
yeterli antimikrobiyal etkinlik gösteremediğine ve
ilave edilen 1500 mg üzüm çekirdeği ektstraktının
rumen mikroorganizmaları tarafından ek bir substrat
olarak kullanıldığına işaret etmektedir. Yaptığımız
analizler üzüm çekirdeği ekstraktının yaklaşık %74
oranında organik madde içerdiğini göstermiştir. Bu
da günlük olarak ilave edilen 1500 mg ekstrakt ile
Rusitec sistemin fermenterlerine deneme yemi dışında günde yaklaşık 1125 mg organik madde ilavesi anlamına gelmektedir.
Bitki ekstraktları ve eterik yağlarının rumendeki mikrobiyal popülasyon üzerine etkileri ile ilgili
bilgiler oldukça sınırlıdır. Bu araştırmada üzüm çekirdeği ektraktının hiçbir dozu toplam protozoon sayısında istatistiksel bir değişime neden olmamıştır.
Benzer şekilde Newbold ve ark. (17) ile Benchaar
ve ark. (3) bitkisel bir eterik yağ karışımının (Crina
ruminants, İsviçre) 110 mg/gün ve 750 mg/gün doz-
larının koyunlarda ve süt ineklerinde toplam protozoon sayısını değiştirmediğini bildirmişlerdir.
Sunulan araştırmada, NH3-N konsantrasyonu
üzüm çekirdeğinin artan dozlarından etkilenmemiştir. Daha önce yapılan araştırmalarda bitki ekstraktlarının NH3-N konsantrasyonu üzerine etkileri ile
ilgili çelişkili bildirimlere rastlanmıştır. Genel olarak kısa süreli in vitro çalışmalarda (24-48 saatlik)
bitkisel eterik yağların NH3-N konsantrasyonunu
azalttığı (16, 17), buna karşın mevcut araştırmadaki
gibi uzun süreli in vitro (7) ve in vivo çalışmalarda
ise (2, 17) herhangi bir değişikliğe neden olmadığı
bildirilmiştir. Araştırıcılar bu sonucu, rumen mikroorganizmalarının eterik yağlara adaptasyon sağlamalarına bağlamışlardır (3). Araştırma prosedürlerinin yanı sıra çalışmalarda kullanılan farklı dozlar da
bitki ekstraktlarının NH3-N konsantrasyonu üzerine
olan çelişkili etkilerinden sorumlu olabilir. Örneğin
Castillejos ve ark. (8) 24 saatlik bir in vitro inkübasyonda ögenolün 5000 mg/l dozunun NH3-N konsantrasyonunu azalttığını, ancak 5, 50 ve 500 mg/l
dozlarının NH3-N konsantrasyonunu değiştirmediğini bildirmişlerdir. Bu durum bitki ekstraktlarının
etkilerinin doza bağımlı olduğuna ve ancak yüksek
dozlarda etkilerin belirgin bir şekilde gözlendiğine işaret etmektedir. Göktürk Baydar ve ark. (13),
üzüm çekirdeği ekstraktının %4-20 yoğunluklarda
antimikrobiyal bir ajan olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Sunulan araştırmada ise Rusitec
sistemin fermenterlerinde (1000 ml hacimli) kullanılan en yüksek üzüm çekirdeği ekstraktının dozu
sadece %0,15’lik konsantrasyona tekabül etmektedir. Mevcut araştırmada kullanılan 1500 mg/gün ve
yukarıdaki araştırmada kullanılan 5000 mg/l dozları
yetişkin bir sığırın rumen hacmi göz önüne alındığında (ortalama 70 litre) 105-350 g/gün gibi yüksek
miktarlara denk gelmektedir. Bu durum hem maliyetlerin yükselmesi, hem de uygulanabilirliğinin zor
olması açısından üzüm çekirdeği ekstraktının yüksek dozlarının hayvan besleme alanında kullanımı
için sınırlayıcı bir faktör olarak göze çarpmaktadır.
Sonuç olarak bu araştırmadan elde edilen bulgular, üzüm çekirdeği ekstraktının yüksek dozlarda
dahi rumen florasında yeterli antimikrobiyal etkinlik gösteremediğini ve mikroorganizmaların fermantatif aktiviteleri üzerinde minimal etkiler oluşturarak arzu edilen değişiklikleri (toplam UYA ve
propiyonat üretiminde artma, asetat/propiyonat oranında azalma, yem sindirilebilirliğinde yükselme
5
gibi) meydana getiremediğini göstermiştir. Ancak,
üzüm çekirdeği ekstraktının ruminantlarda kullanımı oldukça yeni bir konu olması bakımından farklı
dozlar ve besleme şartlarında yapılacak in vitro ve
in vivo araştırmalar literatüre önemli katkılar sağlayacaktır.
Kaynaklar
1. Acamovic T, Brooker JD, (2005). Biochemistry of plant secondary metabolites and their effects in animals, Proc Nutr
Soc. 64, 403-412.
2. Benchaar C, Petit HV, Berthiaume R, Whyte TD, Chouinard PY, (2006). Effects of dietary addition of essential
oils and monensin premix on digestion, ruminal fermentation characteristics, milk production, and milk composition
in dairy cows, J Dairy Sci. 89, 4352-4364.
3. Benchaar C, Petit HV, Berthiaume R, Ouellet DR, Chiquette J, Chouinard PY, (2007). Effects of essential oils on
digestion, ruminal fermentation, rumen microbial populations, milk production, and milk composition in dairy cows
fed alfalfa silage or corn silage, J Dairy Sci. 90, 886-897.
4. Burt S, (2004). Essential oils: their antibacterial properties
and potential applications in foods – a review, Int J Food
Microbiol. 94, 223-253.
5. Busquet M, Calsamiglia S, Ferret A, Kamel C, (2006).
Plant extracts affect in vitro rumen microbial fermentation,
J Dairy Sci. 89, 761-771.
6.Carpenter R, O’Grady MN, O’Callaghan YC, O’Brien
NM, Kerry JP, (2007). Evaluation of the antioxidant potential of grape seed and bearberry extracts in raw and
cooked pork, Meat Sci. 76, 604-10.
7. Castillejos L, Calsamiglia S, Ferret A, Losa R, (2005).
Effects of a specific blend of essential oil compounds and
the type of diet on rumen microbial fermentation and nutrient flow from a continuous culture system, Anim Feed Sci
Technol. 119, 29-41.
8. Castillejos L, Calsamiglia S, Ferret A, (2006). Effect of essential oil active compounds on rumen microbial fermentation and nutrient flow in in vitro systems, J Dairy Sci. 89,
2649-2658.
9. Chaney AL, Marbaeh EP, (1962). Modified reagents for determination of urea and ammonia, Clin Chem. 8, 130-132.
10. Chaves AV, Stanford K, Dugan MER, Gibson LL, McAllister TA, Van Herk F, Benchaar C, (2008). Effects of cinnamaldehyde, garlic and juniper berry essential oils on rumen fermentation, blood metabolites, growth performance,
and carcass characteristics of growing lambs, Livest Sci.
117, 215-224.
11. Czerkawski JW, Breckenridge G, (1977). Design and development of a long-term rumen simulation technique (Rusitec), Br J Nut. 38, 371-384.
12. Fraser GR, Chaves AV, Wang Y, McAllister TA,
Beauchemin KA, Benchaar C, (2007). Assessment of the
effects of cinnamon leaf oil on rumen microbial fermentation using two continuous culture systems, J Dairy Sci. 90,
2315-2328.
6
13. Göktürk Baydar N, Özkan G, Sağdic O, (2004). Total
phenolic contents and antibacterial activities of grape (Vitis vinifera L.) extracts, Food Control. 15, 335-339.
14. Harmeyer J, (1965). Zur Methodik experimenteller Untersuchungen an Pansenprotozoen, Zbl Vet Med A. 12, 9.
15. Jayaprakasha GK, Selvi T, Sakariah KK, (2003). Anitbacterial and antioxidant activities of grape (Vitis vinifera)
seed extracts, Food Res Int. 36, 117-122.
16. McIntosh FM, Williams P, Losa R, Wallace RJ, Beever
DA, Newbold CJ, (2003). Effects of essential oils on ruminal microorganisms and their protein metabolism, Appl
Environ Microbiol. 69, 5011-5014.
17. Newbold CJ, McIntosh FM, Williams P, Losa R, Wallace RJ, (2004). Effects of a specific blend of essential oil
compounds on rumen fermentation, Anim Feed Sci Technol. 114, 105-112.
18. Oeztuerk H, Sagmanligil V, (2009). Role of live yeasts on
rumen ecosystem. Dtsch Tierarztl Wochenschr. 116, 244248.
19. Oeztuerk H, Emre B, Sagmanligil V, Piskin I, Fidanci
UR, Pekcan M, (2010). Effects of nisin and propolis on ruminal fermentation in vitro, J Anim Vet Adv. 9, 2752-2758.
20. Ørskov ER, Hovell FDB, Mould F, (1980). The use of the
nylon bag technique for the evaluation of feedstuffs, Trop
Anim Prod. 5, 195-213.
21. Russell JB, Strobel HJ, (1989). Mini-Review: The effect
of ionophores on ruminal fermentation, Appl Environ Microbiol. 55, 1-6.
22. Shoko T, Soichi T, Megumi MM, Eri F, Jun K, Michiko
W, (1999). Isolation and identification of an antibacterial
compound from grape and its application to foods, Nippon
Nogeikagaku Kaishi. 73, 125-128.
23. Yang MG, Monoharan K, Mickelsen O, (1970). Nutritional contribution of volatile fatty acids from the cecum of
rats, J Nutr. 100, 545-550.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 7-10,
Makalesi / Research Article
7
Tel 2011
OY. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 7-10,Araştırma
2011
Koyunlarda intravajinal sünger uygulamasına bağlı vajinitis olgularından
izole edilen aerobik bakteriler ve antibiyotik duyarlılıkları
Osman Yaşar TEL
Harran Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji AD, Şanlıurfa, Türkiye
Özet: Bu çalışmada, intravajinal sünger uygulamaları sonrası vajinitis oluşan koyunlardan, aerobik bakterilerin izolasyonu, identifikasyonu ve izole edilen etkenlerin antibiyotik duyarlılıklarının saptanması amaçlandı. Çalışmada, bakteriyel vajinitis infeksiyonlarından, 18 (%42.85) Escherichia coli, 15 (%35.71) Bacillus spp., 2 (%4.76) Klebsiella
pneumonia, 4 (%9.52) Corynebacterium spp., 1 (%2.38) Pseudomonas aureginosa ve 2 (%4.76) Staphylococcus aureus
izole ve identifiye edildi. İzole edilen etkenlerin yapılan antibiyogramları sonucunda ampisilin, penisilin, eritromisin ve
amoksisiline yüksek oranda dirençli ve gentamisin, trimetoprim-sulfametoksazol, sefuroksim, nalidiksik asit, norfloksasin, tetrasiklin ve streptomisine ise duyarlı oldukları belirlendi. Sonuç olarak, sünger uygulamalarından sonra yaygın
olarak gelişen vajinitis infeksiyonlarından E.coli ve Bacillus spp. etkenlerinin yüksek oranda izole edildiği, izole edilen
etkenlerin ampisilin, penisilin, eritromisin ve amoksisiline dirençli olduğu, kullanılan diğer antibiyotiklere karşı genel
olarak duyarlı oldukları kanısına varıldı.
Anahtar sözcükler: Aerobik bakteri, antibiyotik duyarlılığı, intravajinal sünger, koyun, vajinitis.
Aerobic bacteria and their antibiotic susceptibility of sheep with vaginitis due to
intravaginal sponges application
Summary: The aim of this study, was to isolate, identificate aerobic bacteria and determine antibiotic susceptibility
of isolated agents in sheep with vaginitis due to intravaginal sponges application. In the study, 18 (42.85%) Escherichia coli, 15 (35.71%) Bacillus spp., 2 (4.76%) Klebsiella pneumoniae, 4 (9.52%) Corynebacterium spp., 1 (2.38%)
Pseudomonas aureginosa and 2 (4.76%) Staphylococcus aureus were isolated and identified from bacterial vaginitis infections. As a result of antibiotic susceptibility; the agents are highly resistant against ampicillin, penicillin, erythromycin, amoxicillin, and sensitive to gentamicin, trimethoprim-sulphamethoxazole, cefuroxime, nalidixic acid, norfloxacin,
tetracycline and streptomycine. As a result, E.coli and Bacillus spp. were highly isolated from vaginitis infections due
to intravaginal sponges applications. It has been concluded that isolated agents were resistant to ampicillin, penicillin,
erythromycin and amoxicillin and in general, sensitive to other antibiotics.
Key words: Aerobic bacteria, antibiotics susceptibility, intravaginal sponge, sheep, vaginitis.
Giriş
Koyunlarda, progestagen emdirilmiş intravajinal
sünger uygulamaları östrus senkronizasyonunda
yaygın olarak kullanılmaktadır (6). Ancak, intravajinal sünger uygulamalarına bağlı olarak vajinitis
oluşabileceği de bildirilmektedir (4,13). Vajinitis
olgularında, vajinada eritem, purulent ve kokuşmuş
vajinal akıntı, bol miktarda vajinal lökosit görülmekte ve vajinal bakteri sayısında artış şekillenmektedir (7). Koyunlarda anormal vajinal akıntının,
yüksek oranda infertil ovum, embriyo gelişiminde
bozukluk ve döl tutma oranının düşmesine sebep
olduğu bildirilmektedir (12).
Evcil ruminantlarda vajinitis olgularına genellikle fırsatçı bakteriler neden olmaktadır (11). Koli-
formlar, üreme kanalında bulunan fırsatçı patojenler olup, bakteriyel vajinal flora değişikliğine neden
olan durumlarda baskın duruma geçerler (5). Vajinitise neden olan bakterilerin antibiyotiklere duyarlılıkları farklılık göstermektedir. Vajinitis oluşturan
bakteri türlerini ve onların antibiyotiklere olan duyarlılıklarını belirlemek, vajinitisin kontrolü açısından önem taşımaktadır (11). Buna karşın, vajinitis
oluşturan bakteriler ve antibiyotik duyarlılıkları konusunda yapılan araştırmalar sınırlı sayıdadır.
Bu araştırmada, vajinal sünger uygulamalarından sonra oluşan vajinitis infeksiyonlarında aerobik
bakterilerin izolasyonu, identifikasyonu ve izole
edilen etkenlerin antibiyotiklere olan duyarlılıklarını saptamak amaçlanmıştır.
Yazışma adresi / Correspondance: O. Yaşar Tel, Harran Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Eyyübiye
Kampüsü, Şanlıurfa, Türkiye. E-posta: [email protected]
Tel OY. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 7-10, 2011
8
Materyal ve Metot
Bu çalışmada intravajinal sünger (Chronogest, Intervet, International B.V., Netherlands) uygulanan
toplam 50 merinos koyun kullanıldı. Sünger uygulaması öncesinde spekulum ile yapılan vajinal muayenede koyunların hiçbirinde klinik olarak bozukluk
görülmedi. İntravajinal süngerler, çıkarıldığında, 50
koyunun 35 (%70)’inde klinik olarak vajinitis görüldü. Klinik muayenede, vajinada purulent akıntı
ve çeşitli derecelerde eritem gözlendi. Süngerlerin
uzaklaştırılmasının hemen ardından steril svaplar
kullanılarak vajinal duvara temas etmeden örnekler
toplandı. Svaplar stuart transport besiyeri içerisinde
soğuk zincir altında en kısa sürede laboratuvara getirildi ve %7’lik koyun kanlı agara ekimleri gerçekleştirildi. Besiyerleri, 37 °C’de aerobik olarak 24-48
saat inkubasyona bırakıldı.
İnkubasyon sonucunda besiyerinde üreyen
bakterilerin, koloni morfolojileri, hemoliz özellikleri, Gram boyanma, Triple Sugar Iron Agar, sitrat,
üre, Metil-Red, Voges-Proskauer, nitrat, koagulaz,
oksidaz, katalaz, indol gibi biyokimyasal testleri ve
Mc Conkey agarda üreme gibi özellikleri incelenerek standart metodlara göre identifikasyonları yapıldı (3, 10).
Antibiyotik Duyarlılıkları: İzole edilen etkenlerin antibiyotiklere duyarlılıkları Kirby Bauer Disk
Diffüzyon Metodu ile Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) standartlarına göre yapıldı
(1,8). Antibiyotik duyarlılık testinde, gentamisin
(10 µg), sefuroksim (30 µg), eritromisin (15 µg),
amoksisilin (25 μg), ampisilin (10 µg), penisilin
G (10 u), norfloksasin (10 µg), tetrasiklin (30 µg),
streptomisin (10 µg), nalidiksik asit (30 µg) ve trimetoprim-sulfametoksazol (25 µg) (tamamı oxoid)
olmak üzere toplam 11 farklı antibiyotik diski kullanıldı.
Bulgular
Çalışma sonucunda, vajinitis oluşan koyunlardan,
18 (%42,85) E.coli, 15 (%35,71) Bacillus spp., 2
(%4,76) K.pneumonia, 4 (%9,52) Corynebacterium
spp., 1 (%2,38) P.aureginosa ve 2 (%4,76) S.aureus
izole ve identifiye edildi (Tablo 1).
Bütün örneklerden genel olarak saf bakteriyel
üreme görülürken, 5 örnekte Bacillus spp. + E.coli,
1 örnekte E.coli + S.aureus, 2 örnekte E.coli + Corynebacterium spp. ve 1 örnekte S.aureus + Bacillus
spp miks olarak üredi. Birden fazla koloninin ürediği durumlarda en yaygın koloni tipine antibiyotik
duyarlılık testi uygulandı.
Tablo 1. Koyun vajinal svaplarından izole edilen bakteriler ve oranları.
İdentifiye Edilen Bakteriler
İdentifikasyon Sayısı
İdentifikasyon Yüzde Oranı (%)
E.coli
18
42.85
Bacillus spp
15
35.71
K.pneumonia
2
4.76
Corynebacterium spp
4
9.52
P.aureginosa
1
2.38
S.aureus
2
4.76
Toplam
42
100
Yapılan antibiyogram testleri sonucunda etkenlerin ampisilin, penisilin eritromisin ve amoksisiline
yüksek oranda dirençli oldukları görüldü. Penisilin,
ampisilin, eritromycine ve amoksisiline E.coli suşları sırasıyla %94, %94, %76, %47 oranlarında, Bacillus spp. suşları sırasıyla, %100, %100, %83, %41,6
oranlarında dirençli olarak saptandı. P.aureginosa,
Corynebacterium spp. ve K.pneumoniae’nın bu
antibiyotiklere karşı dirençli olduğu saptanırken,
S.aureus’un bu antibiyotiklerden sadece ampisilin
ve penisiline dirençli olduğu belirlendi. Etkenlerin
diğer antibiyotiklere karşı (gentamisin, trimetoprimsulfametoksazol, sefuroksim, nalidiksik asit, norfloksasin, tetrasiklin ve streptomisin) duyarlı olduğu
saptandı (Tablo 2).
9
Tablo 2. Vajinitis olgularından identifiye edilen bakterilerin antibiyotik duyarlılıkları.
G
C
E
AMX
AMP
PEN
N
NA
T
TS
S
R/N
R/N
R/N
R/N
R/N
R/N
R/N
R/N
R/N
R/N
R/N
E.coli
1/17
0/17
13/17
8/17
16/17
16/17
1/17
2/17
3/17
1/17
3/17
S.aureus
0/1
0/1
0/1
0/1
1/1
1/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
K.pneumonia
0/2
0/2
2/2
2/2
2/2
2/2
0/2
0/2
1/2
0/2
1/2
Bacillus spp
0/12
0/12
10/12
5/12
12/12
12/12
0/12
1/12
1/12
0/12
2/12
Corynebacterium spp.
0/2
0/2
2/2
2/2
2/2
2/2
0/2
0/2
0/2
0/2
0/2
P.aureginosa
0/1
1/1
1/1
1/1
1/1
1/1
0/1
1/1
0/1
1/1
0/1
Bakteriler
G-gentamisin, C-sefuroksim, E-eritromisin, AMX-amoksisilin, AMP-ampisilin, PEN-penisilin, N-norfloksasin, NA-nalidiksik asit, T-tetrasiklin,
TS- trimetoprim-sulfametoksazol, S-streptomisin, R/N: Antibiyotiklere dirençli bakteri sayısı/Antibiyogramı yapılan bakteri sayısı.
Koyunlarda östrus senkronizasyonu amacıyla intravajinal sünger uygulamaları sonucunda, lokal
bir yangı oluşumuyla birlikte vajinal bakterilerin
sayısında önemli bir artış şekillenebilmektedir (7).
Vajinada sünger bulunmasının, yabancı cisim etkisi
yaparak lokal mukus sekresyonunu artırdığı bildirilmektedir (13).
Ruminantların yaygın genital kanal hastalığı olan vajinitis, sekonder bakteriyel etkenler ve
özellikle de E.coli tarafından oluşturulmaktadır (5).
İntravajinal sünger uygulamalarının fırsatçı bakteri oranını artırdığı ve vajinitis için predispozisyon
oluşturduğu bildirilmiştir (4, 11). Martins ve ark.
(5), sünger uygulaması sonucu oluşan vajinitis infeksiyonlarından izole ettikleri 22 izolatın 20’sini
koliform (16 E.coli ve 4 K.pneumoniae), 4’ünü
de S.aureus olarak identifiye etmişlerdir. Manes
ve ark. (4), intravajinal sünger uygulamalarından
önce vajinal bakteriyel floranın çoğunlukla (%90)
gram pozitif (Bacillus spp., Staphylococcus spp.,
Corynebacterium spp. ) bakterilerden oluştuğunu,
intravajinal süngerlerin çıkarılmasından sonra ise
floranın, %79’unun Gram negatif özellikle Enterobacteriaceae (E.coli) familyası bakteriler tarafından
ve %21’ininde Gram pozitif bakteriler tarafından
oluşturulduğunu bildirmişlerdir. Araştırmamızda da
yüksek oranda koliform bakterilerin izole edilmesi
ve izole edilen diğer bakteri türleri, Martins ve ark.
(5)’nın bulgularıyla paralellik göstermektedir.
Sünger uygulamaları sonucunda gelişen vajinitis olaylarının bazıları kendiliğinden iyileşme gösterirken, iyileşmeyen olgularda antibiyotik tedavisi
gerekmektedir (13). Martins ve ark. (5), yaptıkları
çalışmada, koyun vajinitislerinden izole ettikleri etkenlerin en az bir antibiyotiğe olmak üzere antibiyotiklere genel olarak dirençli olduklarını saptamışlardır. Çalışmada, koliform bakterilerde penisilin
direnci yaygın olarak görülmüş ve ampicilin %95,
amoxicilin %80, tetrasiklin %85, gentamisin %70
ve cefalotine %70 oranında direnç bildirilmiştir. Ayrıca etkenlerin ciprofloxcacin ve trimetoprim-sulfametoksazole %100 duyarlı olduğu belirtilmiştir.
Aynı araştırıcılar, izole ettikleri iki S.aureus suşunun
ise sadece penisiline dirençli olduğunu bildirmişlerdir. Suarez ve ark. (13), yaptıkları çalışmada, koyun
vajinitislerinden izole ettikleri etkenleri amoksisilin
ve ampisiline karşı dirençli bulurken cephalotin ve
gentamisine karşı direnç saptamamışlardır. Guerra
ve ark. (2), keçilerde gentamisinin intravajinal lokal
uygulamalarının vajinal infeksiyonları önlemede etkili olduğunu belirtmişlerdir. Başka bir çalışmada,
vajinitis olgularından izole edilen etkenlerin yapılan
antibiyogramı sonucunda, clindamycin, eritromisin,
penisilin ve vankomisinin diğer antibiyotiklere göre
daha dirençli olduğu bildirilmiştir (9). Bu sonuçlar,
yapılan çalışmada elde edilen bulgularla paralellik
göstermektedir. Penisilin grubunda görülen yüksek
direncin, bu grup antibiyotiklerin yaygın kullanılmasından kaynaklanabileceği düşünülmektedir.
Sonuç olarak, sünger uygulamalarından
sonra yaygın olarak gelişen vajinitis infeksiyonlarından genellikle E.coli ve Bacillus spp. sorumlu
olduğu, izole edilen etkenlerin özellikle ampisilin,
penisilin eritromisin ve amoksisiline dirençli, kullanılan diğer antibiyotiklere genel olarak duyarlı oldukları kanısına varılmıştır. Elde edilen sonuçların,
etkili reproduktif kontrol programlarının oluşturulmasında yararlı olacağı düşünülmektedir.
10
Kaynaklar
1. Bauer AU, Kirby WM, Sherris JC, Tack M, (1966). Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc
method. J Clin Pathol. 45, 493-494.
2. Guerra, MMP, Mota RA, Mergulhao FCC, Lima RF,
Souza AF, Melo EH, Silva KPC, Soares PC, (2002). Study
of the microbial flora and evaluation of the effectiveness of
Gentocin (R) 40mg in the prevention of vaginal infection in
dairy goats submitted to estrous synchronization. A Hora
Vet. 22, 13-17.
3. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger
PC, Winn WC, (1997). Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, Fifth edition, Lippincott Williams &
Wilkins, Philadelphia. p: 211-765.
4. Manes J, Fiorentino MA, Kaiser G, Hozbor F, Alberio R,
Sanchez E, Paolicchi F, (2010). Changes in the aerobic
vaginal flora after treatment with different intravaginal devices in ewes. Small Rumin Res. 94, 201-204.
5. Martins G, Figueira L, Penna B, Brandao F, Varges R,
Vasconcelos C, Lilenbaum W, (2009). Prevalence and
antimicrobial susceptibility if vaginal bacteria from ewes
treated with progestin-impregnated intravaginal sponges.
Small Rumin Res. 81, 182-184.
6. Menchaca A, Rubianes E, (2004). New treatments associated with timed artificial insemination in small ruminants.
Reprod Fert Develop. 16, 403-413.
7. Motlomelo KC, Greyling JPC, Schwalbach LMJ, (2002).
Synchronisation of oestrus in goats: the use of different progestagen treatments. Small Rumin Res. 45, 45-49.
8. National Committee for Clinical Laboratory Standards
(2004). Performance standards for antimicrobial disk and
dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals; informational supplement. ��
M31-S1. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, PA.
9. Özyurtlu N, Yeşilmen S, Küçükaslan İ, (2008). The effectiveness of using antibiotic with intravaginal sponge and
duration of sponge teratments on the vaginal flora and fertility in anestrous ewes. J Anim Vet Adv. 7(6), 723-727.
10. Quinn PJ, Carter ME, Markey B, Carter GR, (1999).
Clinical Veterinary Microbiology. ��
Wolfe Publication, London, UK.
11. Sargison ND, Howie F, Mearns R, Penny CD, Foster G,
(2007). Shiga toxin-producing Escherichia coli as a perennial cause of abortion in a closed flock of Suffolk ewes. Vet
Rec. 160, 875-876.
12. Scudamore CL, (1988). Intravaginal sponge insertion
technique. Vet Rec. 123, 554.
13. Suarez G, Zunino P, Carol H, Ungerfeld R, (2006).
Changes in the aerobic vaginal bacterial mucous load and
assessment of the susceptibility to antibiotics after treatment with intravaginal sponges in anestrus ewes. Small
Rumin. Res. 63, 39-43.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22,
11-15,
2011
Araştırma
11
Ütük
AE ve
ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 11-15,
2011 Makalesi / Research Article
Varroosis ve nosemosis üzerine retrospektif bir çalışma
Armağan Erdem ÜTÜK1, F.Çiğdem PİŞKİN1, Ahmet DENİZ1, İbrahim BALKAYA2
Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Parazitoloji ve Arı Hastalıkları Laboratuvarı, Ankara, Türkiye
2
Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Parazitoloji Anabilim Dalı, Erzurum, Türkiye
1
Özet: Bu çalışma 2006-2010 yılları arasında Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Arı Hastalıkları Laboratuvarına yapılan başvuruları varroosis ve nosemosis yönünden değerlendirmek amacıyla yapılmıştır. Bu süre içerisinde
Türkiye’nin 36 farklı ilinden 140 başvuru yapılmış; 179 petek ve 20606 arı incelenmiştir. 140 başvurunun 81’inde
(%57.85) enfeksiyon tespit edilmiştir. Yapılan başvuruların 79’unda (%56.42) varroosis, 6’sında (%4.28) nosemosis ve
4’ünde (%2.85) ise miks enfeksiyon tespit edilmiştir. Ayrıca her iki hastalığın yıllara, mevsimlere ve aylara göre dağılımları incelenerek araştırmacıların bilgisine sunulmuştur.
Anahtar sözcükler: Arı, nosemosis, retrospektif çalışma, varroosis.
A retrospective study on varroosis and nosemosis
Summary: The aim of this study was to evaluate the applications to the Central Veterinary Control and Research Institute, Bee Diseases Laboratory with respect to varroosis and nosemosis between the years 2006-2010. In this period a
total of 140 applications were recieved from 36 different provinces of Turkey; 179 comb and 20606 bee were examined.
Out of 140 applications, 81 (57.85%) samples were found to be infected. Varroosis in 79 (56.42%), nosemosis in 6
(4.28%) and mix infection in 4 (2.85%) were detected out of all applications received. Also both diseases were examined
with respect to their distrubition in years, seasons and months and presented to the information of researchers.
Key words: Bee, nosemosis, retrospective study, varroosis.
Giriş
Varroa cinsi içerisinde Varroa jacobsoni,
V.destructor, V.underwoodi ve V.rindereri olmak
üzere morfolojik ve genetik olarak ayırt edilebilen
dört tür bulunmaktadır. Bu dört tür, konak spesifitesi ve coğrafi dağılımları açısından farklılıklar
göstermektedir. Asya’da V.jacobsoni, V.underwoodi
ve V.destructor Asya bal arısında (Apis cerana),
V.rindereri Koschevnikov arısında (A.koschevnikov),
dünya genelinde ve Türkiye’de ise V.destructor Avrupa bal arısında (A.mellifera) parazitlenmektedir
(1, 2, 7, 9, 10, 24).
Varroa destructor bal arılarının (A.mellifera)
larva, pupa ve erişkinleri üzerinde parazitlenerek
toplu ölümlere neden olmaktadır. Parazitle enfekte kolonilerde yavruların bakım ve beslenmesinin
aksadığı, erkek arı sayısının, erkeklerin cinsel gücünün, ana arının yumurtlama performansının ve
ergin arı popülasyonunun azaldığı, yavru gözlerinde noktalı deliklerin oluştuğu, yavru çürüklüğüne
benzer semptomların görüldüğü ve ölen yavruların
“C” şeklinde kaldığı belirtilmektedir. Ayrıca ergin
ve larvaların üzerinde bulunan parazitlerin oluşturdukları lezyonlar arıları diğer hastalıklara karşı
predispoze hale getirmektedir. Hastalık kovan dip
tahtası üzerindeki kalıntıların, erkek arı gözlerinin
ya da erişkin arıların farklı yöntemlerle incelenmesi
ile teşhis edilmektedir (8, 16, 22, 25).
Nosemosis ergin bal arılarında görülen en yaygın hastalıklardan birisidir. Hastalığın etkeni Nosema apis ve N.ceranae adlı mikrosporidialardır.
Enfekte kolonilerde; sindirim sistemi bozuklukları
başta olmak üzere, yaşam sürelerinde kısalma, uçamama, bağırsakların kirli beyaz ve mat renk alması,
kovan girişinde ölü arıların toplanması, koloni popülasyonunda ve bal üretiminde azalma, hatta kolonilerde sönme şekillenebilmektedir (8, 11, 14, 18).
Hastalığın teşhisi mikroskopta Nosema spp.
sporlarını görmek sureti ile ya da Polimeraz Zincir
Reaksiyonu (PZR) gibi moleküler teknikler yardımıyla yapılmaktadır (12, 13, 15).
Bu çalışmanın amacı 5 yıllık süreçte laboratuvarımıza yapılan başvuruları varroosis ve nosemo-
Yazışma adresi / Correspondance: Armağan Erdem Ütük, Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, 06020, Etlik, Ankara,
Türkiye. E-posta: [email protected]
Ütük AE ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 11-15, 2011
12
sis yönünden değerlendirerek elde ettiğimiz verileri
konuyla ilgilenen araştırmacılar ile paylaşmaktır.
Materyal ve Metot
Çalışmanın materyalini 2006-2010 yılları arasında
Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü,
Arı Hastalıkları Laboratuvarına, Türkiye’nin 36
farklı ilinden yapılan 140 başvuruya ait 179 petek
ve 20606 arı oluşturmuştur. Numunelerin gönderildiği iller haritada, numunelerin yıllara göre dağılımları ise tabloda belirtilmiştir (Şekil 1, Tablo 1).
Şekil 1. 2006-2010 yılları arasında arı ve petek numunelerinin gönderildiği iller kırmızı renkte belirtilmiştir.
Tablo 1. 2006-2010 yılları arasında arı ve petek numunelerinin yıllara göre dağılımı.
Yıl
Başvuru sayısı
Arı sayısı
Petek sayısı
2006
37
1990
43
2007
39
3458
67
2008
13
6820
17
2009
24
3820
28
2010
27
4518
24
Toplam
140
20606
179
Laboratuvarımıza gönderilen petek numuneleri
beyaz bir kağıt üzerine alınıp, bistüri ile petek gözlerine enlemesine kesitler yapılarak, arı gönderilen
durumlarda ise arılar üzerinde özellikle kanat dipleri ve abdomen segmentleri arasında parazitler arandı. Muayene için laboratuvara ağzı kapalı kaplarda
gönderilen canlı arılar üzerine sprey şeklinde eter
püskürtülerek veya +4 °C’da bekletilerek arıların
ölmesi sağlandı. Toplanan parazitler stereo mikroskopta incelenerek teşhisleri yapıldı (3, 16, 25).
Nosemosis’in teşhisi amacıyla, 60 adet arı muayeneye alındı. Bunların abdomenleri ayrılarak 2-3
ml serum fizyolojik içerisinde ezildi ve oluşan süspansiyondan 3 damla kadar bir lam lamel arasına
alınarak mikroskopta (40 X) Nosema spp. sporları
arandı (3, 11, 25).
Bulgular
Çalışma sonucunda 140 başvurunun 81’inde
(%57.85) enfeksiyon tespit edilmiştir. Yapılan
başvuruların 79’unda (%56.42) varroosis, 6’sında
(%4.28) nosemosis ve 4’ünde (%2.85) ise hem varroosis hem de nosemosis tespit edilmiştir. Bulgular
tablolarda (Tablo 2, 3, 4) özetlenmiş, tespit edilen
etkenler ise şekillerde (Şekil 2, 3, 4) gösterilmiştir.
Şekil 2. Varroa destructor (Orijinal).
Şekil 3. Nosema ceranae sporları (Orijinal).
13
Şekil 4. Nosema apis sporları (Orijinal).
Tablo 2. 2006-2010 yılları arasında yapılan başvurularda varroosis ve nosemosisin enfeksiyon oranları.
Yıl
Başvuru sayısı
Enfeksiyon
V.destructor
Nosema spp.
V.destructor + Nosema spp.
N
N
%
N
%
N
%
N
%
2006
37
16
43.24
16
43.24
-
0
-
0
2007
39
25
64.10
25
64.10
1
2.56
1
2.56
2008
13
6
46.15
6
46.15
-
0
-
0
2009
24
14
58.33
13
54.16
2
8.33
1
4.16
2010
27
20
74.07
19
70.37
3
11.11
2
7.40
Toplam
140
81
57.85
79
56.42
6
4.28
4
2.85
Tablo 3. 2006-2010 yılları arasında yapılan başvurularda varroosis ve nosemosis enfeksiyonlarının aylara göre dağılımı.
Aylar
Başvuru sayısı
Enfeksiyon
V.destructor
Nosema spp.
N
N
%
N
%
N
%
N
%
Ocak
5
3
60.00
3
60.00
-
0
-
0
Şubat
11
10
90.90
10
90.90
-
0
-
0
Mart
28
20
71.42
20
71.42
-
0
-
0
Nisan
11
3
27.27
2
18.18
1
9.09
-
0
Mayıs
25
12
48.00
12
48.00
1
4.00
1
4.00
Haziran
14
8
57.14
7
50.00
2
14.28
1
7.14
Temmuz
12
5
41.66
5
41.66
-
0
-
0
Ağustos
6
3
50.00
3
50.00
-
0
-
0
Eylül
6
4
66.66
4
66.66
1
16.66
1
16.66
Ekim
13
7
53.84
7
53.84
1
7.69
1
7.69
Kasım
7
4
57.14
4
57.14
-
0
-
0
Aralık
2
2
100.00
2
100.00
-
0
-
0
Toplam
140
81
57.85
79
56.42
6
4.28
4
2.85
14
Tablo 4. 2006-2010 yılları arasında yapılan başvurularda varroosis ve nosemosis’in enfeksiyonlarının mevsimlere
göre dağılımı.
Mevsimler Başvuru sayısı
Enfeksiyon
V.destructor
Nosema spp.
N
N
%
N
%
N
%
N
%
Kış
18
15
83.33
15
83.33
-
0
-
0
İlkbahar
64
35
54.68
34
53.12
2
3.12
1
1.56
Yaz
32
16
50.00
15
46.87
2
6.25
1
3.12
Sonbahar
26
15
57.69
15
57.69
2
7.69
2
7.69
Toplam
140
81
57.85
79
56.42
6
4.28
4
2.85
Varroosis ve nosemosis bal arısı kolonilerinde ciddi kayıplara ve sönmelere neden olabilmektedir.
Ülkemizde yapılan çalışmalarda; Güney Marmara
Bölgesinde incelenen 217 kovanın %35’inde ve ülkemizin 39 farklı noktasından toplanan 204 koloninin %41’inde varroosis tespit edilmiştir (9, 10).
Bursa ve Yalova illerinde yapılan bir anket çalışmasında ise arıcıların %58’i kendilerine zarar veren
en önemli hastalığın varroosis olduğunu belirtmişlerdir (4). Bu çalışmada 140 başvurunun 79’unda
(%57.14) varroosis tespit edilmiş, enfeksiyon oranının en yüksek (%70.37) olduğu yılın 2010, en
düşük (%43.24) olduğu yılın 2006, hastalığın en
yoğun (%83.33) olarak görüldüğü mevsimin kış, en
düşük (%46.87) olarak görüldüğü mevsimin ise yaz
olduğu belirlenmiştir. Varroosisin aylara göre dağılımına bakıldığında ise hastalık en yoğun (%100)
Aralık ayında, en düşük (%27.27) ise Nisan ayında
tespit edilmiştir.
Elazığ yöresinde 285 kovana ait arı numuneleri
incelenmiş ve nosemosisin yaygınlığı %8.77 olarak belirlenmiştir (19). Yine Elazığ’da yapılan bir
çalışmada nosemosisin yaygınlığı Merkez’de %4,
Baskil’de %4 ve Sivrice’de %10 olarak tespit edilmiştir (20). Kars yöresinde 343 arılığın %15.74’ünde
(21), Bingöl yöresinde 122 arılığın %38.5’inde (17),
Bursa yöresinde 72 kovanın %26.4’ünde (6), Güney
Marmara bölgesinde 217 kovanın %24’ünde (9)
hastalık belirlenmiştir. Türkiye genelinde yapılan
bir çalışmada ise 26 farklı odaktan, 37 arılığı temsilen 230 koloni incelenmiş, çalışma sonunda hastalığın arılıklardaki yaygınlığının %60, kolonilerdeki
yaygınlığının ise %14 olduğu ifade edilmiştir (5).
Ayrıca Türkiye’de nosemosise neden olan türleri
belirlemek amacıyla yapılan bir çalışmada Samsun
ve Giresun illerinden iki koloniye ait Nosema spp.
sporları PZR ile incelenmiş ve Türkiye’de ilk kez
N.ceranae tespit edilmiştir (23). Bu çalışmada ise
laboratuvarımıza yapılan 140 başvurunun 6’sında
(%4.28) nosemosis tespit edilmiştir. Enfeksiyon
oranının en yüksek (%11.11) olduğu yıl 2010 olarak
belirlenmiş, 2006 ve 2008 yıllarında yapılan başvurularda ise hastalık tespit edilmemiştir. Hastalığın
mevsimlere ve aylara göre dağılımına bakıldığında, hastalığın en yoğun (%7.69) olarak görüldüğü
mevsimin sonbahar olduğu belirlenmiş, bunu yaz
(%6.25) ve ilkbahar (%3.12) takip etmiştir. Kışın
yapılan başvurularda ise hastalık tespit edilmemiştir. Ayrıca nosemosis en yoğun olarak (%16.66)
Eylül ayında tespit edilirken, Aralık, Ocak, Şubat,
Mart, Temmuz, Ağustos ve Kasım aylarında hastalık tespit edilmemiştir.
Miks enfeksiyon oranı genel toplamda %2.85
olarak belirlenmiştir. Miks enfeksiyon oranının en
yüksek (%7.40) olduğu yıl 2010 iken, 2006 ve 2008
yıllarında hastalık tespit edilmemiştir. Ayrıca miks
enfeksiyonun en yüksek olduğu mevsimin (%7.69)
sonbahar, en yüksek olduğu ayın ise (%16.66) Eylül
olduğu belirlenmiştir.
Sonuç olarak Türkiye’nin çok geniş bir coğrafyasından, 5 yıllık süreçte laboratuvarımıza yapılan başvurular varroosis ve nosemosis yönünden
değerlendirilmiş, her iki hastalığın dağılımı yıllara,
mevsimlere ve aylara göre incelenerek elde edilen
veriler konuyla ilgilenen araştırmacıların bilgisine
sunulmuştur.
Teşekkürler
Çalışmamızın laboratuvar aşamasındaki katkılarından dolayı laboratuvar personelimiz Gülsün ÇINAR
ve Y. Fuat KILIÇ’ a teşekkür ederiz.
Kaynaklar
1. Anderson DL, (2000). Variation in the parasitic mite Varroa
jacobsoni. Apidologie. 31, 281-292.
2. Anderson DL, Trueman, JWH, (2000). Varroa jacobsoni is
more than one species. Exp Appl Acarol. 24, 165-189.
3. Anonim, (2011). Varroosis of honey bees. Erişim adresi:
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.02.07_VARROOSIS.pdf, Erişim tarihi:
11.05.2011.
4. Aydın L, Çakmak İ, Güleğen E, Korkut M, (2003). Güney
Marmara Bölgesi arı hastalıkları ve zararlıları anket sonuçları. U Arı Derg. 3, 37-40.
5. Aydın L, Çakmak İ, Güleğen E, Wells H, (2005). Honeybee Nosema disease in the Republic of Turkey. J Apic Res.
44, 196-197.
6. Aydın L, Güleğen E, Çetinbas H, (2001). Bursa yöresi bal
arılarında Nosema apis (Zander, 1909)’in yaygınlığı. Bültendif. 17, 6-8.
7. Aydın L, Güleğen E, Çakmak İ, Girişgin AO, (2007). The
Occurrence of Varroa destructor Anderson and Trueman,
2000 on honey bees (Apis mellifera) in Turkey. Turk J Vet
Anim Sci. 31, 189-191.
8. Bailey L, Ball BV (1991): Honey Bee Pathology. Second
edition. London: Academic Press.
9. Çakmak İ, Aydın L, Güleğen AE, (2003). Güney Marmara
Bölgesinde balarısı zararlı ve hastalıkları. U Arı Derg. 3,
33-35.
10. Çakmak İ, Aydın L, Güleğen AE, Wells H, (2003). Varooa
(Varroa destructor) and tracheal mite (Acarapis woodi) incidence in the Republic of Turkey. J Apic Res. 42, 57-60.
11. Fries I, (1997). Protozoa. Morse RA, Flottum K. eds. Honey Bee Pests, Predators, Diseases. A I Root Company, USA.
p. 59-76.
12. Fries I, Feng F, Da Silva A, Slemenda SB, Pieniazek NJ,
(1996). Nosema ceranae (Microspora, Nosematidae). Morphological and molecular characterization of a microsporidian parasite of the Asian honey bee Apis cerana (Hymenoptera, Apidae). European J Parasitol. 32, 356-365.
13. Hernández RM, Meana A, Prieto L, Salvador AM, Bailon EG, Higes M, (2007). Outcome of Colonization of Apis
15
mellifera by Nosema ceranae. Appl Env Microbiol, 73,
6331-6338.
14. Higes M, Hernández RM, Botías C, Bailón EG, GonzálezPorto AV, Barrios L, Del Nozal M J, Bernal JL, Jiménez
JJ, Palencia PG , Meana A, (2008). How natural infection
by Nosema ceranae causes honeybee colony collapse. Env
Microbiol. 10, 2659-2669.
15. Higes M, Hernández RM, Meana A, (2006). Nosema
ceranae, a new microsporidian parasite in honeybees in
Europe. J Invertebr Pathol. 92, 93-95.
16. Jong DD, (1997). Mites: Varroa and other parasites of
brood. Morse RA, Flottum K. Eds. Honey Bee Pests, Predators, Diseases. A I Root Company, USA. p. 282-321.
17. Kutlu MA, Ekmen F, (2003). Bingöl yöresi bal arılarında
(Apis mellifera L.) Nosema hastalığının varlığı ve enfeksiyon oranı. Teknik Arıcılık. 79, 24-26.
18. Somerville D, Hornitzky M (2007). Nosema disease.
Erişim adresi: http://www.dpi.nsw.gov.au/_data/assets/
pdf_file/0003/177519/nosema-disease.pdf, Erişim tarihi:
27.03.2009.
19. Şimşek H, (2005). Elazığ yöresi bal arılarında bazı parazit
ve mantar hastalıklarının araştırılması. Ankara Üniv Vet
Fak Derg. 52, 123-126.
20. Şimşek H, Dilgin N, Gültekin İ, (2001). Elazığ yöresinde
bulunan arı işletmelerinde nosematosisin yaygınlığı. Etlik
Vet Mikrobiyol Derg. 12, 49-51.
21. Topçu B, Arslan MÖ, (2004). Kars yöresindeki bal arılarında nosemosis’in yaygınlığı. U Arı Derg. 4, 164-170.
22. Uygur ŞÖ, Girişgin AO, (2008). Bal arısı hastalıkları ve
zararları. U Arı Derg. 8, 130-142.
23. Ütük AE, Pişkin FÇ, Kurt M, (2010). First molecular detection of Nosema ceranae in Turkey. Vet J Ankara Univ.
57, 225-278.
24. Warrit N, Hagen TAR, Smith DR, Çakmak I, (2004).
A survey of Varroa destructor strains on Apis mellifera in
Turkey. J Apic Res. 43, 190-191.
25. Zeybek H, (1991). Arı hastalıkları ve zararlıları. Tarım ve
Köyişleri Bakanlığı. Etlik Hayvan Hastalıkları Araştırma
Enstitüsü Müdürlüğü. Etlik, Ankara, p.21-27, 63-76.
Etlik Vet Mikrobiyol
Derg, AB,
22, 16-22,
Araştırma
Makalesi
16
Güngör
Kabaklı2011
Ö, Çalışkan E. Etlik Vet Mikrobiyol Derg,
22, 16-22,
2011 / Research Article
Attenue mavidil serotip-4 aşısının farklı stabilizatörler ile üretilmesi
Ahmet Burak GÜNGÖR, Özden KABAKLI, Elvin ÇALIŞKAN
Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Viral Aşı Üretim Laboratuvarı, Ankara, Türkiye
Özet: Bu çalışma ile attenue mavidil serotip-4 aşısının halihazırda kullanılmakta olan embriyo ekstraktı ve yumurta
sarısından oluşan stabilizatörünün yerine farklı stabilizatörlerin kullanılması ve bunların liyofilizasyon ve raf ömrüne
etkileri araştırıldı. Bu amaçla Ankara Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Viral Aşı Üretim Laboratuarı bünyesinde bulunan ve Vero hücrelerinde üretilen SA BT/4 attenüe suşu kullanıldı. Hazırlanan ham aşı sırasıyla;
Lactalbumin hydrolysate %5 -sucrose %10 (LH), Weybridge Medium (%2.5 lactalbümin hyrolysate , %5 sucrose ve
%1 Sodium glutamate) (WBM), Lactalbumin hydrolysate %5 -Mannitol %10 (LM), Jelatin sorbitol (hidrolize jelatin
%3.5- D-sorbitol %3.5) (JS), distile suda %5 oranında Trehalose hidrate (TD) ile hazırlanan değişik stabilizatörlerle
karıştırılıp liyofilizasyona tabi tutuldu. Liyofilizasyon sonucunda ortaya çıkan final ürünün kalite kontrol testleri ve raf
ömrü çalışmaları gerçekleştirildi. Bu testler sonucunda; liyofilizasyon sonucunda aşı virusunda meydan gelen infektif
titredeki kayıp, denenen bütün stabilizatörler için kabul edilir düzeydeydi. Denemesi yapılan stabilizatörlerle hazırlanan aşılar zararsızdı. Raf ömrü çalışmalarında en iyi performansı Lactalbumin hydrolysate %5 -sucrose %10 (LH) ile
hazırlanan aşı gösterdi.
Anahtar sözcükler: Aşı, bağışıklık, mavidil serotip 4, raf ömrü, stabilizatör.
Production of attenuated live bluetongue serotype-4 vaccine with different stabilizers
Summary: In this study, effects of different stabilizers other than embryo extract and egg yolk used at present on lyophilisation and shelf life of attenuated lyophilized Bluetongue serotype-4 vaccine was investigated. For this purpose,
SA BT/4 attenuated vaccine strain present at Etlik Central Veterinary Control and Research Institude Viral Vaccine
Production Laboratory produced in Vero cell line is used. Bulk vaccine was mixed with 5% lactalbumin hydrolysate10%
sucrose (LS), Weybridge Medium (2.5% lactalbümin hyrolysate , 5% sucrose and 1% Sodium glutamate) (WBM), 5%
lactalbumin hydrolysate -10% Mannitol (LM), Gelatin sorbitole (3.5% hidrolised gelatine - 3.5% D-sorbitole) (JS) and
5% Trehalose hidrate (TD) in distilled water respectively as stabilizer. At the end of lyophilisation, quality control tests
and shelf life studies of the vaccines were carried out. Results indicated that; the loss of infective titre of the vaccine
virus after lyophilisation procedure was acceptable for all stabilizers, all the vaccines prepeared with mentioned stabilizers were harmless, the vaccine, prepeared with 5% lactalbumin hydrolysate-10% sucrose (LS) stabilizer had the best
performance amongst in shelf life studies.
Key words: Bluetongue serotype 4, vaccine, stabilizer, immunity, shelf life.
Giriş
Mavidil, ruminantların bulaşıcı olmayan, enfeksiyöz ve vektörler ile nakledilen bir virus hastalığıdır.
Hastalık, Reoviridae ailesi içerisinde yer alan Orbivirus genusuna dahil mavidil virusu tarafından oluşturulur (5). Günümüzde BTV’un, aralarında çapraz
bağışıklık bulunmayan 24 farklı serotipi tespit edilmiştir (5).
Mavidil virusunun bilinen tüm ruminant türlerini enfekte edebildiği düşünülmektedir. Enfeksiyon
sığır ve vahşi ruminantlarda genellikle asemptomatiktir (11). Bununla birlikte koyunlarda özellikle de
yüksek verime sahip ırklarda, yüksek ateş, nazal
akıntı baş bölgesinde ödem, oral mukozalarda hiperemi ve ülserasyon, dilde siyanoz ve ayak lezyonları
ile seyreden klinik tablo oluşturur. Ayrıca döl veriminde azalma, abort ve konjenital anomalilere de
neden olmaktadır (10, 12).
Hastalık duyarlı bireyler arasında Culicoides
spp. türü sokucu sinekler tarafından nakledilmektedir (4).
Enfekte sığırlar, 12-14 haftaya kadar uzayabilen viremi dönemi ile mavidil epidemiyolojisinde
önemli rezervuarlardır. Bu rezervuarlarda kış aylarında varlığını devam ettiren virus, kış sonunda
sokucu sinekler yolu ile duyarlı konaklardaki yayılımına devam eder (5, 10, 12).
Yazışma adresi / Correspondance: Ahmet Burak Güngör, Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, 06020, Etlik, Ankara,
Güngör AB, Kabaklı Ö, Çalışkan E. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 16-22, 2011
Mavidil enfeksiyonu, Uluslararası Salgınlar
Ofisi’nin düzenlediği A grubu hastalıklar listesinde yer almaktadır. Mavidil virusu uygun koşulları
yakaladığı dönemlerde hızlı bir şekilde yayılma
özelliğine sahiptir. Tüm bunlarla birlikte salgın
meydana gelen ülke hayvan ve hayvansal ürünlerde
uygulanan ambargolar sonucunda ciddi sosyo-ekonomik problemleri de beraberinde getirmektedir (3,
10, 14).
Ülkemizde mavidil virusunun varlığı ilk olarak
1944 yılında Hatay bölgesinde bildirilmiştir. Bunu
takiben 1978 ve 1979 yılları arasında Yonguç ve
ark.(21), tarafından ikinci bir mavidil salgını rapor
edilmiş ve etken serotip 4 olarak tanımlanmıştır.
Daha sonra enfeksiyon, sinek popülasyonunun aktif olduğu dönemlerde Ege ve Akdeniz bölgelerine
yayılmıştır. Türkiye’de halen tip 4, 9 ve 16 olmak
üzere 3 farklı serotipinin bulunduğu bildirilmektedir (6).
Modifiye canlı aşıların üretiminde, embriyolu tavuk yumurtası (ETY) ya da farklı bir türe ait
hücre kültürlerinde tekrarlanan seri pasajlar ile elde
edilen attenüe tohum suşlar kullanılmaktadır (1, 5,
7, 11). Tek bir serotipe özgü aşı ile genellikle diğer
serotiplere karşı koruyucu bağışık yanıt düzeyine
ulaşılamaz (5). Bununla birlikte segmentli virusların doğası gereği farklı serotipler arasında çeşitli
genetik alışverişlerin varlığı da bilinmektedir (6, 7).
Modifiye canlı aşılar ile yapılan aşılama çalışmalarında sahada sirküle eden serotipin belirlenerek,
kullanılan aşıların bunlara uygunluk göstermesi tavsiye edilmektedir (3, 8, 9, 13).
Modifiye canlı aşıların üretiminde, embriyolu
tavuk yumurtası (ETY) ya da farklı bir türe ait hücre
kültürlerinde tekrarlanan seri pasajlar ile elde edilen attenüe tohum suşlar kullanılmaktadır (8, 13).
Son yıllarda yapılan çalışmalarda, mavidil aşısının
ve diğer orbivirusların aşılarının liyofilizasyon aşaması sırasında kullanılan geleneksel bir stabilizatör
olan embriyo ekstraktı ve yumurta sarısı yerine değişik ve daha güvenli stabilizatörlerin etkileri araştırılmakta ve kullanılmaktadır (2, 11, 16, 17, 20,
21). Bu çalışmada attenue mavidil serotip-4 aşısının
halihazırda kullanılmakta olan embriyo ekstraktı ve
yumurta sarısından oluşan stabilizatörünün yerine
farklı stabilizatörlerin kullanılması ve bunların liyofilizasyon ve raf ömrüne etkileri araştırıldı.
17
Materyal ve Metot
Virus ve hücre kültürü: Ankara Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Viral Aşı
Üretim Laboratuarı bünyesinde bulunan SA BT/4
attenüe virus suşu kullanıldı. Hücre kültürü olarak;
CIRAD-EMVT laboratuarından temin edilen, kalite
kontrol testleri tamamlanmış 157. pasajdaki monolayer Vero hücre hattı kullanıldı.
Vasatlar: %10 fötal dana serumlu (FCS) Minimum
essential medium Eagle (EMEM), hücre ve virus
üretme vasatı olarak kullanıldı.
Stabilizatörler: Lactalbumin hydrolysate %5 -sucrose %10 (LH) , Weybridge Medium (%2.5 lactalbümin hyrolysate , %5 sucrose ve %1 Sodium
glutamate), Lactalbumin hydrolysate %5 -Mannitol
%10 (LM), Jelatin sorbitol (hidrolize jelatin %3.5D-sorbitol %3.5) (JS), Trehalose hidrate (TD) distile suda %5 kullanıldı.
Hiperimmün Serum: Mavi dil serotip 4 için tip
spesifik ticari olarak temin edilen hiperimmün serum kullanıldı.
Deneme Hayvanı: Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü bünyesindeki deneme
hayvanları bölümünde bulunan 24 adet fare, 8 adet
kobay ve 6 adet koyun kullanıldı. Çalışmalar Yerel
Etik Kurul kararına uygun olarak gerçekleştirildi.
Ana Tohum ve Çalışma Tohum Suş Üretimi: Ana
tohum ve çalışma tohum suşları, Vero hücrelerinde
3 kez pasajı yapılarak Vero hücrelerine adaptasyonu
sağlanan SA BT/4 attenüe virus suşu ile hazırlandı. Bu amaçla, 175cm2’lik hücre kültürü şişelerinde, %10 FCS ihtiva eden EMEM vasatı ile üretilen,
%90 monolayer ekime hazır vero hücreleri kullanıldı. 0.01 moi. oranında virus ile adsorbsiyonlu ekim
yöntemi kullanıldı. Adsorbsiyon süresinin sonunda,
hücre kültürü şişelerine %2 FCS’lu EMEM besi yeri
konularak, 37°C’de inkubasyona bırakıldı. Hücreler
her gün mikroskopta incelenerek, %90-100 sitopatik etki (CPE) görülen şişeler +4°C’ye kaldırıldı.
Toplanan viruslar kullanılıncaya kadar +4°C’de
saklandı. Üretilen virusun kalite kontrol testleri OIE
Terrestrial Manual, chapter 1.1.9’a göre yapılarak,
ham ürün üretiminde kullanıldı.
Ham Ürünün Elde Edilmesi: Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Viral Aşı
Üretim Laboratuvarının üretmekte olduğu BLU-T4
18
ETVAC isimli attenüe Mavidil tip-4 aşı protokolüne
göre gerçekleştirildi.
Ham Aşının Stabilizatörlerle Karıştırılması ve
Liyofilizasyon: Hazırlanan ham ürün eşit hacimde,
sırasıyla Lactalbumin hydrolysate %5 -sucrose %10
(LS serisi) , Weybridge Medium (%2.5 lactalbümin
hyrolysate , %5 sucrose ve %1 Sodium glutamate)
(WBM sersi), Lactalbumin hydrolysate %5 -Mannitol %10 (LM serisi), Jelatin sorbitol (hidrolize jelatin %3.5- D-sorbitol %3.5) (JS serisi), Trehalose
hidrate distile suda %5 ile karıştırıldı (TD serisi).
Bunu takiben her bir seri 5 ml hacimdeki aşı şişelerine 1 ml miktarında taksim edildi ve liyofilizasyon
işlemine tabi tutuldu. Alüminyum kapakları kapatıldıktan sonra kalite kontrol, bağışıklık ve raf ömrü
testleri yapılıncaya kadar -20ºC muhafaza edildi.
Raf Ömrünün Belirlenmesi: Sterilite, vakum ve
nem kontrollerinde uygun bulunan her bir aşı serisi
için; liyofilizasyon sonrası titresini saptamak amacıyla 4 ayrı mikrotitrasyon testi gerçekleştirildi ve
ortalama titre değerleri tespit edildi. Ham ürünün
ve liyofilizasyon sonrası elde edilen aşı serilerinin
enfektif titrelerinin tespiti amacıyla OIE Manual of
standarts of diagnostic tests and vaccines (15) de
belirtilen mikrotitrasyon test yöntemi kullanıldı.
Daha sonra; A. Her bir aşı serisi 37°C de 1
hafta bekletmek suretiyle hızlı raf ömrü çalışması
gerçekleştirildi. Bunun için her bir aşı serisi 37°C
inkübatörlerde 1 hafta bekletildi. Süre sonunda örnekler alındı ve her bir aşı serisi için ayrı ayrı 4 adet
mikrotitrasyon testi uygulandı, ortalama titre değerleri saptandı ve liyofilizasyon sonrası titre değerleri
ile karşılaştırıldı. B. 4°C de gerçek zamanlı raf ömrü
çalışması gerçekleştirildi. Bunun için hızlı raf ömrü
çalışmasında en iyi performansı gösteren aşı serisi
4°C’de depolanarak belli zaman aralıklarında örnekler alınarak ve ortalama titre değerini saptamak
için 4 adet mikrotitrasyon testi uygulandı.
Liyofilize aşıların kalite kontrol testleri: Raf
ömrü çalışmalarında en iyi performansı gösteren aşı
serileri zararsızlık, potens ve immujenite gibi kalite
kontrol testlerine alındı.
Zararsızlık: Bu amaçla, kobay ve fareler kullanıldı.
- Denemesi yapılan her bir stabilizatör için 4
adet kobaya intraperitoneal olarak 2 ml inokule
edildi, 4 adet kobay ise kontrol olarak bırakıldı.
- Aynı şekilde, denemesi yapılan her bir stabilizatör için 12 adet ise fareye intraperitoneal olarak
0,5ml inokule edildi, 12 adet fare kontrol olarak bırakıldı.
Kobay ve fareler uygulamadan sonra 14 gün
boyunca klinik gözlem altında tutuldu.
Potens ve İmmünojenite: Mavidil antikorları yönünden seronegatif koyunlar kullanıldı. Hayvanlar,
aşıların verilmesini takiben klinik belirtiler yönünden 28 gün süre ile takip edildi ve günde iki defa
beden ısıları alındı. Sürenin bitiminde hayvanlardan
kan serum örnekleri alınarak mavidil virusuna karşı
antikor varlığı yönünden test edildi.
Bulgular
Sterilite: Denemesi yapılan tüm aşı serileri, liyofilizasyon sonrasında yapılan testler sonucunda steril
bulundu.
Vakum: Denemesi yapılan tüm aşı serilerinde liyofilizasyon sonrasında vakum oranı %100 olarak
bulunmuştur.
Nem: Denemesi yapılan TD, WBM, LM, JS ve LH
aşı serilerinde ortalama nem oranı sırasıyla %8.87,
%7.01, %4.11, %7.75 ve %3.37 olarak bulunmuştur
(Şekil 1).
Şekil 1. Denemesi yapılan aşı serilerinde ortalama nem
oranları.
Ham ürün ile Liyofilize aşı serileri arasındaki titre farkları: TD, WBM, LM, JS ve LH aşı serileri
için üretilen Ham ürünün titresi ortalama Log 108.3
DKID50/ml olarak belirlendi. Liyofilizasyon işleminden sonra elde edilen liyofilize aşı serileri için
ortalama titre değerleri sırasıyla Log 108.17, 108.15,
107.1, 106.62 ve 108.22 DKID50/ml olarak belirlendi
(Şekil 2).
19
lama titre değeri Log 106.92 DKID50/ml (Log 106.8,
106.8, 107.1, 107.0 DKID50/ml) olarak belirlendi. Titre
değerindeki düşüş ise, Log 101.23 olarak belirlendi.
Şekil 2. Denemesi yapılan aşı serilerinde Ham ürün ve
liyofilize ürünlerin arasındaki ortalama titre değişimleri.
Raf ömrü çalışmaları
37°C de 1 hafta bekletmek suretiyle hızlı raf
ömrü çalışması: Denemesi yapılan her bir aşı serisinin liyofilizasyon sonrasında tespit edilen titre
değerleri ve bunu takiben gerçekleştirilen hızlı raf
ömrü çalışmalarında elde edilen sonuçlar, her bir aşı
serisi için aşağıda verilmiştir.
A.1. TD Aşı Serisi: Bu seri için liyofilizasyon sonrasında yapılan 4 seri mikrotitrasyon testinde ortalama titre değeri Log 108.17 DKID50/ml (Log 108.3,
108.2, 108.0, 108.2 DKID50/ml) olarak belirlendi. Bunu
takiben gerçekleştirilen hızlı raf ömrü çalışmalarında ise; yapılan 4 seri mikrotitrasyon testinde ortalama titre değeri Log 106.32 DKID50/ml (Log 106.2,
A.2. WBM Aşı Serisi: Bu seri için liyofilizasyon
sonrasında yapılan 4 seri mikrotitrasyon testinde ortalama titre değeri Log 108.15 DKID50/ml (Log 107.9,
takiben gerçekleştirilen hızlı raf ömrü çalışmalarında ise; yapılan 4 seri mikrotitrasyon testinde orta-
A.3. LM Aşı Serisi: Bu seri için liyofilizasyon sonrasında yapılan 4 seri mikrotitrasyon testinde ortalama titre değeri Log 107.10 DKID50/ml (Log 107.0,
A.4. JS Aşı Serisi: Bu seri için liyofilizasyon sonrasında yapılan 4 seri mikrotitrasyon testinde ortalama titre değeri Log 106.62 DKID50/ml (Log 106.7,
A.5. LH Aşı Serisi: Bu seri için liyofilizasyon sonrasında yapılan 4 seri mikrotitrasyon testinde ortalama titre değeri Log 108.22 DKID50/ml (Log 108.3,
Denemesi yapılan tüm aşı serilerinin hızlı raf
ömrü çalışmalarında gösterdikleri performans Tablo
1 ve Şekil 3’de özetlenmiştir.
Tablo 1. Denemesi yapılan aşı serilerinde Ham ürün, Liyofilize ürün ve hızlı raf ömrü çalışması sonunda elde edilen
titre değişimleri.
Aşı serileri
Ham ürün titre
(Log10 DKID50/ml)
Liyofilize ürün titre
(Log10 DKID50/ml)
37°C de 1 hafta sonunda titre (Log10 DKID50/ml)
TD
8,3
8,17
6,32
WBM
8,3
8,15
6,92
LM
8,3
7,10
6,37
JS
8,3
6,62
3,17
LH
8,3
8,22
8,15
20
Şekil 3. Denemesi yapılan aşı serilerinin ham ürün aşamasında, liyofilize ürün formunda ve liyofilize ürünün 37°C de
1 hafta ( hızlı raf ömrü çalışması) sonunda ortalama titreleri.
4°C’de gerçek zamanlı raf ömrü çalışması: Gerçek zamanlı raf ömrü çalışmalarına daha önceden
başlanan LH aşı serisi için elde edilen final ürün
4°C’de depolandı ve 24 ay süresince belirli zaman
aralıklarında örnek alınarak titrasyon testine tabi tutuldu. Üretilen ham aşının titresi Log 106.4 DKID50/
ml bulundu. LH ile liyofilizasyondan sonra ise bu
titre Log 106.22 DKID50/ml olarak tespit edildi. Bun-
dan sonra liyofilize ürün 4°C’de depolandı ve 12,
14, 16, 20 ve 24 üncü aylarda örnekler alınarak titrelerine bakıldı. Yapılan titrasyon testleri sonucunda
liyofilize aşının zaman içerisindeki titreleri sırasıyla Log 106.11, 106.05, 105.93, 105.85 ve 105.78 DKID50/
ml olarak bulundu. LH aşı serisinin gerçek zamanlı
raf ömrünün belirlenmesi sırasında elde edilen titre
değerleri Şekil 4’de özetlenmiştir.
Şekil 4. LH aşı serisinin gerçek zamanlı raf ömrünün belirlenmesi sırasında zaman içerisinde elde edilen titre değerleri.
Zararsızlık, potens ve immünojenite: Gerçek zamanlı raf ömrü çalışması tamamlanan LH aşı serisinin zararsızlık testlerinde aşının inokulasyonu yapılan fare ve kobaylarda 14 gün boyunca her hangi bir
klinik bulgu gözlenmedi. Potens ve immünojenite
çalışmalarında ise daha önce BT antibody ELISA
testi ile negatif olduğu belirlenen 4 koyun (1 adedi
kontrol olarak) kullanıldı. Aşı uygulamasını takiben
hayvanlarda hafif bir beden ısısı artışı (ilk 5 gün
0.3-0.5 derece) dışında herhangi bir klinik bulgu
gözlenmedi. 28 gün boyunca gözlem altında tutulan
hayvanlardan, süre sonunda kan alındı ve mavidil
antikorları yönünden test edildi. Yapılan BT antibody ELISA testi sonucunda aşılama yapılan tüm
hayvanlarda mavidil antikorları tespit edildi.
Bu araştırmamızda Vero hücrelerinde 3 kez pasajı
yapılarak Vero hücrelerine adaptasyonu sağlanan
SA BT/4 attenüe virus suşu kullanılarak değişik
stabilizatörlerle hazırlanan liyofilize atenüe mavidil
aşılarının raf ömürleri incelendi.
Günümüzde, her ne kadar mavidil attenüe liyofilize aşılarının farklı stabilizatörlerle deneme çalışmaları fazla olmasa da, veteriner kullanımda olan
liyofilize aşıların gerek stabilitesini artırmak ve gerekse raf ömrünü uzatmak amacıyla değişik stabilizatörler araştırılmıştır (11, 16, 17).
Çalışmamızın ana hattını, değişik stabilizatörlerle (TD, WBM, JS, LM ve LH) hazırlanan mavidil serotip-4 aşılarının, gerek liyofilizasyon işlemi
sırasında, gerekse liyofilizasyon işleminden sonra
kalite kontrol testleri açısından ve daha sonra da
raf ömrünün uzunluğu açısından değerlendirilmesi
oluşturmuştur.
Denemesi yapılan aşı serilerinin, liyofilizasyon işleminden sonra yapılan nem kontrollerinde,
en fazla nem oranının TD, JS ve WBM (sırasıyla
%8.87, %7.75, %7.01) aşı serilerinde olduğu gözlemlendi (Şekil1). Sparkes ve Fenje (19), liyofilize
aşılarda %6 ve üzerindeki oranındaki nem oranının
aşının stabilitesi üzerine olumsuz etkisi olduğunu
vurgulamışlardır. Nitekim TD, JS ve WBM kullanılan aşı serilerinin hızlı raf ömrü çalışmalarında en
büyük titre düşüşüne sahip oldukları (TD için Log
101.85 DKID50/ml, JS için Log 103.45 DKID50/ml ve
WBM için Log 101.23 DKID50/ml ) tespit edildi. Nem
oranlarının yüksek olmasının sebebinin, kullanılan
21
stabilizatörlerde kuru madde oranının nispeten daha
az olmasından kaynaklandığını düşünmekteyiz.
Stabilizatör olarak LH ve LM kullanılan aşı serilerinde nem oranının daha düşük olmasının (sırasıyla
%3.37 ve %4.11) bunların hızlı raf ömrü çalışmalarında daha stabil olmalarını sağlamış olma olasılığı vardır. Yukarıda bahsedilenleri doğrular şekilde
nem oranı en düşük olan (%3.37) LH aşı serisi hızlı
raf ömrü çalışmalarında en iyi performansı göstermiştir (Log 100.07 DKID50/ml).
Mariner ve ark. (10), LH, JS ve LGS gibi farklı
stabilizatörlerle termostabil sığır vebası aşı üretimini denemiş ve araştırma sonunda iyi bir performans
gösteren LH stabilizatörü önermiştir. Benzer şekilde Sarkar ve ark. (18), PPR aşısı üretiminde LH,
WBM, JS ve TD gibi farklı stabilizatörler denemiş,
LH ve TD stabilizatörü uygun bulmuşlardır.
Çalışmada stabilite açısından uygun bulduğumuz LH aşı serisi gerçek raf ömrü çalışmalarına
alındı. Bu çalışmalarda da iki senelik zaman aralığı
içerisinde söz konusu aşı serisinin enfektif titresinde Log 100.44 DKID50/ml oranı gibi hafif bir düşüş
gözlemlendi.
Aynı zamanda hazırlanan bu aşının zararsızlık,
potens ve immüjenite çalışmaları yapıldı. Bu testler
sonucunda da kobay ve farelerde zararsız olduğu
tespit edildi. Koyunlarda yapılan potens ve immüjenite çalışmalarında ise herhangi bir patojenite veya
alerjik reaksiyon oluşturmadığı ve aşılama yapılan
tüm hayvanlarda yeterliği bağışıklığı sağladığı ortaya konmuştur.
Araştırmamızın sonunda elde edilen bulgular
ve diğer araştırmaların ışığında, attenue Mavidil
Serotip-4 liyofilize aşısının geleneksel stabilizatörü
olan embriyo ekstraktı ve yumurta sarısının yerine,
Lactalbumin hydrolysate %5 -sucrose %10 (LH)
karışımından oluşturulmuş stabilizatörün güvenle
kullanılabileceği ortaya konmuştur. Bu yeni stabilizatörle hazırlanan aşıların da raf ömrünün 2 yıla
kadar uzayabileceği tespit edilmiştir.
Bunun yanı sıra, bu stabilizatörün kullanılmasıyla; mavidil tip 4 aşısında kullanılan yumurta
sarısı ve embriyo ekstraktının hazırlanması ve uygulanması zor olduğundan, aşı üretim aşamalarında
kontaminasyon riski ve buna bağlı ekonomik kayıpların azalacağı, buna bağlı olarak da üretimin daha
güvenli, hızlı ve ekonomik olacağı kanısındayız.
22
Kaynaklar
1. Alexander RA, Haig DA, (1951). The use of egg attenuated
bluetongue virus in the production of a polyvalent vaccine
for sheep. Onderstepoort J Vet Res, 26, 3-15.
2. Anonim, Bluetongue vaccine, method of producing same
and method of immunizing rumminants therewith. Erişim
adresi: http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?IA=US1983
000052&DISPLAY=DESC, Erişim tarihi: 03.03.2011
3. Anonim, European Commision Health Consumer Protection
Directorate General (Sanco/C3/AH/R19/2000) Possible
use of vaccination against Bluetongue in Europe. Scientific
Committee on animal health and animal welfare. Adopte
27 june 2000.
4. Bréard E, Sailleau C, Coupier H, Mure-Ravaud K, Hammoumi S, Gicquel B, Hamblin C, Dubourget P, Zientara
S, (2003). Comparison of genome segments 2, 7 and 10 of
bluetongue viruses serotype 2 for differentiation between
field isolates and the vaccine strain. Vet Res. 34, 777-789.
5. Erasmus BJ, (1990). Bluetongue virus. Dinter Z, Morein B.
eds. Virus Infections of Ruminants. Elsevier Science Publishers. Chapter 21, p. 227-237.
6. Ertürk A, Tatar N, Kabaklı O, İncoğlu S, Çizmeci SG,
Barut FM, (2004). The current situation of bluetongue in
Turkey. Vet Ital. 40 (3), 137-140.
7. Hammoumi S, Breard E, Sailleau C, Russo P, Grillet C,
Cetre-Sossah C, Albina E, Sanchis R, Pepin M, Guibert J, Zientra S, (2003). Studies on the Safety and Immunogenicity of the South African BluetongueVirus Serotype
2 Monovalent Vaccine: Specific Detection of the Vaccine
Strain Genome by RT-PCR. J Vet Med. 50, 316-21.
8. Kirkland PD, Hawkes RA, (2004). A comparisation of laboratory and wild strains of bluetongue virus- is there any
difference and dose it matter? Vet Ital. 40 (4), 448-455.
9. Mann N, Mann S, Singh KP, Samuel AR, Mertens P,
(2004). Development of reverse transcriptase-polymerase
chain reaction-basedassays and sequencing for typing European strains of bluetongue virusand differential diagnosis of field and vaccine strains. Vet Ital. 40 (4), 552-561.
10. Mellor PS, Wittmann EJ, (2002). Bluetongue virus in the
mediterranean basin 1998-2001. Vet J. 164(1), 20-37.
11. Mariner JC, House AE, Sollod C, Mebus CA, (1990).
Comparison of the effect of various stabilizers and lyophilization cycleson the thermostability of a Vero Celladapted rinderpest vaccine. Vet Microbiol. 21(3), 195209.
12. Monaco F, Camma C, Serini, Savini G, (2006). Differentiation between field and vaccine strain of bluetongue virus
serotype 16. Vet Microb. 166, 45-52.
13. Murphy FA, Gibbs JEP, Horzineck CM, Studdent MJ,
eds., (1999). Veterinary Virology. Third Edition. Raven
Press Ltd. New York.
14. Murray PK, Eaton BT, (1996). Vaccines for bluetongue.
Aust Vet J. 73(6), 207-210.
15. OIE, (2000). Manual of Standarts for Diagnostic Tests
and Vaccines Bluetongue. Erişim adresi: http://www.
oie.int.norms.MMANUAL/A_00026.htm. Erişim tarihi:
03.03.2011.
16. Ozawa Y, Bahrami S, (1968). Effects of Freezing on African Horse Sickness Virus. Arc Virol. 26(2), 201-210.
17. Rashid A, Asım M, Chaudhary H, (2008). Effect of various stabilizers on titre of lyophilized live-attenuated Peste
Des Petits Rumminants (PPR) vaccine. Pakistan Vet J.
28(4), 203-204.
18. Sarkar J, Sareenivasa BP, Singh RP, Dhar P, Bandyopadhyay SK, (2003). Comparative efficiency of various
chemical stabilizers on the thermostability of a live-attenuated Peste de Petits Rumminants (PPR) vaccine. 21, 47284735.
19. Sparkes JD, Fenje P, (1972). The effect of residual moisture
in lyophilized smallpox vaccine on its stability at different
temperatures. Bull World Health Organ. 46 (6), 729-734.
20. Wittmann E, Mellr P, Baylis M, (2001). Using climate
data to map the potential distribution of Culicoides imicola
(Diptera: Ceratopogonidae) in Europe. Rev Sci Tech. 20
(3): 731-740.
21. Yonguç AD, Taylor WP, Csontos L, Worrall E, (1982).
Bluetongue in Western Turkey. Vet Rec Aug. 111, 144-146.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, Babacan
22, 23-26,O2011
23
ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22,Araştırma
23-26, 2011Makalesi / Research Article
Kedi ve köpeklerden izole edilen dermatofit etkenlerinin retrospektif
değerlendirilmesi
Orkun BABACAN, Bülent BAŞ, H. Kaan MÜŞTAK, Özlem ŞAHAN, Oya TEKİN, Ebru TORUN
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye
Özet: Bu çalışmada 2006-2011 yılları arasında Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi kliniklerinden Mikrobiyoloji
Anabilim Dalı’na farklı mevsimlerde gönderilen dermatofitoz şüpheli kedi ve köpekten alınan toplam 420 deri kazıntısı
ve kıl örneği dermatofit etkenleri yönünden incelendi. Kedilerden alınan 147 materyalin 34’ünden (%23.1) Microsporum spp. ve 6’sından (%4.0) Trichophyton spp.; köpeklerden alınan 273 materyalin 43’ünden (%15.7) Microsporum
spp. ve 12’sinden (%4.3) Trichophyton spp. izole edildi. Dermatofitozis olgularına diğer mevsimler ile karşılaştırıldığında ilkbahar mevsiminde ve kedilerde %46.1, köpeklerde ise %34.0 olmak üzere daha yüksek oranda rastlandı.
Anahtar sözcükler: Dermatofit, izolasyon, kedi, köpek.
Retrospective evolution of dermatophytes isolated from cats and dogs
Summary: In this study, 420 skin scrapings and hair samples taken from 147 cats and 273 dogs sent from Ankara University Faculty of Veterinary Medicine Clinics to Department of Microbiology with dermatophytosis suspicion between
the years 2006-2011 were investigated. Thirty four (23.1%) Microsporum spp. and 6 (4.0%) Trichophyton spp. were isolated from 147 samples taken from cats; 43 (15.7%) Microsporum spp. and 12 (4.3%) Trichophyton spp. were isolated
from 273 samples taken from dogs. Comparison of seasonal isolation rates showed that the dermatophyte incidence in
spring had higher isolation rates; 46.1% from cats and 34.0%; than the other seasons.
Key words: Cat, dermatophyte, dog, isolation.
Giriş
Dermatofitozis, fungal etkenler tarafından oluşturulan, kıl folikülleri, tırnak ve epidermisin keratin tabakasını etkileyen infeksiyöz ve zoonoz bir hastalıktır.
Dermatofitozise neden olan etkenler Microsporum,
Trichophyton ve Epidermophyton cinsinde bulunur
ve orijinlerine göre zoofilik, antropofilik ve jeofilik
olarak üç grup altında toplanabilirler. Zoofilik dermatofit türleri olarak adlandırılan grup (Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes) zoonotik
özelliktedir ve infekte hayvanlardan diğer hayvanlara ve insanlara bulaşarak infeksiyona neden olurlar (2). Antropofilik türler (Microsporum audouinii)
insanlarda görülür, fakat hayvanlarda normalde
görülmeyen türlerdir. Jeofilik dermatofitler ise topraktan hem hayvanlara ve hem de insanlara bulaşarak infeksiyonlara neden olurlar. Microsporum
gypseum ve Trichophyton terrestre en sık görülen
jeofilik dermatofitlerdendir. Hayvanlarda dermatofitozise özellikle Microsporum ve Trichophyton cinsinde bulunan türler neden olur (2, 7, 11). M.canis
en yaygın olan türdür ve özellikle kedilerde infeksiyon oluşturur. M.gypseum ve T.mentagrophytes
türleri de kedi ve köpeklerde infeksiyon meydana
getirir. Diğer dermatofit türleri ise daha az sıklıkta
infeksiyon oluştururlar (11).
Genel olarak dermatofitozise genç hayvanlar
daha duyarlıdır (2, 3). Ayrıca kötü besleme, sıkışık
barındırma, infekte hayvanlara yeterli karantina süresinin uygulanmaması risk faktörleri arasındadır.
Dermatofitler, infekte hayvanların kılları ile temas,
fomitler veya toprak gibi çevresel faktörler ile diğer
duyarlı hayvanlara ve insanlara bulaşırlar. İnsanlara
bulaşma potansiyeli olan M.canis’in rezervuarı kedilerdir (11).
M.canis başta olmak üzere bazı etkenler hayvanlara bulaşmayı takiben 7 gün içerisinde Wood
lambası altında floresan verirler ve klinik belirtiler
ise 2-4 hafta içerisinde ortaya çıkar. Dermatofitler
kıl, tırnak ve derinin dış tabakası gibi keratinize tabakalarda ürerler. Mukoz membranlar hastalıktan
etkilenmez. Lezyonlar sirkuler yapıdadır ve “rin-
Yazışma adresi / Correspondance: H. Kaan Müştak, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 06110,
Dışkapı, Ankara, Türkiye. E-posta: [email protected]
Babacan O ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 23-26, 2011
24
gworm” olarak adlandırılır. Köpeklerde dermatofitoza genellikle yavrularda daha sık rastlanır. Erişkin
köpeklerde ise immunsupresyon durumunda hastalık görülür. Lezyonlar vücudun herhangi bir bölgesinde ve küçük sirküler kıl dökülmeleri şeklinde
görülür. Lezyonun merkezi sınırlanmış pullu görünümde ve eritamatözdür. İlerleyen dönemde lezyon
kabuklanır ve şişkinlikler görülür. Vezikül ve püstüller, infeksiyonun erken dönemlerinde görülebilir.
Çoğu infekte kedide lezyon görülmez veya az görülür. Uzun tüylü kediler subklinik taşıyıcı olabilirler.
Kedi yavrularında hastalığın erken döneminde yüz,
kulak ve ayak tabanında semptomlar görülebilir.
Genellikle fokal alopesi, kabuklu ve pullu deri görünümü ve kıllarda bozukluklar görülür (8, 11).
Mikroskobik olarak deri kazıntıları ve kıllardan
%10’luk KOH ile hifa veya konidialar görülebilir.
Kesin tanı kültür sonucuna göre değerlendirilir. Deri
kabukları ve kökleri ile alınmış kıl örnekleri kültür
için kullanılır. Kedi ve köpeklerde dermatofitozise
neden olan türler 4-7 gün inkubasyon süresinde 2528°C’de ürerler. Türler; makroskobik olarak şekillenen kolonilerin yapısı ve rengi, mikroskobik olarak ise makrokoinida, mikrokonidia, spor ve diğer
mantar yapıları ile identifiye edilirler (9, 11).
Bu çalışmada, Ankara Üniversitesi Veteriner
Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’na getirilen
dermatofitoz şüpheli kedi ve köpeklerden alınan örneklerden dermatofitoza neden olan mantarların direkt mikroskopi ve mikolojik kültür yöntemleri ile
tanımlanması amaçlandı.
Materyal ve Metot
Bu çalışmada; 2006-2011 yılları arasında Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Klinikleri’nden
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’na farklı mevsimlerde
gönderilen 147 kedi ve 273 köpekten alınan toplam
420 deri kazıntısı ve kıl örneği kullanıldı (Tablo 1).
Tablo 1. Toplanan örnek sayıları ve mevsimsel dağılımları.
Hayvan Türü Sonbahar Kış İlkbahar Yaz Toplam
Kedi
51
37
26
33
147
Köpek
87
79
50
57
273
Toplam
138
116
76
90
420
Deri kazıntısı ve kıl örneklerinin alınması: Dermatofitozun laboratuvar tanısı amacıyla hayvanlardan deri kazıntısı ve kıl örnekleri alındı. Lezyonlarda bulunan yabancı maddeler ve kontaminantları temizlemek amacıyla örnekleme yapılan alan %70’lik
alkolle silindi. Alkol kuruduktan sonra steril pens ve
bisturi kullanılarak lezyonların kenarlarındaki birden fazla bölgeden yeterli miktarda deri kazıntısı ve
kıl örneği direkt mikroskobik muayene, izolasyon
ve identifikasyon yapılması amacıyla alındı (1, 5).
Direkt mikroskobik muayene: Alınan deri kazıntısı ve kıl örneklerinden %10’luk KOH ile preparatlar
hazırlandı. Bu amaçla lam üzerine %10’luk KOH
çözeltisinden bir damla konuldu. Üzerine steril pens
yardımıyla alınan örnek konuldu. Lamel kapatılarak
preparat hafifçe alttan ısıtıldı ve oda ısısında 30-60
dakika bekletildi. Daha sonra mikroskopta dermatofitlere ait spor ve hifa yapıları arandı (1, 5).
İzolasyon ve identifikasyon: Kedi ve köpeklerden
alınan tüm örneklerden izolasyon çalışması yapıldı.
Örneklerden, bileşiminde kloramfenikol ve siklohekzimid bulunan Sabouraud Dekstroz Agar (SDA)
besi yeri yüzeyine yerleştirilen marazi maddelerin
steril pens veya bistüri ile besi yerinin içine gömülmesiyle ekimler yapıldı. Ekim yapılan besi yerleri
aerobik koşullarda 25°C’de 4 hafta süreyle inkübe
edildi ve her gün kontrol edilerek üreme olan örnekler kaydedildi (1, 5).
İnkübasyon süresince, şekillenen koloniler
makroskobik ve mikroskobik özelliklerine göre
identifiye edildi. Makroskopik olarak besi yerinde
şekillenen kolonilerin üreme durumu ve süresi, yapısı ve petrinin ön-arka yüzündeki pigmentasyon
özellikleri dikkate alındı. Mikroskobik muayenede ise, SDA’da şekillenen kolonilerden Laktofenol
Pamuk Mavisi solüsyonu (fenol 10.0 g, laktik asit
20.0 g, gliserin 40.0 g, anilin mavisi 0.05 g, distile
su 20.0 ml) ile preparat hazırlandı. Bu amaçla lam
üzerine Laktofenol Pamuk Mavisi solüsyonundan
bir damla konuldu. Şekillenen koloninin dış kenarından bir parça steril bisturi ile alınarak bu solüsyonun üzerine konuldu. Preparatın üzeri lamel ile
kapatıldı ve mikroskopta mantar kolonilere ait hifa,
makrokonidium, makrokonidium ve spor yapıları
incelenerek, dermatofitler cins düzeyinde değerlendirildi (1, 5).
Bulgular
Yüz kırk yedi kedi ve 273 köpeğe ait toplam 420
materyalden, kedilerde 40 (%27.2), köpeklerde ise
55 (%20.1) örnekten dermatofit izole edildi. (Tablo 2). Kedilerden alınan 147 materyalin 34’ünden
(%23.1) Microsporum spp. ve 6’sından (%4.0) Trichophyton spp.; köpeklerden alınan 273 materyalin
43’ünden (%15.7) Microsporum spp. ve 12’sinden
(%4.3) Trichophyton spp. izole edildi. İzole edilen
dermatofit etkenleri Tablo 3’de, mevsimsel dağılımları ise Tablo 4’te gösterilmiştir.
Tablo 2. Dermatofit izole edilen kedi ve köpek sayıları.
Hayvan Türü Örnek Sayısı Pozitif Örnek Sayısı (%)
Kedi
147
40
27.2
Köpek
273
55
20.1
Toplam
420
95
22.6
Tablo 3. Türlere göre izole edilen dermatofit etkenlerinin
sayı (n) ve yüzde (%) oranları.
Dermatofit Türü
Kedi
Köpek
Toplam
n
n
n
(%)
(%)
(%)
Microsporum spp.
34 85.0 43 78.2 77 81.1
Trichophyton spp.
6
Toplam
40 100
15.0 12 21.8 18 18.9
55 100
95 100
Tablo 4. Dermatofit izole edilen örneklerin mevsimsel
dağılımı.
Hayvan
Sonbahar
Kış
İlkbahar
Yaz
Türü
N/n
(%)
N/n
(%) N/n
Kedi
51/14
27.4
37/5
13.5 26/12 46.1 33/9 27.2
Köpek
87/10
11.4
79/9
11.3 50/17 34.0 57/19 33.3
Toplam
138/24 17.3
(%) N/n
(%)
116/14 12.0 76/29 38.1 90/28 31.1
Zoofilik, antropofilik ve jeofilik dermatofitler tarafından meydana getirilen dermatofitoz, vücudun yüzeysel bölgelerinde meydana gelen zoonotik özelliklte infeksiyöz bir hastalıktır (2, 11). Dermatofitoza
neden olan etkenlerin klinik olarak sağlıklı kedi ve
köpeklerden de izole edildikleri bildirilmiştir. Klinik
olarak bulgu göstermeyen kedilerden %15.0-30.4,
25
köpeklerden ise %18.4-75.0 oranlarında dermatofit
izole edilmiştir (11). Yapılan bu çalışmada, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Klinikleri’nden
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’na gönderilen, 147
kedi ve 273 köpekten alınan toplam 420 klinik örnek, dermatofit etkenleri yönünden değerlendirildi.
İncelenen örneklerden, kedilerde 40’ı (%27.2), köpeklerde ise 55’i (%20.1) olmak üzere 95’i (%22.6)
dermatofit yönünden pozitif olarak bulundu.
Dermatofitoz görülme oranı değerlendirildiğinde (kedi %27.1 ve köpek %20.1) izolasyon oranları arasında farklılık olduğu ve kedilerde görülme
oranının daha fazla olduğu saptandı. Kosravi ve
Mahmoudi (6), Tel ve Akan (13) tarafından yapılan çalışmalar bu görüşü destekler niteliktedir. Buna
paralel olarak ayrıca Cafarchiac ve ark. (4) kedilerde %28.2, köpeklerde ise %20.5; Çiftci ve ark. (5)
kedilerde %21.9, köpeklerde %19.6; Khorsravi ve
ark. (6) kedilerde %54.8, köpeklerde %8.2 oranında
tespit etmişlerdir. Çiftci ve ark. (5) tarafından yapılan çalışmada kedi ve köpek arasında görülme oranı
arasında farklılık görülmemiştir. Bernardo ve ark.
(2) köpeklerde %11.2 ve kedilerde %6.9 oranında
dermatofitoz etkenleri izole etmişlerdir. Bu çalışmada dermatofit izolasyon oranları kedi ve köpeklerde
karşılaştırıldığında kedilerde (%27.2), köpeklerden
(%20.1) daha fazla oranda dermatofit izole edilmiştir.
Dermatofit pozitif olarak sonuçlanan örneklerin mevsimsel dağılımı sonbahar için, kedilerde
%27.4, köpeklerde %11.4 oranında tespit edildi.
Çiftci ve ark. (5) diğer mevsimlere oranla sonbahar
mevsiminde (kedilerde %38.8, köpeklerde %21.4)
daha yüksek düzeyde dermatofit izole etmişlerdir.
Çiftci ve ark. (5)’nın ilkbahar mevsiminde tespit ettiği dermatofit izolasyon oranları kedilerde %30.5,
köpeklerde ise %28.5 iken; yapılan bu çalışmada
oranlar kedilerde %46.1, köpeklerde %34.0 olarak
bulundu.
Kedi ve köpek dermatofitozu üzerinde yapılan
çalışmalarda dermatofitozun sonbahar ve kış aylarında arttığı bildirilmiştir (5). Yapılan bu çalışmada
ise, dermatofitoz etkenlerine en fazla ilkbahar mevsiminde rastlandı (köpek %34.0, kedi %46.1). Şeker
ve Doğan’ın (12) yaptıkları çalışma bu sonucu destekler niteliktedir.
Kedi ve köpeklerde dermatofitoza neden olan
birçok mantar türü vardır. Çeşitli araştırmacılar kedi
ve köpeklerde dermatofitoza neden olan etkenlerin
26
başında Microsporum spp. ve Trichophyton spp.’yi
göstermişlerdir (12). Bu çalışmada, Microsporum
spp. kedilerde; %85.0, köpeklerde %78.1 oranında; Trichophyton spp. ise kedilerde %15.0, köpeklerde %21.8 oranında oranında izole edildi. Çiftci
ve ark. (5) Microsporum spp.’yi kedilerde %61.6,
köpeklerde %60.0 oranında; Trichophyton spp.’yi
kedilerde %38.9, köpeklerde %40.0 oranında izole etmişlerdir. Nichita ve ark. (10) ise Microsporum
spp.’yi kedilerde %11.8, köpeklerde %5.9 oranında;
Trichophyton spp.’yi kedilerde %13.8, köpeklerde
%1.9 oranında izole etmişlerdir. Bildirilen sonuçlar
yapılan bu çalışma ile karşılaştırıldığında, incelenen
örnek sayıları da göz önüne alındığında benzer izolasyon oranlarının saptandığı anlaşıldı.
Sonuç olarak, yapılan bu çalışmada elde edilen yüksek izolasyon oranları dermatofitlerin kedi
ve köpeklerde halen sorun teşkil ettiğini göstermiştir. Evcil hayvanlardan izole edilen dermatofitlerin
çoğunun insanlarda da hastalık oluşturması, kedi
ve köpeklerin de insanlar için potansiyel bulaşma
kaynağı olmasından dolayı (2, 5, 11) dermatofitoza
neden olan etkenlerin tür düzeyinde saptanması için
daha fazla çalışma yapılmasının yararlı olacağı kanısına varıldı.
Kaynaklar
1. Arda M, (2000). Preparat ve Kültür Hazırlama Yöntemleri.
356-357. In: M Arda, Temel Mikrobiyoloji. 2.Baskı. Medisan Yayınevi, Ankara.
2. Bernardo F, Lança A, Guerra MM, Martins MH, (2005).
Dermatophytes isolated from pet, dogs and cats, in Lisbon,
Portugal (2000-2004). RPCV, 100, 85-88.
3. Bond R (2010). Superficial veterinary mycoses. Clin Dermatol, 28, 226- 236.
4. Cafarchia C, Romito D, Sasanelli M, Lia R, Capelli G,
Otranto D, (2004). The epidemiology of canine and feline
dermatophytoses in southern Italy. Mycoces, 47, 508-513.
5. Çiftci A, İça T, Sareyyüpoğlu B, Müştak HK, (2005). Kedi
ve köpek dermatofitozlarından izole edilen mantarların retrospektif değerlendirilmesi. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52,
45-48.
6. Khosravi AR, Mahmoudi M, (2003). Dermatophytes isolated from domestic animals in Iran. Mycoces, 46, 222- 225.
7. Menelaos FA, (2006). Dermatophytosis in dog and cat. Buletin USAMV- CN, 63, 304-308.
8. Moriello K, (2004). Treatment of dermatophytosis in dogs
and cats: review of published studies. Vet Dermatol, 15,
99-107.
9. Moriello KA, (2001). Diagnostic Techniques for Dermatophytosis. Clinical Techniques in J Small Anim Pract, 16,
219- 224.
10. Nichita I, Marcu A, (2010). The Fungal Microbiota Isolated from Cats and Dogs. J Anim Sci, 43, 411-414.
11. OIE, (2005). Dermatophytosis. Erişim adresi: http://www.
cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/
dermatophytosis.pdf,
Erişim Tarihi: 07.03.2011.
12. Seker E, Dogan N, (2011). Isolation of dermatophytes from
dogs and cats with suspected dermatophytosis in Western
Turkey. Prev Vet Med, 98, 46–51.
13. Tel OY, Akan M, (2008). Kedi ve köpeklerden dermatofitlerin izolasyonu. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 55, 167-171.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, Güleğen
22, 27-31,
27
AE2011
ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22,Araştırma
Sığırların doğal kene enfestasyonlarında bazı sentetik pyrethroid’lerin etkisi
A. Ender GÜLEĞEN1, A. Onur GİRİŞGİN2, Serkan BAKIRCI3, Bayram ŞENLİK2, Levent AYDIN2
Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Araştırma Uygulama Merkezi, Bursa, Türkiye, 2 Uludağ Üniversitesi
Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı, Bursa, Türkiye, 3Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Parazitoloji Anabilim Dalı, Aydın, Türkiye
1
Özet: Türkiye’de tüm yıl boyunca sığırlarda gözlenen ixodid keneler, özellikle ilkbahar ve yaz aylarında artarak çeşitli
patojenleri naklederler. Sığırlardaki kene enfestasyonlarına karşı sentetik pyrethroid grubu ilaçlar etkileri, kullanım
kolaylığı ve ette-sütte kalıntı bırakmadıkları için tercih edilmektedir. Bu çalışmada sığır kenelerine karşı sentetik pyrethroid grubu ilaçlardan %1 flumethrin dökme, %7.5 flumethrin banyo, %1 deltamethrin dökme, %5 deltamethrin
banyo, %2.5 cypermethrin dökme ilaçlarının tedavi edici ve koruyucu etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Her bir
ilaç için sabahları meraya çıkıp akşamları ahıra dönen sığırlardan yedişerli gruplar oluşturulmuş, bir grup ise ilaçlanmadan kontrol tutulmuştur. Tedaviden önce sığırlardaki keneler sayılmış, ilaçlamalardan sonra 42 gün boyunca her hafta
tüm sığırlar keneler yönünden kontrol edilmiştir. Tedaviden sonraki ilk hafta tüm tedavi gruplarında hiçbir canlı keneye
rastlanmazken, 2. haftadan itibaren , %5 deltamethrin banyo grubunda canlı keneler gözlenmeye başlanmıştır. En uzun
etkili ilaç ise 4 hafta ile %1 flumethrin dökme çözeltisi olmuştur. İstatistiki olarak gruplar kendi aralarında karşılaştırıldığında, %1 flumethrin dökme çözeltisi ile , %2.5 cypermethrin dökme çözeltisi arasında ve tüm tedavi grupları ile
kontrol grupları arasında belirgin bir farklılık ortaya çıkmıştır (P< 0.05). Çalışma boyunca herhangi bir yan etkiye rastlanmamıştır. Sonuç olarak sığırlarda kene enfestasyonlarına karşı flumethrin etken maddesi içeren bir ilaç ile yapılacak
kene mücadelesinin etkili olacağı belirlenmiştir.
Anahtar sözcükler: Etki, kene, sentetik pirethroid, sığır.
Efficacy of some synthetic pyrethroids against ticks in naturally infested cattle
Summary: The ixodid ticks observed during whole year can transport numerous bacterial, viral and parasitic diseases
especially on spring and summer season to the cows in Turkey. Synthetic pyrethroid group drugs were preferred because
of their effect, ease of use and no residue on milk / meat against tick infestations of cows. The aim of this study is to
determine the efficacy of treatment and protectiveness of flumethrin 1% pour-on, flumethrin 7.5% dipping, deltamethrin
1% pour-on, deltamethrin 5% dipping and cypermethrin 2.5% pour-on drugs. Six groups of grazing cows were composed which five of them are treatment group and one group is untreated control containing seven cows per group. All
groups were examined for ticks before treatment and every week for 42 days after treatment and the count of ticks were
noted. After treatment, no live ticks were observed in the first week in all treatment groups, but beginning from the second week, some live ticks were detected in deltamethrin 5% dipping group. Flumethrin 1% pour-on drug was detected
as the longest effective drug in the treatment group. Significant difference was detected between flumethrin 1% pour-on
group and cypermethrin 2.5% pour-on group; and all treatment groups and control group, when they compared to each
others statistically (P<0.05). None of adverse effects was observed from all drugs throughout study. Consequently, an
effective tick control can be achieved by flumethrin ingredient drug on infested cattle.
Key words: Cow, efficacy, synthetic pyrethroids, tick.
Giriş
Ixodidae ailesindeki keneler, evcil ve yabani hayvanlarda tüm yıl boyunca görülmelerine karşın,
özellikle ilkbahar-sonbahar ayları arasında sığırlarda yaygın olarak bulunan Rhipicephalus ve Hyalomma türleri kan emmek suretiyle verim düşüklüğü ve anemiye sebep olmakta, ayrıca birçok patojen
hastalık etkenini nakletmektedir (8).
Türkiye’de sığırlarda görülen theileriosis, babesiosis, anaplasmosis gibi başlıca kan parazitlerinin
yanında, insanlarda Kırım Kongo Kanamalı Ateşine
ve Riketsia hastalıklarına neden olan kenelere karşı
korunmada karbamat grubu ve organik fosforlu insektisitlere ilaveten son yıllarda sentetik pyrethroidlerin kullanımı yaygınlaşmıştır (5, 11).
Sentetik pyrethroidler, toksik etkilerini hedef
artropodun sodyum kanalları üzerinde gösteren, pe-
Yazışma adresi / Correspondance: A. Onur Girişgin, Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı, Nilüfer,
Bursa, Türkiye. E-posta: [email protected]
28
Güleğen AE ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 27-31, 2011
riferik ve merkezi sinir sistemi üzerindeki aksonları
etkileyen sinir sistemi zehridir. Bu grup ilaçlardan
deltamethrin, cypermethrin ve flumethrin, dünyada
kenelere karşı mücadelede kullanılmaktadır (1).
Dünyanın birçok ülkesinde yapılan çalışmalarda pour-on (dökme) tarzında kullanılan sentetik
pyrehroidlerden ixodid kenelere karşı yüksek etki
görülmüştür. Afrika’nın güneyindeki dört ülkeyi
kapsayan bir alanda yapılan çalışmada flumethrin’in
%1’lik dökme çözeltisi sığırlardaki Amblyomma
cinsi keneleri tam olarak temizlemiştir (7).
Dorn ve Pulga (4), Güney Amerika’nın değişik
ülkelerinde sığırlardaki Boophilus microplus’a karşı
1 mg/kg dozundaki %1’lik flumethrin’in 21. günde
%99 etkili olduğunu saptamışlardır.
Türkiye’de sığır kenelerine karşı daha çok
%1’lik flumethrin’in dökme çözeltisi denenmiştir.
Tüzer ve Tınar (11), %1 dökme çözeltisiyle üç hafta
süreyle tam, beş hafta süreyle çok iyi bir koruma
elde etmişlerdir. Dumanlı ve Yılmaz (5) ise flumetrinin %1 dökme çözeltisine ilaveten %0.05 solüsyonunu pulverizasyonla sığırlara uygulamışlar %100
‘lük bir etki sağlamışlardır.
Bu çalışma, saha şartlarında sığırların ixodid
kene enfestasyonlarına karşı flumethrin %1 dökme,
flumethrin %7.5 banyo, deltamethrin %1 dökme,
deltamethrin %5 banyo, cypermethrin %2.5 dökme
ilaçlarının tedavi edici ve koruyucu etkilerinin belirlenmesi ve karşılaştırılması amacıyla yapılmıştır.
Materyal ve Metot
Araştırma Bursa’nın Orhaneli ilçesine bağlı 600 m
rakımlı Erenler köyünde, Mayıs-Haziran 2008 tarihlerinde gerçekleştirilmiştir. Köyde sığır yetiştiriciliği yapan yetiştiricilerdeki sığırlar kene enfestasyonu yönünden incelenmiş ve yeterli derecede kene
bulunan sığırlar kayıt altına alınmıştır. Tamamı sabah meraya çıkıp akşam ahıra dönen, yaşları 2-6,
canlı ağırlıkları 150-300 kg arasında değişen, çeşitli
ırk ve cinsiyetlerden toplam 42 sığırdan beş deneme
bir kontrol grubu oluşturulmuştur.
İlk gruba %1’lik flumethrin 1 mg/kg dozda sırt
çizgisi boyunca dökme tarzında, 2. gruba %7.5’luk
flumethrin 1 ml/ 1 lt su dozunda hazırlanarak banyo tarzında süngerle, 3. gruba %1’lik deltamethrin
1 mg/kg dozda sırt çizgisi boyunca dökme tarzında,
4. gruba %5’lik deltamethrin 1 ml/ 1 lt su dozunda hazırlanarak banyo tarzında süngerle, 5. gruba
%2.5’luk cypermethrin 1 mg/kg dozda sırt çizgisi
boyunca dökme tarzında uygulanmış, son gruba ise
herhangi bir ilaç uygulanmamış ve kontrol olarak
tutulmuştur. Tedavi ve kontrol grubundaki sığırlar,
araştırma boyunca bir arada aynı meraya çıkmışlardır.
Tedavilerden sonraki 1., 3., 7., 14., 18., 21., 28.,
35. ve 42. günlerde kontroller yapılarak, hayvanların üzerlerindeki ölü ve canlı kenelerin sayıları not
edilmiştir. Tüm keneler her hayvan için ayrı ayrı
tüplere konmuş ve tür teşhislerinin yapılması amacıyla laboratuara götürülmüştür.
Araştırma sonunda laboratuara getirilen bütün
keneler stereo mikroskopta incelenerek morfolojik yapılarına göre tür teşhisleri yapılmıştır (2).
Kullanılan ilaçların etkilerini istatistik açıdan belirlemek amacıyla sonuçlara ki kare testi, ilaçların
etkilerini kendi aralarında karşılaştırmak amacıyla
da Tukey’in çoklu karşılaştırma testi uygulanmıştır
(9).
Bulgular
Araştırma süresince sığırlar üzerinden toplanan keneler Hyalomma marginatum, H.anatolicum, Rhipicephalus turanicus, R.sanguineus ve R.bursa olarak
teşhis edilmişlerdir. Tüm keneler, sığırların vücutlarının özellikle arka 1/3’ünde anal bölge, kuyruk altı
ve bacakların iç kısımlarından toplanmıştır. Araştırma süresince tedavi ve kontrol gruplarında rastlanan
canlı kene sayıları Tablo 1’de gösterilmiştir.
Tablodan da görüleceği gibi, %5 deltamethrin
banyo haricindeki gruplarda ilaçlamadan sonraki ilk
14 günde herhangi bir canlı keneye rastlanmamıştır.
%5 deltamethrin grubunda ise ilaçlamadan sonraki
7. günde canlı keneler görülmeye başlanmış, 14.
günden itibaren kene sayılarının arttığı tespit edilmiştir. Tedavi süresince, en uzun etkili ilaç 21 gün
ile %1 flumethrin dökme çözeltisi olmuş, 28. günden itibaren keneler gözlenmeye başlanmıştır.
Tüm veriler değerlendirildiğinde, ilk iki hafta için %5 deltamethrin banyo çözeltisinin etkisi
%92.2, diğer ilaçların ise %100 olmuştur. Belirlenen tüm günler için etkilerin yüzdesi Grafik 1’de
gösterilmiştir.
İlaç kullanımından sonra 42 gün içinde sayılan
canlı kene sayılarına göre, ilaçların Tukey’in çoklu
karşılaştırma testinde kendi aralarında karşılaştırılmaları sonucu, kontrol grubuyla tüm gruplar arasında; ayrıca %1 flumethrin dökme çözeltisi ile %2.5
cypermethrin dökme çözeltisi arasında P<0.05 düzeyinde belirgin bir farklılık bulunmuştur.
29
Tablo 1. İlaç gruplarına ve günlere göre sığırlar üzerinde tespit edilen canlı kene sayıları.
İlaç
Tedavi
Sığır öncesi
no
kene
sayıları
Tedavi sonrası kene sayıları
+1.gün +3.gün +7.gün +14.gün +18.gün +21.gün +28.gün +35.gün +42.gün
%1
Flumethrin
(dökme)
1
2
3
4
5
6
7
29
23
16
21
17
14
28
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
7
3
9
5
7
6
4
11
7
11
9
11
12
10
17
6
16
9
13
12
11
%7.5
Flumethrin
(banyo)
1
2
3
4
5
6
7
21
26
18
20
25
22
17
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
3
0
3
2
1
0
4
7
5
2
3
1
4
8
9
5
7
11
7
9
11
7
9
6
10
14
14
14
9
12
14
16
19
21
%1
Deltamethrin
(dökme)
1
2
3
4
5
6
7
28
21
14
25
24
16
14
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5
0
3
0
2
1
3
7
3
2
6
3
4
4
9
12
5
6
9
7
7
11
9
9
9
11
10
9
12
12
12
14
16
13
%5
Deltamethrin
(banyo)
1
2
3
4
5
6
7
17
11
26
24
23
19
22
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
1
2
0
2
4
2
2
3
2
3
4
6
1
3
6
5
2
7
10
4
5
8
7
5
9
12
7
5
7
11
5
14
11
17
9
9
14
7
18
16
14
1
2
3
%2.5
Cypermethrin 4
(dökme)
5
6
7
1
18
22
19
24
16
19
27
17
0
0
0
0
0
0
0
14
0
0
0
0
0
0
0
14
0
0
0
0
0
0
0
6
0
0
0
0
0
0
0
9
1
0
5
0
2
3
0
7
6
3
6
8
9
6
5
7
9
9
11
9
8
12
11
10
14
12
10
11
13
12
13
13
17
16
18
17
15
17
18
15
2
3
4
5
6
7
26
14
23
18
21
20
21
18
20
16
23
19
17
11
14
13
11
9
9
10
7
14
13
12
7
6
10
11
9
14
4
6
9
9
6
5
11
9
7
11
11
8
6
14
8
6
15
9
11
18
6
9
14
10
17
19
14
13
15
16
Kontrol
30
Grafik 1. Tedavide kullanılan ilaçların günlere göre etki yüzdeleri.
Çalışma boyunca tedaviden itibaren 42 gün boyunca tedavi gruplarından en fazla kene 326 adet ile
%2.5 cypermethrin dökme çözeltisi grubunda, en az
kene ise 196 adet ile %1 flumetrin dökme çözeltisi
grubunda gözlenmiş, kontrol grubundan ise toplam
725 kene toplanmıştır (Tablo 2).
Tablo 2. Çalışma boyunca tedavi ve kontrol gruplarındaki ortalama ve toplam kene sayıları.
İlaçlar
Ortalama kene
Ortalamanın standart sapması
Toplam kene
%1 flumethrin dökme
3,11
,61726
196
%7.5 flumethrin banyo
4,25
,70255
268
%1 deltamethrin dökme
3,88
,60257
245
%5 deltamethrin banyo
4,46
,62824
281
%2.5 cypermethrin dökme
5,17
,77912
326
Kontrol
11,50
,55236
725
Çalışma süresince ilaçtan kaynaklanan deri reaksiyonu veya başka bir yan etki gözlenmemiştir.
Çalışma sonunda kontrol grubundaki sığırlar %1’lik
flumethrin ile tedavi edilerek kenelerden arındırılmıştır.
Türkiye’de sığır kenelerine karşı yapılan çalışmalarda sadece flumethrin denenmiş, denemeler sonucunda yüksek oranlarda etkili oldukları ortaya
konmuştur. Özellikle %1’lik flumethrin’in 1 mg/
kg dozundaki dökme çözeltisinin kullanımıyla ilgili
çalışmalar yapılmıştır (3, 5, 11).
Dik ve Uslu (3), %1’lik flumethrini 1 mg/kg
dozda dökme tarzında kenelerle enfeste sığırlara
uygulamışlar, 24. saatte %94.6, 7. günde %97.7, 14.
günde %96.9, 21. günde %98.6 ve 42. günde %78.3
etki bulmuşlardır.
Dumanlı ve Yılmaz (5), %1 ve %0.5 flumethrini 1 mg/kg dozda dökme tarzında, %6 flumethrini
1 ml/2 lt su dozunda pulverize banyo yöntemiyle
uygulamışlar, dökme tarzında kullandıkları ilaçların
15 gün süreyle tam koruma, banyo tarzında kullandıkları ilaçların ise bir hafta tam koruma sağladığını
belirtmişlerdir.
Bu sonuçlara benzer nitelikte, bu araştırmada
da en yüksek etki ve en uzun süreli koruma %1’lik
flumethrin’in dökme çözeltisinden elde edilmiştir.
Tedavi grubundaki diğer ilaçlarda yeniden canlı
kene görülmesi 18-21. günlerde başlarken, %1 flumethrin dökme grubunda 28. günde başlamıştır.
Flumethrin’in tek ve çok konaklı kenelere olan
yüksek etkisinin, diğer pyrethroidlerle karşılaştırıldığında daha az ilaç kullanımı ile elde edildiği
bildirilmiştir (10). Ayrıca süt ve et sığırlarında flumethrin kullanımının güvenli olduğu, süte geçen
flumethrin miktarının, Avrupa Tıbbi İlaç Değerlendirme Kurumu’nun belirlediği 30 µg/kg miktarın
çok altında olduğu belirtilmiştir (6).
Sonuç olarak, sentetik pyrethroid grubunda
olup da çalışmada kullanılan ilaçların, ixodid kenelere karşı ortalama %90’ın üzerinde etkili olduğu, bu
etkinin en az üç hafta süreyle devam ettiği, özellikle
%1 flumethrin dökme çözeltisinin etkisinin 4 hafta
devam etmesi nedeniyle daha uzun sürdüğü, daha
sonraki haftalarda etkinin azaldığı görülmüştür. Bu
ilacın meraya çıkan sığırlara 3 hafta arayla uygulanmasının çok yüksek, 4 hafta arayla uygulanması ise
oldukça iyi bir kene kontrolü sağlayabilecektir.
İlaç uygulanan hayvanların derilerinde veya
herhangi bir vücut bölgesinde bir yan etki görülmemiş, hayvanların genel durumlarında da bir bozukluk tespit edilmemiştir. Özellikle flumethrin içeren
çözeltilerin sığırlarda kene mücadelesinde kullanılması; et-süt hayvanlarında güvenli kullanım, yüksek ve uzun süreli etki avantajları nedeniyle tercih
edilebilir.
31
Kaynaklar
1. Anadon A, Martinez-Larranaga MR, Martinez MA,
(2009). Use and abuse of pyrethrins and synthetic pyrethroids in veterinary medicine. Vet J. 182, 7-20.
2. Aydın L, (1994). Güney Marmara Bölgesi Ruminantlarında
Görülen Kene Türleri ve Yayılışları. Doktora Tezi, Uludağ
Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Bursa.
3. Dik B, Uslu U, (2008). Doğal enfeste sığırlardaki ixodid
kenelere karşı flumethrin (%1 dökme) uygulamasının tedavi edici ve kalıcı etkisi üzerine araştırmalar. Bornova Vet
Kont Araş Enst Derg. 30(44), 1-6.
4. Dorn H, Pulga M, (1985). Field trials with flumethrine
pour-on against Boophilus microplus in Brazil. Vet Med
Rev. 2, 146-151.
5. Dumanlı N, Yılmaz H, (1992). Sığırlarda kene enfestasyonuna karşı flumethrin’in etkisi üzerine araştırmalar. Hay
Araş Derg. 2(1), 21-22.
6. EMEA, (1998). Committee for Veterinary Medicinal Products Flumethrin, Summary Report (1). EMEA/MRL/469/98Final. Erişim adresi: http://www.ema.europa.eu/docs/
en_GB/document_library/Maximum_Residue_Limits_-_Report/2009/11/WC500014322.pdf, Erişim Tarihi:
13.06.2011.
7. Hamel HD, (1987). The use of flumethrin 1% pour-on for
the control of Amblyomma spp. in various southern African
countries. Onderstepoort J Vet Res. 54, 521-524.
8. Karaer Z, Yukarı BA, Aydın L, (1997). Türkiye keneleri
ve vektörlükleri. Özcel MA, Daldal N (Ed): Parazitoloji’de
Artropod Hastalıkları ve Vektörler. Türkiye Parazitol Dern
Yay No: 13, Ege Üniv Basımevi, İzmir, sf. 363-434.
9. Spss Statistics, (2008). Spss Statistics Release 17.0.0., Spss
Inc., Chicago, USA.
10. Stendel W, (1985). Experimental studies on the tickicidal
effect of Bayticol pour-on. Vet Med Report. 2, 98-111.
11. Tüzer E, Tınar R, (2008). Flumetrin %1 dökme çözeltisinin meradaki sığırlarda ixodid kenelere etkisi. Vet Hekim
Der Derg. 79(2), 31-34.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22,
32-38,
32
Kabaklı
Ö 2011
ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, Araştırma
İnaktif mavidil serotip 4 aşısı üretimi
Özden KABAKLI1, A.Burak GÜNGÖR1, Elvin ÇALIŞKAN1, Nedret ÇELİK2, İlkay DEMİRHAN3,
Halil EROL3, Hasan KESKİN4, Hasan YURDAKUL4
1
Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Viral Aşı Üretim Laboratuvarı, Ankara, Türkiye, 2Şap Enstitüsü,
Virüs Kültürü Laboratuarı, Ankara, Türkiye, 3Lalahan Merkez Hayvancılık Araştırma Enstitüsü, Sığır Yetiştirme
Şubesi, Ankara, Türkiye, 4Karacabey Tarım İşletmesi, Bursa, Türkiye
Özet: Bu çalışmada, mavidil attenüe serotip 4 aşı suşu ile inaktif aşı üretimi yapıldı. Virus Vero hücre hatlarında üretilip,
betapropiolactone ile inaktive edilerek, ISA 206 ( Seppic) adjuvant ile emülsifiye edildi. Aşılar daha sonra laboratuar
hayvanları ve hedef hayvanlarda sterilite, toksisite ve güvenlik testleri açısından test edildi. Aşının immunojenitesi
subkutan olarak 2 ml 10 koyuna, 10 keçiye ve 5 ml 3 sığıra verilerek test edildi. Rapel dozları koyunlarda 28 gün sonra
yapıldı ve aşılamalar sonrası hiçbir yan etki tespit edilmedi. Aşılanan keçi, sığırların hepsinde ve koyunların %67’sinde
virus spesifik antikorlar gelişti. Elde edilen bu sonuçları değerlendirmek ve minimal aşı dozunu belirlemek amacıyla
bütün hedef hayvan türlerini içeren daha büyük bir hayvan grubunda yeni bir çalışma planlandı.
Anahtar sözcükler: İnaktif aşı, mavidil, virus nötralizasyon.
Production of inactivated serotype 4 bluetongue vaccine
Summary: In this study production of inactivated bluetongue vaccine with attenuated bluetongue serotype-4 strain
was performed. The vaccine viruses were propagated in Vero cell cultures, and inactivated with Beta-propiolactone.
Subsequently by using adjuvant Montanide ISA 206 inactivation studies were carried out. Vaccines prepeared were then
tested against sterility, toxicity and safety. Immunogenity of the prepeared vaccine was tested by inoculating 10 sheep
and 10 goats, 3 cattle subcutonously. Booster doses were administered to sheep after 28 days. All of the vaccinated goats
and cattle and 67% of the sheep showed BTV-4 specifik antibodies. To test further these promising results and to evaluate the minimum protective vaccinal dose, a new trial with a larger number of animals, including all target species, has
been planned.
Key words: Bluetongue virus, inactivated vaccine, virus neutralisation.
Giriş
Mavidil virusu, Reoviridae familyasına ait Orbivirus genusunda yer alan çift iplikçikli RNA yapısında, 60-80 nm büyüklüğündedir. VP2 proteini
nötralizan antijene sahip olup değişken sekansları
nedeniyle virusun 24 serotipe ayrılmasına neden
olur. Nötralizan antikorlar oluşturma özelliğinden
dolayı hastalıktan korunmada da önemlidir (14, 22).
Mavidil virusu +4 ve -70°C de dayanıklı iken -20°C
de daha az dayanır. Ultraviyole ve gamma irradyasyon ışınlarına nispeten daha dayanıklıdır. Hastalık
etkeni Ceratopogonidae familyasından Culicoides
genusundaki sokucu sineklerle bulaşır. Hastalıkta
morbidite %80 ve mortalite %5-10 arasında değişiklik göstermektedir.
Hastalıktan korunmada vektör mücadelesinin
yanı sıra, en önemli mücadele yöntemi aşılama ile
bağışık sürülerin elde edilmesi olup, dünyada bugüne kadar mavidil salgınlarında monovalan veya
polivalan olarak attenüe mavidil aşısı kullanılmıştır
(10, 18, 27). Attenüe mavidil aşısının dışında inaktif ve rekombinant teknoloji ile geliştirilmiş aşılar
mevcuttur (8, 11, 14, 20, 23). Attenüe aşılar inaktif
aşılara göre daha ekonomiktir ve daha iyi immun
yanıt alınmaktadır. Fakat bunun yanı sıra uluslararası hayvan ve hayvansal ürünlere ilişkin kurallar
gereği ve gebelik dönemindeki koyunlara, koç katımı döneminde koçlara uygulanamaması ve değişik
araştırmacılar tarafından bildirildiği gibi, (15, 18)
aşı virusunun geri dönüşüm riski olabileceğinden
dolayı son zamanlarda inaktif mavidil aşı geliştirme
çalışmaları tüm Avrupa Ülkelerinde önem kazanmıştır (7, 11, 20, 21, 23, 24). Türkiye’de 1978 yılından itibaren BT-4 suşundan hazırlanan monovalan
attenüe mavidil aşısı üretilmekte ve kullanılmak-
Yazışma adresi / Correspondance: Ahmet Burak Güngör, Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, 06020, Etlik, Ankara,
Kabaklı Ö ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 32-38, 2011
tadır. 1999- 2001 yıllarında görülen mavidil vakalarında serotiplerin farklı olması ve serotipler arası
kross bağışıklık olmaması sebebiyle (22) bu serotipleri ve ileride ortaya çıkabilecek farklı serotipleri
içeren monovalan veya polivalan mavidil aşılarının
kullanılması gerektiği ortaya çıkmıştır.
İnaktif aşı üretimi amacıyla, virus inaktivasyonunda inaktivan madde olarak çeşitli kimyasallar
ve fiziksel yöntemler kullanılmaktadır. Bunların başında gamma irradiasyon, lazer, ısı, ultraviyole ve
ultraviyolenin kimyasallarla bir arada kullanılması
suretiyle geliştirilen fotokimyasal metotlar, ve en
yaygın kullanılan yöntemler olarak kimyasal maddelerin kullanımını sayabiliriz (4, 8, 9, 20, 21, 23,
25). En çok tercih edilen kimyasal inaktivanların
başında formaldehit, binary ethylenimin ve betapropiolactone gelmektedir (9, 11, 19, 20) .İnaktif
mavidil aşı üretimi için farklı inaktivantların denendiği aşı çalışmaları mevcut olup (6, 7, 11, 17, 20,
21, 23), Parker ve arkadaşları (19), Ramakrishnan
ve ark. (20), ile Savini ve ark. (23), tarafından beta
propiyolakton, Binary etylenimmine ve Campbel ve
ark. (8), gamma irradiasyon ile inaktivasyon yöntemlerinin daha etkili olduğu bildirilmiştir. Yapılan
çalışmalarla aşının immunojenik aktivitesinin antijen ve adjuvant miktarına göre arttığı görülmüştür
(12, 26). Birçok madde adjuvant olarak bilinmesine
karşın en çok kullanılanları alimünyum hidroksit
jeli, saponin ve yağ emülsüyonlu adjuvantlardır.
İlk yağ adjuvantlı mavidil aşısı Parker ve ark. (19),
tarafından gerçekleştirilen inaktif mavidil aşısı üretimi sırasında çift yağ emülsüyonlu adjuvant kullanılarak üretilmiştir. Son yıllarda alternatif olarak
kullanıma hazır yağ adjuvantları geliştirilmiştir.
Bu çalışmamızda mavidil serotip 4 virusuna
karşı inaktif aşı geliştirilmesi amaçlandı.
Materyal ve Metot
Virus suşu: Güney Afrika orijinli embriyolu tavuk
yumurtasında 72, kuzu böbrek hücre kültürlerinde
2, BHK hücrelerinde de 4 üncü pasajı yapılan attenüe S.A. BT./4 -BHK/4 PDAM suşudur.
Vasat: Glasgow MEM (Applichem A1321.9010),
Minimum essential medium- NaHCO3 lı Earl’s vasatı (Gibco 61100-087), Eagle’s minimum essential
medium (Sigma EMEM M 0268) %10 FCS’lu hücre ve virus üretme vasatı olarak kullanıldı.
33
BT antikor C- ELISA: VMRD firmasından ticari
olarak temin edilmiştir.
BT antijen ELISA: VMRD firmasından ticari olarak temin edildi.
FTIC (florasan izotiyosiyonat) ile conjuge edilmiş BTV VP7 mab: VMRD firmasından ticari olarak temin edildi.
Beta propiolakton: Across Organics %98 pure,
code: 269040250 ticari olarak temin edildi.
Montanide ISA 206 ( Seppic) adjuvant: Seppic
firmasından temin edildi.
Deneme hayvanları: Enstitünün deneme hayvanları bölümündeki fare, kobay,koyun, Lalahan Merkez
Hayvancılık Araştırma Enstitüsü Müdürlüğündeki
sığır ve keçiler ile TİGEM Karacabey Tarım işletmesindeki koyunlarda Etik Kurul kararına uygun
olarak çalışıldı.
Virus üretimi: Ana tohum virus suşundan çalışma
tohum virus suşu elde edilerek kalite kontrol testleri tamamlandı ve aşı üretiminde kullanılacak antijen için %80 -90 Monolayer olan vero hücrelerine
37ºC de inokule edildi. İnokulasyonu takip eden
4-5. günlerde %90-100 CPE gelişen kültürlerdeki
virus süspansiyonu aseptik şartlarda toplandı. Toplanan bulk ürünün kalite kontrol testleri; titre, sterilite, özdeşlik (identitiy) vs OIE Manual of standarts
of diagnostic tests and vaccines (18) ve European
pharmacopea‘ye göre (1, 2, 3) yapıldı.
Daha sonra santrifüj edilerek berraklaştırılan
virus süspansiyonu finalde %0.2 (v/v) olacak şekilde beta propiolactone ile Parker ve ark. (19), bildirdiği şekilde inaktive edildi. İnaktive virus süspansüyonundan alınan örnekler invivo ve invitro olarak
inaktivasyon kontrol testlerine tabi tutuldu.
İnaktivasyon kontrol testleri: İn vivo test: 20 ml
inaktive olan virus süspansiyonundan 4 adet mavidil
seronegatif koyuna subkutan olarak inokule edildi.
İki adet aşılanmamış koyun negatif kontrol olarak
bırakıldı. 21 gün boyunca beden ısıları kontrol edildi ve klinik olarak anormal bir belirti olup olmadığı
yönünden gözlendi. İki günde bir 21 gün boyunca
EDTA ‘ lı tüplere kan alınarak mavidil virus varlığı
yönünden BTV antijen ELISA ve embriyolu tavuk
yumurtasına inokulasyon yolu (13) ile test edildi. İn
vitro test: Üç adet 175 cm2 monolayer VERO hücrelerine 10 ml inaktive olan virus süspansiyonundan inokulasyon yapıldı. Üç pasaj sonra olası CPE
varlığı yönünden gözlemlendi. CPE gözlenmemesi
34
halinde, kültür sıvılarındaki BTV antijenlerinin varlığı, ELISA ve immunofloresan teknikleri ile araştırıldı.
Adjuvant ve koruyucu ilave edilmesi: İnaktivasyon gerçekleştikten ve test edildikten sonra eşit
ağırlıktaki Montanide ISA 206 adjuvanla 50:50
(v/v) oranında karıştırılarak emülsifiye edildi. Oluşturulan emülsüyonun sterilite testi yapılarak, konsantrasyon 1: 10 000 olacak şekilde koruyucu olarak
%5 solusyondan thiomersol katıldı. Oluşan antijen,
adjuvant emülsüyonunun stabilite testleri yapıldı;
Santrifüj metodu: Bu amaçla 15 ml emülsüyon
santrüifüj tüpüne konarak 3000 rpm de 20 dakika
santrifüj edildi.
Bekletme metodu: Emülsüyon +4 ◦C de 4 ay
süresince bekletildi. Her iki metotta ayrışma olup
olmadığı takip edildi.
Son ürünün kontrol testleri: Sterilite, zararsızlık,
güvenlik ve etkinlik vs OIE Manual of standarts
of diagnostic tests and vaccines (18) ve European
pharmacopea’ye göre (1, 2, 3) yapıldı.
Güvenlik ve zararsızlık testi: Deney hayvanlarında; 350gr ağırlıktaki 4 adet kobaya 2 ml ve altı 12
adet 18 gr ağırlıktaki fareye 0.5 ml subkutan olarak
enjekte edildi. Hayvanlar 14 gün boyunca enjeksiyon bölgesinde lokal reaksiyon ve klinik bulgular
yönünden gözlendi.
Hedef hayvanlarda: Bu amaçla Enstitü deneme
hayvan ünitesinde bulunan ve bulunan ve mavidil
virus antikoru içermeyen iki adet koyuna son ürün
3 ml subkutan olarak inokule edildi. İki adet aşılanmamış koyun negatif kontrol olarak bırakıldı. 21
gün boyunca beden ısıları kontrol edildi ve klinik
olarak anormal bir belirti olup olmadığı yönünden
gözlendi. İki günde bir, 21 gün boyunca EDTA‘lı
tüplere kan alınarak mavidil virus varlığı yönünden
BTV antijen ELISA ve embriyolu tavuk yumurtasına inokulasyon yolu ile test edildi. Aynı zamanda bu
hayvanlardan 14.gün, 21.gün ve 28. günlerde kan
serum örnekleri alındı. 28 gün sonra 3 ml olarak
aşı tekrarı (rapel) yapıldı. Aşı tekrarı sonrası 1 aylık periyotlarda 6 ay boyunca kan serum örnekleri
alınarak mavidil antikor varlığı yönünden ELISA ve
SNT ile test edildi.
Etkinlik ve potens testi: Etkinlik testi için kontrol
testleri tamamlanmış olan monovalan inaktif mavidil serotip 4 aşısı, Hayvancılık Merkez Araştırma
Enstitüsündeki 3 adet sığıra (5 ml) ve 10 adet keçiye
(2 ml) tek saha dozu aşı uygulaması yapılırken, TİGEM işletmelerinde daha önce mavidil antikorları
yönünden test edilerek negatif bulunan 10 adet koyuna (2 ml) aşı uygulaması ve 28 gün sonra aşı tekrarı yapıldı. Aşılama sonrası 14., 21. ve 28. günlerde
kan serum örnekleri alındı . Koyunlarda 28. günden
sonra 126. günde ve 173. günde serum örnekleri
alındı. Alınan kan serum örnekleri BT nötralizan
antikorlar yönünden ELISA ve VN ile test edildi.
Güvenlik ve zarasızlık testi için 3 ml subkutan aşı
uygulaması yapılan koyunlar da etkinlik testinde
değerlendirilerek 6. aya kadar kan serum örnekleri
alındı.
Bulgular
Aşı Üretimi ve Kontrolu: Ana tohum virusu, çalışma tohum virusu ve aşı üretiminde kullanılan virus
süspansiyonlarının kalite kontrol testleri OIE Manual of standarts of diagnostic tests and vaccines (18)
ve European pharmacopea ye göre (1, 2, 3) uygun
bulundu. Virus üretimine ait kalite kontrol testleri
Tablo 1’de özetlenmiştir.
Tablo 1. İnaktif mavidil tip 4 aşısı - virus üretim ve kontrol testleri.
Antijenik titresi (log 10* DKID50/ml)
8,3
Sterilite ( virus, mantar, bakteri ve mikoplazma) uygun
Özdeşlik (identity) ( VNT, PCR)
+
İnaktivasyon ( in vivo/ invitro)
inaktif
Virus inaktivasyonu: Gerek invivo, gerekse invitro virus inaktivasyon testlerinin her ikisi de olumlu
sonuçlandı.
İn vivo test: İki koyuna yapılan inokulasyonu takip
eden 21 gün boyunca bu hayvanların beden ısılarında yükselme olmadı ve klinik olarak mavidil hastalığını düşündürecek bir belirti gözlenmedi. Yirmibir
gün boyunca iki günde bir, EDTA’lı tüplere alınan
kan örnekleri mavidil virus varlığı yönünden BTV
antijen ELISA tekniği ve embriyolu tavuk yumurtasına inokulasyon ile test edildi. Her iki yöntem ile
kan örneklerinde mavidil virusu tespit edilmedi.
İn vitro test: Vero hücre hattında yapılan üç pasaj sonunda CPE varlığı gözlenmedi, BTV antijen
ELISA ve BTV immunofloresan yönünden negatif
bulundu. BTV immunofloresan yönünden yapılan
boyama sonuçları Şekil 1. de gösterildi.
35
hedef hayvanlarda elde edilen güvenlik ve zararsızlık test sonuçları Tablo 2’de özetlenmiştir.
Tablo 2. İnaktif mavidil aşısı deneme üretim güvenlik ve
zararsızlık test sonuçları.
Şekil 1. A. BTV immunofloresan yönünden yapılan invitro test sonucu negatif görüntü ve B. pozitif kontrol
örnekte yapılan immunofloresan görüntü.
Final ürün kontrol testleri: Adjuvantla emülsüyon
oluşturulan aşıların, gerek santrifüj gerekse +4 ◦C de
4 ay süresince bekletme şeklinde yapılan stabilite
testlerinde ayrışma olmadığı gözlendi. Final ürünün
OIE Manual of standarts of diagnostic tests and vaccines (18) ve European pharmacopea’ye göre (1, 2,
3) yapılan sterilite testi sonucu bakteri, mantar ve
mikoplazma yönünden steril bulundu.
Güvenlik ve zararsızlık testi: Deney hayvanlarında; Enjeksiyon yapılan fare ve kobaylarda 14 gün
boyunca herhangi bir klinik bulgu ve enjeksiyon
bölgesinde herhangi bir lokal reaksiyon görülmedi.
Hedef hayvanlarda: İnokulasyon yapılan ve kontrol
olarak bırakılan koyunlarda, 21 gün boyunca beden
ısılarında herhangi bir yükselme ve klinik olarak
anormal bir belirti gözlenmedi. Enjeksiyon bölgesinde herhangi bir lokal reaksiyon görülmedi. İki
günde bir 21 gün boyunca EDTA‘lı tüplere kan alınarak mavidil virus varlığı yönünden BTV antijen
ELISA ve embriyolu tavuk yumurtasına inokulasyon yolu ile yapılan test sonucu virus tespit edilmedi. Sığırlarda ve keçilerdede herhangi bir lokal ve
klinik reaksiyon gözlenmedi. Deney hayvanları ve
Aşılama sonrası
reaksiyon
Hayvan/ sayısı Doz/miktar
Lokal
Genel
Kobay/4
2 ml / kas içi
Y
Y
Kobay/2
Aşısız kontrol
Y
Y
Fare/12
0.5 ml/ kas içi
Y
Y
Fare/4
Aşısız kontrol
Y
Y
Koyun/2
3 ml / kas içi
Y
Y
Koyun/2
Aşısız kontrol
Y
Y
Y: Yok
Etkinlik ve potens testi: Enstitü deneme hayvan
ünitesinde 3 ml subkutan monovalan BT-4 aşı uygulaması yapılan koyunlarda imunizasyonu takiben
hepsinde 14. günden itibaren nötralizan ve ELISA
ile antikorlarının geliştiği ve 6. aya kadar bu antikorların varlığını sürdürdüğü tespit edilmiştir. Deri altı
yolla ve 2 ml hacimde aşılanan 10 adet koyundan
6 adedinde 28. günde koruyucu düzeyde nötralizan
antikolar tespit edildi. Keçilerde yapılan 2 ml aşı
inokulasyonu sonucu 10 keçinin hepsinde 28.günde
koruyucu düzeyde antikor varlığı tespit edildi. Aşı
inokule edilen 3 sığırda 28. günde serum örnekleri
alındı ve hepsinde koruyucu düzeyde antikor tespit
edildi. Elde edilen sonuçlar inokule edilen aşıların
immunojen olduklarını göstermektedir. Sonuçlar
Tablo 3, Grafik 1 ve 2 de özetlenmiştir.
Tablo 3. İnaktif mavidil aşısı deneme üretim etkinlik ve potens test sonuçları.
Sayı / Hayvan
Aşı serileri
Doz/miktar
ml/deri altı
Aşılama öncesi
BT antikor
SN50 (N=<1/4 )
lokal
genel
Aşılama sonrası
28.gün BT antikor
SN50 (P=≥1/4)
Aşılama sonrası reaksiyon
10 Koyun
Monovalan BT4
2 ml
10
Y
Y
6
2 koyun
Monovalan BT4
3 ml
2
Y
Y
2
10 keçi
Monovalan BT4
2 ml
10
Y
Y
10
3 sığır
Monovalan BT4
5 ml
3
Y
Y
3
1sığır,7 koyun,5 keçi
Aşısız kontrol
-
13
Y
Y
-
Y:Yok
36
Grafik 1. İnaktif mavidil aşısı deneme üretimindeki serotip 4, ile aşılama sonrası TİGEM koyunlardaki nötralizan
antikor titreleri
Grafik 2. İnaktif mavidil aşısı deneme üretimindeki serotip 4 ile aşılama sonrası Enstitü koyunlarındaki nötralizan
antikor titreleri
Tartışma
Bu çalışma sonucunda deneysel olarak üretilen adjuvantlı inaktif BTV-4 aşısı güvenli, etkili ve OIE
Manual of standarts of diagnostic tests and vaccines
(18) ve European pharmacopea (1, 2, 3) gereksinimlerini karşılamaktadır. Aşılama sonrası hayvanlarda
beden ısısı yükselmesi dahil herhangi bir klinik
bulgu ve inokulasyon bölgelerinde lokal reaksiyon
gözlenmemiştir. Aşının final konsantrasyonda %0.2
olacak şekilde beta propiolactone (v/v) ile inaktive
edilmesinin güvenli ve yeterli olduğu bu çalışma ile
teyit edilmiş oldu. Capodici ve ark. (6) HIV aşısı
üretiminde inaktivan olarak beta propiolactone kullanmışlardır. Sofer ve ark. (25), ile diğer araştırıcıların (9) yaptıkları çalışmalarla beta propiolactone’un
proteinler üzerine olan kimyasal etkisi çok iyi belirlenmiş ve viral inaktivan olarak etkisi kanıtlanmıştır. Beta propiolactonun aşıda kalıntı inaktivan
maddelerin güvenli seviyede olmaları açısından da
yapılan çalışmalarda (9, 25) inaktivasyon sırasında
karışımın uzun süre +37°C’de PH 7.00 ± 0.05 de
tutulması ile hidrolizasyon gerçekleştiği ve bir isomer olan lactate ile beta-propionic asit derivatlarına
ayrıldığı ve dolayısı ile beta propiolactonun kalıntı
olarak güvenli olduğunu göstermişlerdir. Bu çalışmada da final konsantrasyonda %0.2 beta propiolactone kullanıldığında virusun tam inaktivasyonu
gerçekleştirilmiştir. İnaktivasyonun başarılı olduğu
invivo ve invitro kontrol testleri ile doğrulanmıştır.
İnaktivasyon yönteminin virusun antijenik karakterine, özellikle kapsitte bulunan VP2 proteini nötralizan antijen üzerinde (6) herhangi bir olumsuz etki
yapmadığı sığır, koyun ve keçilerde gelişen nötralizan antikorların varlığı ile ortaya konulmuştur.
Enstitümüz deneme koyunlarına 3 ml aşı inokule
edilmesi sonucu hepsinde yüksek titrede nötralizan
antikor tespit edilmiş ve bu antikorlar çalışmamızın devam ettiği 6 ay boyunca koruyucu düzeyde
devam etmiştir. Lalahan Merkez Hayvancılık Araştırma Enstitüsündeki sığırlara 5 ml ve keçilere 2 ml
aşı inokule edilmiş 28. günde hepsinde koruyucu
düzeyde nötralizan antikorlar tespit edilmiştir. Benzer şekilde Karacabey Tarım İşletmesinde bulunan
koyunlara 2 ml inokulasyon yapılmış, aşı yapılan
hayvanların %67’sinde koruyucu düzeyde nötralizan antikorlar gelişmiştir. Aşılanan hayvanların
%33’ünde yeterli bağışıklığın gelişmemesini, antijen konsantrasyonunun yapılmamış olmasına ve
dozun 2 ml’ye düşürülmesinden kaynaklandığını
düşünmekteyiz. Yapılan çalışmalarla aşının immunojenik aktivitesinin antijen ve adjuvant miktarına
göre arttığı bildirilmiştir (12, 26). Yeterli bir immun
yanıt alınabilmesi için inaktive edilmiş antijenler
mutlaka adjuvantlarla karıştırılmalıdır. Adjuvantlar,
aşının etkinliğinin arttırılması ve uzun süre bağışıklık sağlaması amacıyla kullanılan immunostimulan özellikteki ajanlardır. Çalışmamızda Parker ve
ark. (19), bildirdiği gibi yağlı adjuvant kullanımı
tercih edilmiş olup, Barnett ve ark. (5), Di Emidio
ve ark. (11), ile Savini ve ark. (23), kullandığı gibi
yağ emülsüyonlu adjuvant olan Montanide ISA 206
kullanıldı. Hazır adjuvant özelliğinde olan Montanide ISA 206 W/O/W ( waterin oil in water) tipi
emülsüyondur. Bu tip emülsüyonlarda antijen yağ
damlacığının dış kısmında ve içinde yer almaktadır.
Bu antijenlerin hemen faaliyet göstermesini sağlayan devamlı su fazının varlığı hızlı bir immun yanıt
oluşturmayı; yağ damlacığının içindeki sulu fazda
tutunan antijenlerde depo etkisi özelliği ile immun
37
yanıtın uzun süre devamını sağlamaktadır. Dış fazın
sulu olması enjeksiyonu kolaylaştırmaktadır. Aynı
zamanda farklı hayvan türlerinde kullanılabiliyor
olması bu tip adjuvantların tercih edilmesine neden
olmaktadır (5). Bu çalışmada da Montanide ISA 206
adjuvantı ile hazırlanan aşı kombinasyonları farklı türler olan sığır, koyun ve keçilerde etkili olmuş
kısa sürede immun yanıt alınmış ve çalışmanın devam ettiği 6 ay boyuncada koruyucu düzeyde antikorlar varlığını sürdürmüşlerdir. Uygulama yapılan
hayvanlarda lokal ve genel reaksiyon görülmemesi
adjuvantın kolay enjekte edilebilir özellikte ve güvenli olduğunu göstermiştir. Test edilen tüm türlerde (sığır, koyun ve keçi) ilk aşılamadan sonra seropozitiflik bulunması, Murray ve ark. (16), Parker ve
ark. (19), Di Emidio ve ark. (11), ile Savini ve ark.
(23, 24) bulgularını teyit etmektedir. Keçilerde daha
yüksek titrede immun yanıt alınması Di Emidio ve
ark. (11), bulguları ile paralellik göstermektedir.
Bu çalışmada tercih edilen inaktivasyon metodu ve adjuvant ile deneysel üretilen inaktif mavidil
aşısının güvenli ve elde edilen immun yanıtın yeterli olduğu görülmüştür. Bundan sonraki aşamada
daha büyük hayvan grubunda çalışmalar planlanıp,
minimal aşı dozun belirlenmesi ve farklı adjuvantlarla çalışmalar yapılması hedeflenmektedir.
Kaynaklar
1. Anonim, (1991). European CommissionCommission Directive 91/412/EEC of 23 July 1991 laying down the principles
and guidelines of good manufacturing practice for veterinary medicinal products. Off J. L228, p. 70-73.
2. Anonim, (1981). European Council. Council Directive
81/852/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to analytical, pharmacotoxicological
and clinical standarts and protocols in respect of the testing
of veterinary medicinal products. Off J. L 317, p. 53-98.
3. Anonim, (2001). European Pharmacopoeia. Addendum No.
0016. Council of Europe, Strasbourg, p. 1657-1661.
4. Bachmann MF, Bast C, Hengartner H, Zinkernagel RM,
(1994). Immunogenecitiy of a viral model vaccine after different inactivation procedures. Med Microbiol Immunol.
183(2), 95-104.
5. Barnett PV, Pullen L, Willams L, Doel TR, (1996). International Bank for Foot and Mouth Disease Vaccine: Assesment of Mantonide ISA 25 and ISA 206 two commertialy
avaible oil adjuvant. Vaccine. 14 ,1187-1198.
6. Berry LJ, Osburn BI, Scott JL, Farver T, Heron B, Patton
W, (1981). Inactivated Bluetongue Virus Vaccine in Lambs:
Differential Serological Responses Related to Breed. Vet
Res Comm. 5(3), 289-293.
38
7. Bréarda E, Belbisb G, Hamersc C, Moulind V, Lilin T,
Moreaue F, Millemann Y, Montangec C, Sailleau AC,
Durand B, Viarougea C, Hoffmanng B, Desmitd H,
Goutebrozec S, Hudeletc P, Zientaraa S, (2011). Evaluation of humoral response and protective efficacy of two
inactivated vaccines against bluetongue virus after vaccination of goats. Vaccine. (In pres).
8. Campbell CH, Barber TL, Knudsen RC, Swaney LM,
(1985). Immune response of mice and sheep to bluetongue
virus inactivated by gamma irradiation. Prog Clin Biol
Res. 178, 639-647.
9. Capodici J, Maigetter R, (2006). Large- scale beta propiolactone inactivation of HIV for vaccines. Bioprocess International. Febr. p. 36-41.
10. Caporale V, Giovannini A, (2010). Bluetounge control
strategy, including recourse to vaccine: a critical review.
Rev Sci Tech Off Int Epiz. 29(3), 573-591.
11. Di Emidio B, Nicolussi P, Patta C, Ronchi GF, Monaco
F, Savini G, Ciarelli A, Caporale V, (2004). Efficacy and
safety studies on an inactivated vaccine against bluetongue
virus serotype 2. Vet Ital. 40 (4), 640-644.
12. Francis MJ, (1990). Pepdide vaccines for viral disease. Sci
Progress Oxford. 74, 115-130.
13. Goldsmit L, Barzilai E, Tadmor A, (1975). The comparative sensitivity of sheep and chicken embryos to bluetongue
virus and observations on viraemia in experimentally infected sheep. Aust Vet J. 51 (4), 190-196.
14. Lobato ZIP, Coupar BEH, Gray CP, Lunt R, Andrew
ME, (1997). Antibody Responses and Protective Immunity
to Recombinant Vaccinia Virus-expressed Bluetounge Virus
Antigens. Vet Immunol Immunopathol. 59, 293-309.
15. Monaco F, Camma C, Serini S, Savini G, (2006). Differentiation between field and vaccine strain of Bluetounge
virus serotype 16. Vet Microbiol. 116, 45-52.
16. Murray PK, Eaton BT, (1996). Vaccines for Bluetongue.
Aust Vet J. 73, 207-210.
17. Odeon AC, Gerswin LJ, Osburn BI, (1999). IgE responses to bluetounge viruse (BTV) serotype 11 after immunization with inactivated BTV and challenge infection. Comp
Immun Microb Infec Disease. 22, 145-162.
18. OIE, (2000). Office International des Epizooties Bluetongue, Chapter 2.1.9. Manual of standarts of diagnostic
tests and vaccines, Paris, p. 153-167.
19. Parker J, Hernimann KAJ, (1975). An experimental inactivated vaccine against bluetongue. Vet Rec. 96, 284-287.
20. Ramakrishnan MA, Pandey AB, Singh KP, Sıngh R,
Mehrotra ML, (2005). Immune response and protective efficacy of binary ethylenimine (BEI) inactivated bluetounge
virus vaccines in sheep. Vet Res Comm. 29
21. Ramakrishnan MA, Pandey AB, Singh KP, Sıngh R,
Mehrotra ML, (2005). Immune response and protuctive
efficacy in sheep immunised with hydroxylamine-inactivated bluetongue virus vaccine. Vet Ital. 41(3), 149-155.
22. Roy P, (1992). Bluetounge virus proteins. J Gen Virol. 73,
3051-3064.
23. Savini G, Ronchi GF, Leone A, Ciarelli A, Migliaccio P,
Franchi P, Mercante MT, Pini A, (2007). An inactivated
vaccine for the control of bluetounge virus serotype 16 infection in sheep in Italy. Vet Micrbiol. 124, 140-146.
24. Savini G, Hamers C, Conte A, Migliaccio P, Bonfini
B, Teodori L, Ventura MD, Hudelet P, Schumacher C,
Caporale V, (2009). Assessment of efficacy of a bivalent
BTV-2 and BTV-4 inactivated vaccine by vaccination and
challenge in cattle. Vet Microbiol. 133, 1-8.
25. Sofer G, Lister CD, Boose JA, (2003). Inactivation Methods Grouped by virus. BioPharm International’s April. p.
37-42.
26. Stott JL, Barber TL, Osburn BI, (1985). Immunologic
response of sheep to inactivated and virulent bluetounge
virus. Am J Vet Res. 6(5), 1043-1049.
27. Zientara S, Maclachlan NG, Calistri P, Vizcaino JMS,
Savini G, (2010). Bluetongue vaccination in Europe. Expert Revi Vaccines. 9(9), 989-991.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, Babacan
39-43, 2011
O. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 39-43, 2011
Derleme / Review
39
Tavuk dışkılarından Salmonella etkenlerinin konvansiyonel ve moleküler
yöntemlerle teşhisi
Orkun BABACAN
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara
Özet: Salmonella infeksiyonları kanatlı hayvan yetiştiriciliğinde verim düşüklüğü ve ölümler sonucu ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Salmonellozis (paratifo) kanatlı hayvanlar ve kanatlı hayvan ürünleri ile bulaşan zoonoz bir
infeksiyon olması nedeni ile insan sağlığı açısından da önem taşımaktadır. Bu derlemede tavuk dışkılarından Salmonella
etkenlerinin teşhisinde kullanılan konvansiyonel ve moleküler yöntemler değerlendirilmiştir.
Anahtar sözcükler: Dışkı, Salmonella, tavuk, teşhis.
Detection of Salmonella from chicken faeces by conventional and molecular methods
Summary: In poultry breeding, Salmonella infections cause productivity losses and deaths. Salmonellosis (paratyphi) is
very important disase for human health and zoonoses in humans consumption from poultry and poultry products. In this
review detection of Salmonellae from chicken faeces by conventional and molecular methods were evaluated.
Key words: Chicken, diagnosis, faeces, Salmonella.
Giriş
Salmonella etkenleri Enterobacteriaceae familyasında yer alan Salmonella genusuna ait türlerin içerdiği
serotiplerdir. Bu cins içinde iki tür bulunmaktadır ve
bunlar Salmonella enterica ve Salmonella bongori
olarak tanımlanmıştır. S.enterica içinde 7 alt grup
bulunmaktadır. Bu gruplar S.enterica subsp. enterica (I), S.enterica subsp. salamae (II), S.enterica
subsp. arizonae (IIIa), S.enterica subsp. diarizonae
(IIIb), S.enterica subsp. houtenae (IV), S.enterica
subsp. bongori (V), S.enterica subsp. indica (VI)’dır
Kanatlı hayvanlarla ilişkili tüm Salmonella etkenleri S.enterica türü içinde yer almaktadır (15, 19).
Tavuklarda Salmonella infeksiyonları temel
olarak iki bölümde incelenmektedir (12). Bunlar, tavuklar için spesifik olan Salmonella enterica subspecies enterica serovar Pullorum’un neden olduğu
Pullorum Hastalığı, Salmonella enterica subspecies
enterica serovar Gallinarum’un neden olduğu Tavuk Tifosu ile insanlarda gıda kaynaklı hastalıklarla
ilişkili olan farklı grupların serovarları tarafından
oluşturulan paratifo infeksiyonlarıdır (20, 22).
Salmonella infeksiyonları kanatlı hayvan yetiştiriciliğinde verim düşüklüğü ve ölümler sonucu
ekonomik kayıplara neden olmaktadır. S.Pullorum
ve S.Gallinarum ile infekte damızlıklardan elde edilen civcivlerde, vertikal bulaşma nedeniyle erken
dönem infeksiyonları şekillenmekte ve ciddi kayıplar oluşmaktadır (18, 28). S.Gallinarum ile infekte
kanatlıların, etkeni en az bir ay süre ile dışkılarıyla
çevreye saçtıkları bildirilmiştir (18).
Salmonellozis (paratifo) kanatlı hayvanlar ve
kanatlı hayvan ürünleri ile bulaşan zoonoz bir infeksiyon olması nedeni ile insan sağlığı açısından
da önem taşımaktadır (11, 33, 34). Tavuk ürünlerinden insanlara bulaşan ve gıda kaynaklı zehirlenme
vakalarından en çok izole edilen serovarlar Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium ve Salmonella enterica subspecies enterica
serovar Enteritidis’tir (20). İnsan, çiftlik hayvanları,
tavuklar, rodentler ve kuşları içeren geniş bir konakçı spekturumuna sahip olan S.Typhimurium, bu konaklarda hastalık oluşturabilmektedir (29). Avrupa
Birliği’nde özellikle yumurtalarda Salmonella kontrolü ve prevalansının azaltılması amacıyla 2003 yılında 2003/99/EEC adlı direktifi yayınlamıştır (1).
Kanatlı hayvanlar, insanlarda görülen Salmonella infeksiyonlarının en önemli bulaşma kaynağını
oluşturmaktadırlar. Buna bağlı olarak infeksiyonun
gıda ile insanlara geçişi ve halk sağlığının önemi gi-
Yazışma adresi / Correspondance: Orkun Babacan, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 06110
Dışkapı, Ankara, Türkiye. E-posta:[email protected]
40
Babacan O. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 22, 39-43, 2011
derek artarken, bu infeksiyonların özellikle kanatlı
üretimde önlenmesi için çalışmalar başlatılmıştır
(20, 28). Özellikle sadece kanatlı hayvanlarda hastalığa neden olan ve vertikal bulaşan S.Pullorum ve
S.Gallinarum infeksiyonunda, damızlık üretiminden başlayan kontrol önem taşırken; paratifo infeksiyonlarında kontrol programları tüm yetiştiricilik
aşamalarında bulaşma kaynaklarına bağlı olarak
uygulanmaktadır (16, 20, 23, 35, 36).
Kanatlı hayvanlarda Salmonella infeksiyonlarının kontrolü, hastalık nedenli kayıpların önlenmesi ve etkili bir kontrol programları gerektirmektedir.
(20). Türkiye’de kanatlı hayvanlar ve kanatlı ürünleri ile ilgili olarak Salmonella infeksiyonları için
yasal düzenlemeler bulunmaktadır. İhbarı Mecburi
Hayvan Hastalıklar Hakkında Tebliğe göre, kanatlı
tifosu ve pullorum hastalığı ihbarı mecburi hastalıklardır (4, 5). Kuluçkahane ve Damızlık Kanatlı
İşletmeleri Yönetmeliği Uygulama Talimatına göre,
S.Gallinarum ve S.Pullorum hastalığının tespiti halinde o kümeste bulunan hayvanlar bedelsiz olarak
itlaf edilmekte ve kuluçkahane ve günlük civcivlerde
rastlanması durumunda civciv ve yumurtalar imha
edilmektedir. S.Enteritidis ve S.Typhimurium’un
yumurtada ve damızlık işletmesinde tespiti halinde
bu Talimatın ilgili maddeleri gereğince işlem yapılır
(6).
Broiler (Ticari Etlik) ve Ticari Yumurtacı Kümeslerinde Salmonella Kontrol Programı Uygulama Talimatlarında, zoonoz karakterdeki Salmonella
etkenlerinin prevalansının tespit edilmesi ve prevalansın Avrupa Birliği seviyesine düşürmek amaçlanmaktadır (2, 8). Ayrıca Türk Gıda Kodeksi’nde
yumurta ve yumurta ürünlerinde ve çiğ kanatlı eti
ve hazırlanmış kanatlı eti karışımlarında salmonella etkenlerinin bulunmaması ile ilgili hükümler yer
almaktadır (9, 10).
İnfekte kanatlıların dışkılarının bulaşma kaynağı olması, dışkıyla kontamine olan yem su, altlık,
çalışanlar ve bunlara ait ekipmanlar etkenlerin kanatlılara bulaşmasını kolaylaştırmakta ve önemli bir
infeksiyon kaynağı olmaktadır (19, 20). Kesim aşamasında dışkı, karkas kontaminasyonuna da neden
olmakta ve etken karkasta bir aydan fazla süre canlı
kalabilmektedir (18, 35).
Bu derlemede tavuk dışkılarından Salmonella
etkenlerinin teşhisinde kullanılan konvansiyonel ve
moleküler yöntemler değerlendirilmiştir.
Salmonella İnfeksiyonlarının Teşhisi
Salmonella etkenlerinin kontamine materyallerden
kültür yöntemi ile izolasyon ve identifikasyonu
yaklaşık olarak yedi gün sürmektedir (24). Bu süre
özellikle gıda maddelerinde Salmonella kontaminasyonlarının belirlenmesinde bir problem oluşturmaktadır. Bu durumun aşılmasında, daha hızlı
sonuç veren moleküler tekniklerin kullanımı yarar
sağlamaktadır. Moleküler teknikler arasında Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR), etkenin saptanmasında hızlı, spesifite ve sensitivitenin yüksek olması
ile büyük avantaj sağlamaktadır. Bu yöntemin dışkı
gibi klinik örneklerden ve gıdalardan Salmonella etkenlerinin saptanmasında kullanımı sürekli artmaktadır. PZR’nin bir diğer avantajı ise biyokimyasal
ve fenotipik varyasyonlara rağmen mikroorganizmaların doğru teşhis edilebilmesidir (24, 25).
I- Konvansiyonel yöntemler
Salmonella etkenlerinin konvansiyonel yöntemlerle
teşhisinde, ön zenginleştirme, selektif zenginleştirme, ayırıcı besi yerlerine ekim, biyokimyasal testler
ve serolojik doğrulama aşamaları bulunmaktadır (4,
7, 20). Konvansiyonel yöntemde, uluslararası düzeyde kabul gören ISO 6579:2002 standardı bulunmaktadır.
a) Ön zenginleştirme: Konvansiyonel yöntemin ilk
aşaması ön zenginleştirme aşamasıdır. Ön zenginleştirmenin amacı, Salmonella etkenlerinin zengin
besin maddeleri bulunan besi yerlerinde sayılarının
arttırılmasıdır (7). Ön zenginleştirme aşamasında
25 g dışkının 225 ml ön zenginleştirme besi yerine
ilavesi önerilmektedir (3). Yapılan çalışmalarda 25
g dışkı numunesinin Salmonella etkenlerini saptayabilecek düzeyde olduğu belirtilmiştir (7).
Ön zenginleştirme aşamasında farklı besi yerleri kullanılabilmektedir. Bu besi yerleri arasında
Laktoz Broth, Yağsız Süt Tozu Besi yeri, Nutrient
Broth, Tripticase Soy Broth ve Tamponlanmış Peptonlu Su (TPS)’dur. ISO 6579:2002 standardında
önerilen önzenginleştirme besi yeri TPS’dir ve bu
besi yerinde 37°C’de 16-20 saatlik bir inkübasyon
önerilmektedir (3). TPS, içerdiği fosfat tampon nedeniyle örnek ilavesi sonrası inkübasyon aşamasında pH değerini 6.0 seviyelerinde kontrol etmekte ve
bu pH değerlerinde Salmonella etkenlerinin üremeleri olumsuz etkilenmemektedir (7).
b) Selektif zenginleştirme: Konvansiyonel yöntemin ikinci aşaması selektif zenginleştirmedir.
Amacı, flora ve diğer bakterilerin inhibe edilmesini/sınırlamasını sağlayarak Salmonella etkenlerinin
üremesini arttırmaktır (7, 20). Bu amaçla Rapaport
Vassiliadis Soy Peptone Broth (RVS), Selenit Sistin
Broth ve Tetratiyonat Broth kullanılmaktadır (7).
Selektif zenginleştirme olarak ISO 6579 metodu Rapaport Vassiliadis Soy Peptone Broth’ta
42°C de 18–24 saat inkübasyonunu önermektedir.
TSE ise Tetratiyonat Broth’ta 43°C’de 24 saat inkübasyon önermektedir (3). Genel olarak, yüksek
sıcaklıklardaki inkübasyonların daha etkili olduğu
belirtilmektedir (7).
Tetratiyonat Broth içerdiği pepton ve safra gibi
maddelerle salmonella etkenlerinin üremesini desteklerken; yine içerdiği kalsiyum bileşikleri ve iyot
sayesinde E.coli üremesini inhibe etmektedir (20).
RVS’nin içerdiği soya pepton Salmonella etkenlerinin çoğalmasını artırmaktadır (7). ISO 6579:2002
standardına göre önzenginleştirme kültüründen 0.1
ml, 10’ar ml’lik Rapaport Vassiliadis Soy Peptone
Broth ve Tetratiyonat Broth’a ekimler yapıldıktan
sonra belirtilen sıcaklık ve sürede inkübasyona bırakılır (3).
c) Ayırıcı besi yerlerine ekim: Selektif zenginleştirme aşamasından sonra Salmonella üremesini gözle görebilmek için çeşitli besi yerlerine ekim yapılmaktadır. Bu besi yerlerinde Salmonella etkenlerine
ait koloniler belirleyici özellikleri ile diğer etkenlerden ayrılmaktadır. Ayırıcı besi yerlerinde kullanılan
bu belirleyici özellikler özellikle Salmonella etkenlerini laktoz şekerini fermente edememeleri ve hidrojen sülfür üretimleri esasına dayanmaktadır (20).
Ayırıcı olarak kullanılan besi yerleri Brillant
Green Phenol Red Agar, XLD Agar, XLT4 Agar,
McConkey Agar, Bizmut Sülfid Agar, Salmonella
Shigella Agar, Rambach Agar ve Hectoen Enterik
Agar’dır. (31, 34). XLD Agar, XLT4 Agar, Bizmut
Sülfid Agar, Hectoen Enterik Agar hidrojen sülfür
(H2S) oluşturma prensibiyle hazırlanmış besi yerleridir (7). Brillant Green Phenol Red Agar, MacConkey Agar, Salmonella Shigella Agar ise laktoz
içermekte ve laktoz fermentasyonu prensibine dayanmaktadır. Rambach Agar’ın bileşiminde ise
propilen glikol bulunmaktadır. Salmonella etkenleri, besi yeri bileşimindeki propilen glikol’den asit
oluştururlar ve koloni renginin kırmızı olmasıyla
diğer etkenlerden ayırt edilirler (7).
41
ISO 6579:2002 standardında önerilen agarlar
XLD Agar ve Brillant Green Phenol Red Agardır.
Ekim yapıldıktan sonra agarlar 37°C’de 18-24 saat
inkübe edilir. İnkübasyon sonunda Salmonella etkenleri XLD Agar’da siyah merkezli kırmızı koloniler halinde, Brillant Green Phenol Red Agar’da
pembe koloniler halinde üreme gösterirler (3).
d) Biyokimyasal Testler: Ayırıcı besi yerlerinde
üremiş olan Salmonella şüpheli kolonilerden identifikasyon amacıyla çeşitli biyokimyasal testler yapılmaktadır. Bu testler laktoz, sükroz, glikoz fermentasyon testleri, lizin dekarboksilasyon testi, üre testi, Metil red/Voges Preskauer testi, hidrojen sülfür
testi, indol testidir (Tablo 1) (3). Tüm bu testler ISO
6579:2002 standardında belirtilen testlerdir.
Tablo 1: Salmonella etkenlerinin biyokimyasal özellikleri (3, 20, 21, 27, 28).
Test
Gram Boyama
Katalaz
Oksidaz
Laktoz
Sükroz
Glikoz
O/F
H2S
Gaz
İndol
Üre
Lizin Dekarboksilaz
Sitrat
Metil Red
Voges-Proskauer
Özellik
+
+
Fermentatif
+
+
+
+
+
-
e) Serolojik doğrulama: Biyokimyasal testler sonucunda Salmonella olarak identifiye edilen suşlar
serolojik olarak doğrulanmalıdır. Serolojik doğrulama için, hücre duvarı polisakkait antijenlerinden
hazırlanmış spesifik ‘O’, flagella antijenlerinden hazırlanmış ‘H’, ve yüzey antijenlerinden hazırlanmış
‘Vi’ antiserumlar ile serolojik teste tabi tutulurlar
(20,26). Bunun için, agarda üretilmiş olan etkenlere
antiserumlarla lam aglütinasyon testi uygulanır (14,
20, 26).
42
II- Moleküler Yöntemler
Konvansiyonel yöntemlerin çok uzun sürmesi nedeniyle Salmonella etkenlerinin teşhisinde çeşitli
moleküler yöntemler kullanılmaktadır. Moleküler
yöntemler kısa sürede sonuç vermeleri yönünden
avantaj sağlamaktadırlar (25). Dışkı gibi klinik örneklerden Salmonella etkenlerinin hızlı ve güvenilir
teşhisi hastalık kontrolüne yardımcı olmaktadır (30,
32). Bu teknikler erken teşhis amacıyla kullanılmaktadır ve klinik örneklerde pozitiflik saptanması
durumunda etken izolasyonu gereklidir.
İnsan, hayvan ve gıda örneklerinden Salmonella teşhisi için PCR metodları ve DNA ekstraksiyonu
prosedürleri tanımlanmıştır (17). PCR yöntemlerinin Salmonella etkenleri cins ya da alt tür düzeyinde teşhisine göre Salmonella etkenlerine ait hedef
genler değişmektedir. Genellikle kullanılan genler
arasında iroB, invA, fliC, ompA, iagAB, agfA, oriC,
16S rRNA ve 16S rDNA bulunmaktadır (13, 24).
InvA, salmonella genusuna spesifik bir özelliktedir. Salmonella etkenlerinin 2 türü olan
S.enterica ve S.bongori’yi saptamaktadır. IroB ve
iagAB, S.enterica alt türlerini saptamaktadırlar.
sefA, S.Enteritidis, S.Pullorum ve S.Gallinarum’u
teşhis etmek için kullanılmaktadır. fliC ise
S.Typhimurium’u spesifik olarak teşhis etmektedir
(13).
Ayrıca prob hibridizasyonu, pulsed field gel
electroforsis (PFGE), polimorfik DNA’nın rastgele amplifikasyonu (RAPD-PZR), DNA dizi analizi
(DNA sequencing), AFLP (amplified fragment length polymorphism), VNTR (variable number tandem repeat), SNP (single nucleotide polymorphism)
ve DNA Mikrodizilimi (DNA Microarray) gibi teknikler Salmonellaların moleküler tiplendirilmesi
ve moleküler epidemiyolojisinde kullanılmaktadır
(31).
Sonuç
Kanatlı hayvanlarda özellikle ekonomik kayıplara neden olan ve insanlarda gıda zehirlenmelerine
neden olan Salmonella infeksiyonlarının laboratuar teşhisi büyük öneme sahiptir. Konvansiyonel
yöntemlerin etken izolasyonu ve identifikasyonunu
kapsadığından dolayı güvenilir bir yöntemdir ve
standart tekniktir. Moleküler yöntemler, özellikle
PCR, izole edilen etkenlerden doğrulama amacıyla yapılmasının yanında özellikle dışkı gibi klinik
materyallerden de kısa sürede doğru teşhis yapabilmesi nedeniyle büyük avantajlar sağlamaktadır. Bu
sebeple, konvansiyonel yöntemlerle birlikte PCR
yönteminin bir arada kullanılması sonuç ve süre
açısından daha güvenilir ve kısa olmaktadır.
Kaynaklar
1. Adelina HS, Marianne C, Sophie LB, Françoise L, Isabelle P, Sandra R, Virginie M, Phillippe F, Nicolas R,
(2009). Risk factors of Salmonella enterica subs. enterica
contamination in 519 French laying hen floks at the end of
the laying period. Prev Vet Med. 89, 51- 58.
2. Anonim, (2009). Brolier (ticari etlik) kümeslerinde salmonella kontrol programı uygulama talimatı. Hukuki Dayanak: 29.04.2009 tarih ve 015125 sayılı Koruma ve Kontrol
Genel Müdürlüğü Yazısı.
3. Anonim, Horizontal method for the detection of Salmonella
spp. ISO 6579: 2002.
4. Anonim, (2004). İhbarı mecburi hastalıklar hakkında tebliğ.
Resmi gazete: 25420 Tebliğ No: 2004/14.
5. Anonim, (1967). Kanatlıların pullorum ve gallinarum hastalığı yönetmeliği. Resmi Gazete: 669/68124.
6. Anonim, (2007). Kuluçkahane ve damızlık kanatlı işletmeleri yönetmeliği uygulama talimatı. Tarih ve No: 30.11.2007/
43.
7. Anonim, (2011). Salmonella. Erişim adresi: http://www.
mikrobiyoloji.org, Erişim tarihi: 10.06.2009.
8. Anonim, (2009). Ticari yumurtacı kümeslerinde Salmonella kontrol programı uygulama talimatı. Hukuki Dayanak:
29.04.2009 tarih ve 015125 sayılı Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü Yazısı.
9. Anonim, (2006). Türk gıda kodeksi çiğ kanatlı eti ve hazırlanmış kantalı eti karışımları tebliği. Tebliğ No: 2006/29.
10. Anonim, (2000). Türk gıda kodeksi yumurta ve yumurta
ürünleri tebliği. Tebliğ No: 2000/11.
11. Antunes P, Reu C, Sousa JC, Peixe L, Pestana N, (2003).
Incidence of Salmonella from poultry products and their
susceptability to antimicrobial agents. Int J Food Microbiol. 87, 97- 103.
12. Barrow PA, (2007). Salmonella infections: immun and ionimmun protection with vaccines. Avian Pathol. 36, 1- 13.
13. Bäumler AJ, Heffron F, Reissbrodt R, (1997). Rapid
Detection of Salmonella enterica with primers specific for
iroB. J Clin Microbiol. 35, 1224-1230.
14. Bilgehan H, (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Barış Yayınları, İzmir.
15. Brenner FW, Villar RG, Angulo FJ, Tauxe R, Swaminathan B, (2000). Salmonella nomenclature. J Clin Microbiol. 38, 2465- 2667.
16. Cox NA, Berrang ME, Cason JA, (2000). Salmonella
penetration of egg shells and proliferation in broiler hatching eggs. Poult Sci. 79, 1571- 1574.
17. Çarlı KT, Ünal CB, Caner V, Eyigör A, (2001). Detection
of chicken feces by a combination of tetrathionate broth enrichment, capillary pcr, and capillary gel electrophhoresis.
J Clin Microbiol. 39,1871-1876.
18. Dunkley KD, Callaway TR, Chalova VI, McReynolds
JL, Hume M, Dunkley CS, Kubene LF, Nisbet DJ, Ricke
SC, (2009). Foodborne Salmonella ecology ın the avian
gastrointestinal tract. Anarobe. 15, 26- 35.
19. İzgür M. (2010). Kanatlı Salmonella enfeksiyonlarının epidemiyolojisi. Turkiye Klinikleri J Vet Sci. 1(2), 61-68.
20. İzgür M. (2002). Salmonella İnfeksiyonları. İzgür M, Akan
M. Eds. Kanatlı Hayvan Hastalıkları. Medisan Yayınevi,
Ankara. s. 41-53.
21. Koneman E, Washington WJ, Allen S, Janda W, Procop
G, Schreckenberger P, Woods G, (2006). Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Sixth
Edition. Chapter 6. p. 211
22. Liu GR, Rahn A, Liu WQ, Sanderson KE, Johnston RN,
Liu SL, (2002). The evolving genome of Salmoenlla enterica serovar Pullorum. J Bacteriol. 184, 2626- 2633.
23. Maciorowski K.G, Herrera P, Jones FT, Pillai SD, Ricke
SC, (2006). Cultural and ımmunological detection methods
for Salmonella spp. in animal feeds. Vet Res Commun. 30,
127- 137.
24. Oliveira SD, Rodenbusch CR, Cé MC, Rocha SLS,
Canal CW, (2003). Evaluation of selective and nonselectiveenrichment PCR procedures for Salmonella detection.
Lett Appl Microbiol. 36, 217-221.
25. Olivieria SD, Santos LR, Schuch DMT, Silva AB, Salle
CTP, Canal CW, (2002). Detection and ıdentification of
Salmonellas from poultry- related samples by PCR. Vet Microbiol. 87, 25- 35.
26. Quinn PJ, Carter ME, Markey BK, Carter GR, (1994).
Clinical Veterinary Microbiology. Mosby Year Book Europe Limited.
43
27. Quinn PJ, Markey BK, (2003). Concise Review of Veterinary Microbiology. Blackwell Publishing Ltd.
28. Quinn PJ, Markey BK, Carter ME, Donnelly WJ, Leonard FC, (2004). Veterinary Microbiology and Microbial
Disease. India Replica Press Ptv. Ltd, Kundli. Enterobacteriaceae. p: 106
29. Rabsch W, Andrews HL, Kingsley RA, Prager R,
Tschape H, Adams LG, Baumler A, (2002). Salmonella
enterica serotype Typhimurium and ıts host- adapted variants. Infect Immun. 70, 2249- 2255.
30. Riyaz- Ul- Hassan S, Verma V, Qazi GN, (2004). Rapid
detection of Salmonella by polymerase chain reaction. Mol
Cell Probes. 18, 333- 339.
31. Sareyyüpoğlu B, (2010). Kanatlı Salmonella enfeksiyonlarının konvansiyonel ve moleküler yöntemlerle teşhisi. Turkiye Klinikleri J Vet Sci. 1(2), 69- 79.
32. Sareyyüboğlu B, Çelik Ok A, Cantekin Z, Yardımcı H,
Akan M, Akçay A, (2008). Polimerase chain reaction detection of salmonella spp. ın faecal samples of pets birds.
Avian Dis. 52, 163- 167.
33. Su LH, Chiu CH, (2007). Salmonella: clinical ımportance
and evolution of nomenclature. Chang Gung Med J. 30 (3),
210-219.
34. Türkyılmaz S, Savaşan S, Kırkan Ş, Kaya O, (2007).
Tavuklarda Salmonella enteritidis infeksiyonlarının bakteriyolojik ve serolojik yöntemlerle teşhisi. İstanbul Üniv Vet
Fak Derg. 33, 23- 33.
35. Uyttendaele MR, Debevere JM, Lips RM, Neyts KD,
(1998). Prevalance of Salmonella ın poultry carcasses and
their products ın belgium. Int J Food Microbiol. 40, 1- 8.
36. Yoshikawa TT, Herbert P, Oill PA, (1980). Salmonellosis.
West J Med. 133, 408-417.
44
45
46

Cilt/Volume 22 Sayı/Number 1 2011 2011_1

Transkript

Benzer belgeler

21 Number: 1 2010 2010_1

Salmonella

22 Number: 2 2011 2011_2

23 Number: 1 2012 2012.1

Aşı: Tüm Hikayesi

Etlik-c24s1 - Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlükleri

Volume 25 Number 1 2014 - Veteriner Kontrol Enstitüsü

2012-2 - Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlükleri

Volume 25 Number 2 2015 - Veteriner Kontrol Enstitüsü

www.ferhathoca.com

Kongre Programı - Kafkas Üniversitesi 7. Uluslararası Katılımlı

Oturum Programı

Prospektüs Sadece Hayvan Sağlığında Kullanılır VETFOS

Polioda Güncel Durum - 3.BAHAR PEDİATRİ GÜNLERİ

18 Number: 1-2 2007 2007

Sarı Humma - the NSW Multicultural Health Communication Service